Name: spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice
Uploaded: 2017-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice at JoVE.com

Yazarların onayları yok.

Bu prosedürdeki hayvanlara bakım ve tedavi, Colorado Üniversitesi&#39;ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi&#39;nin kurallarına uygun olarak yürütülmüştür. 1. Çözüm Hazırlama <ol><li> Tüm çözeltileri, Tablo 1&#39;de gösterildiği gibi uygun sıcaklıklarda hazırlayın ve saklayın. </li></ol> 2. Kaplama Kuyuları ve Slaytlar NOT: Nöronlar plastik veya cam yüzeylere iyi yapışmamaktadır. <ol><li> Nöronların izolasyonundan bir gün önce steril 24-çukurlu bir kültür plakasının kuyularını 0.5 mL Poly-D-Lysine (PDL, Tablo 2 ) ile kaplayın ve O / N&#39;lik bir laminer akış kapağında bırakın. NOT: Tercih edilen yöntem, 24 delikli plakalar kullanmak ve yalnızca çevre kuyularını kaplamaktır, zira periferik kuyulardan buharlaşma daha hızlanmaya ve tutarsız sonuçlara neden olma eğilimindedir. Ek olarak, cam slaytlar kuyulardan önce yerleştirilebilirO kaplama. Nöronlar kaplanmış cam slaytlara tutturulacak ve daha ileri mikroskobik görüntüleme için daha sonra çıkarılabilecektir . </li><li> İzolasyon gününde PDL&#39;yi kuyulardan çıkarın. Kalan suyu çıkarmadan ve 1 saat boyunca kurumaya bırakmadan önce steril suyla birkaç dakika yıkayın (aşağıya bakınız). </li><li> Kurumadan sonra, slaytları laminin ile kaplayın ( Tablo 2 ). NOT: Yaklaşık olarak 10 μL laminin (10 μg / μL) steril 24 gözlü plakanın her bir kuyusunun kaplanması için yeterlidir. Bu, 340 ul&#39;lik ortamla (toplam hacim: 350 | iL) karıştırılır ve böylece tüm kuyu kaplanır. Bir kültür kaputunda oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve daha sonra hücreleri kaplamadan önce aspire edin. </li></ol> 3. Omurga Kordonlarının Hasat Edilmesi NOT: Bütün cihazlar sterilizasyon için otoklavda (135 ° C ve 30 psi 4 x 7 dakika çevrim) yapılmalıdır. <ol><li> 1-3 yaşındaki C57BL / 6 fare yavrularını isofluran içeren bir odasında euthanize edin. BekleyinHareketsizlikten 30 saniye sonra ve yanıt eksikliğini teyit etmek için bacağınızı sıkıştırın. </li><li> Başı makas kullanarak vücudundan ayırın, yavru eğilimli konumdadır. </li><li> Arka bacakları veya kuyruk ve kolları dorsal yüzü kullanıcıya bakacak şekilde prosedür masasında sabitleyin. </li><li> Kıvrımlı iris makası kullanarak cildi kesin. </li><li> Omurganın kalçanın hemen üstündeki omurilik bölgesinden kesin ve vücudunuzdan ayırmak için göğüs kafesinin her iki tarafını kesmeye devam edin. NOT: Bu, organların istem dışı hasar görmesini önlemek için omuriliğin visseral organlardan dikkatli bir şekilde parçalanmasını gerektirir ( Şekil 1a ). </li><li> Fazla doku kaldırmak için 5 mL 0.2 μm filtre sterilize Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içeren 3 x 10 cm Petri kaplarında 10 s boyunca sırayla yıkayın. </li><li> Spinal kolonun kaudal ucuna 5 mL&#39;lik filtre ile sterilize edilmiş PBS ile dolu 22 G&#39;lik bir iğne ve şırınga yerleştirin ve kranial olarak yıkayın, böylece kordonunO dördüncü bir Petri kabına çıkın ( Şekil 1b ). </li><li> Buz üzerinde 5 mL HABG ( Tablo 1 ) ile 15 mL tüp içinde omurilik toplamak. Omurganın ezilmesini önlemek için dikkatli olun. </li><li> Çöp kutusundaki her yavru için 3.1-3.8 arasındaki adımları tekrarlayın. NOT: İdeal olarak, sağlıklı nöron izolasyonu sağlamak için bu işlem omurilikte 30 dakikadan az sürmelidir. </li></ol> 4. İzole Edici Nöronlar NOT: Aşağıdaki adım laminer bir akış davlumbazında yapılmalıdır. Temel steril teknik hakkında bilgi sahibi olması beklenir. <ol><li> Doku Mincing <ol><li> Omurilik kordonlarını içeren tüpü alın ve dokuyu askıya almak için hafifçe sallayın. </li><li> Tüpteki dokuları 60 mm&#39;lik bir cam Petri kabına dökün ve ~ 0.5 mm boyutlarında ince parçalar oluşturmak için tıraş bıçağı ile zar atın. </li><li> 5 mL HABG içeren 15 mL&#39;lik bir tüp içine geniş çaplı bir pipetle dokuyu aktarın. </li><li> Koyun birHücrelerin bu sıcaklıkta dengelenmesine izin vermek için 30 ° C su banyosu. Hücreleri, sıvı içinde asılı kalmalarını sağlayacak kadar çalkalayıcıda tutun. NOT: Bu adım, buzun sindirim ortamına aktarılması üzerine hücrelerin şok edilmesini önlemek için yapılır. Hücreleri 30 ° C&#39;de tutmak, 37 ° C&#39;de aksi halde artmış bir metabolizma ile ilişkili hücre ölümünü azaltmaya yardımcı olur. </li></ol></li><li> Sindirim ortamını hazırlayın ( Tablo 1 ). </li><li> Yoğunluk gradyanını hazırlayın (Tablo 1). <ol><li> Tablo 1&#39;de özetlendiği gibi, 4 tabakanın her birini 4 ayrı 15 mL&#39;lik tüp içinde hazırlayın. </li><li> Her katmandan yeni bir 15 mL tüp içine 1 mL ekleyin. Alt katman 1 ile başlayın ve üst katman 4&#39;e ulaşana kadar ard arda ekleyin. Eklerken katmanları rahatsız etmeyin. </li></ol></li><li> Adım 2.2 PDL kaplı plakaları yıkayın. Kalan suyunu çıkarmadan önce steril su ile birkaç dakika yıkayın ve1 saat kurumalarını bekleyin. </li><li> Sindirim ortamına doku aktarın. <ol><li> 30 ° C&#39;de çalkalayıcı su banyosundan doku içeren tüpü çıkartın ve birkaç dakika yerleşmesine izin verin. </li><li> Sindirim ortamı tüpünü 37 ° C su banyosundan çıkarıp bir leur-lock şırınga içine aspire edin. </li><li> Fazla HABG&#39;yi doku içeren tüpün içinden aspire edin. </li><li> Doku içeren tüp içine sindirim ortamı eklemek için şırınga üzerine 0.2 um&#39;lik bir filtre kullanın. </li><li> Tüp, 30 ° C&#39;lik bir su banyosuna 30 dakika boyunca yerleştirilir. Hücreleri, sıvı içinde asılı kalmalarını sağlamak için yeterince çalkalamayın. NOT: Sindirim ortamındaki hücreleri çok uzun süre tutmamak veya sıcaklığın aşırı yükselmesine izin vermek, aşırı sindirime neden olabilmek ve dokunun jelatinimsi bir karışımda süspanse edilmesine neden olmak önemlidir. </li></ol></li><li> Bu süre zarfında, adım 2.3&#39;deki gibi lamininini kaplayın. </li> &lt;Li&gt; Öğütme yapın ( örn . Hücreleri dokudan ayırma). <ol><li> Tüpü çalkalayan 30 ° C su banyosundan çıkarıp birkaç dakika yerleşmesine izin verin. </li><li> Aşırı sindirim ortamını aspire. </li><li> 2 mL HABG&#39;de dokuyu askıya alınız. </li><li> Dar gözlü bir pipet kullanarak, 45 s boyunca 10x öğüt. NOT: Bu muhtemelen en önemli tek adımdır ve düzgün yapılmazsa verimi önemli ölçüde düşürebilir. <ol><li> Doku pipet içine aspire ve içeriğini hemen boşaltın. </li><li> Havayı sunmaktan kaçının; çünkü canlı verimi önemli ölçüde düşürecektir. NOT: İdeal pipet 9 inçlik bir cam pipettir Pipetin ucu pürüzlü yüzeyleri düzeltmek için ateşle cilalanmalıdır Daha sonra 1: 20 kloroformda diklorodimetilsilan (DMDCS) solüsyonu içine yerleştirilerek silikon hale getirilmeli ve kloroformda / N Sonra pipet çıkarılmalı ve hava kurumasına bırakılmalıdır.Sterilizasyon için otoklav yapılmalıdır. Dikkat: DMDCS ve kloroform oldukça yanıcıdır ve silikonlama bir duman davlumbazında yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Süpernatanın üst 2 mL&#39;sini aspire edin ve &quot;koleksiyon&quot; etiketli yeni bir 15 mL tüp içine yerleştirin. </li><li> 4.7.3-4.7.5 adımlarını iki kez tekrarlayın (hücre toplama tüpünün sonunda 6 mL olmalıdır). </li><li> Gradyan bozulmasından kaçınarak, toplama tüpünün içeriğini adım 4.2&#39;de hazırlanan gradyan tüpüne yavaşça aktarın. </li></ol></li><li> Bu noktada, buzdolabından önceden hazırlanmış nörobazal ortamı ( Tablo 1 ) çıkarın ve 37 ° C&#39;lik bir banyoda ısıtmasına izin verin. </li><li> Nöronları arındırın. <ol><li> Degrade tüpü, 800 xg ve 22 ° C&#39;de 15 dakika santrifüjleyin. </li><li> İstenen tabakayı bir pipetle toplayın ( Şekil 2 ) ve yeni bir 15 mL&#39;lik tüp içine yerleştirin. En saflıklı nöro içinN izolasyonu ( yani &gt;% 90), katman 3 toplamak. Daha az saflık ( yani &gt;% 70-80) olan daha fazla verim için katmanları 2 ve 3 toplamak. </li><li> Yeni toplanan tabakalara 5 mL HABG ekleyerek yoğunluk gradyanını inceltin. </li><li> 22 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 200 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın, 5 mL HABG&#39;de tekrar süspanse edin ve hücreleri askıya almak için pelletini oynatın. </li><li> 22 ° C&#39;de 2 dakika 200 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın, 3 mL nörobazal ortamda tekrar süspansiyon haline getirin ve hücreleri tekrar süspansiyon haline getirmek için pelletini oynatın. </li></ol></li><li> Hücreleri sayın. <ol><li> Şimdi nörobazal ortamda hücrelerle 10 mcL solüsyon alın ve 10 mcL Tripan mavisi ile karıştırın. </li><li> Bu karışımın 10 mcL&#39;sini cam sayım odacığına yerleştirin. </li><li> Standart bir cam sayım odası kullanarak, dört dörtlü kadranın her birindeki hücre sayısını hesaplayın. Sayılan tüm hücreleri ekleyin (n), çoklu(Seyreltme faktörü) çarpın, 4&#39;e bölün (sayılan kadrandaki sayı), 3 ile çarpın (hücre hacmi / mL cinsinden hücre konsantrasyonu elde etmek için 104 ile çarpın. <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> Kültür plakalarının üzerindeki hücreleri tohumluyor <ol><li> Hücre süspansiyonunu 1 mL nörobazal ortamda 300.000 hücreye seyreltin. NOT: Yukarıdaki adımlarda elde edilen hücrelerin konsantrasyonuna dayanarak, nihai konsantrasyon 3 x 105 hücre / mL elde etmek için ilave nörobazal ortam ilave edilir. Denklem C 1 V 1 = C 2 V 2 , burada C 1 hasattan elde edilen hücrelerin başlangıç ​​konsantrasyonudur; V 1 , 3 mL; Ve C2 yukarıda tarif edildiği gibi 3 x 105 hücre / mL&#39;dir. Denklem V2 için çözülmüştür. Çözeltideki toplam hücre hacminin eşit olması için gerekli nevrobazal hacim birimini ekleyinV 2 . </li><li> Hücrelerin çözeltiye dağıtılması için hafifçe çalkalayın ve kaplanmış 24 delikli tabakların her kuyucuğuna 1 mL ekleyin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Qayumi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+for+investigation+of+spinal+cord+injury+caused+by+aortic+cross-clamping.">Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping.</a> J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).</li><li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption.">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li><li>Taira, Y., Marsala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+proximal+arterial+perfusion+pressure+on+function,+spinal+cord+blood+flow,+and+histopathologic+changes+after+increasing+intervals+of+aortic+occlusion+in+the+rat.">Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat.</a> Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocols+for+the+simultaneous+preparation+of+primary+neuronal+cultures+of+the+neocortex,+hippocampus+and+cerebellum+from+individual+newborn+(P0.+5)+C57Bl/6J+mice.">Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice.</a> J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Graber, D. J., Harris, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+culture+of+spinal+motor+neurons+from+rat+embryos.">Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).</li><li>Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+motor+neurons+from+the+newborn+mouse+spinal+cord.">Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord.</a> Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).</li><li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons,+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord.">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li><li>Brewer, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li><li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption.">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li><li>Su, M., Zhong, W., Ren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+protection+of+reseveratrol+against+spinal+cord+ischemic-reperfusion+injury+in+rats.">Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats.</a> Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).</li><li>Haapanen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+ischemic+preconditioning+protects+the+spinal+cord+against+ischemic+insult:+An+experimental+study+in+a+porcine+model.">Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).</li><li>Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+complications+after+thoracic+aortic+surgery:+long-term+survival+and+functional+status+varies+with+deficit+severity.">Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity.</a> J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).</li><li>Wong, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+spinal+cord+deficits+after+thoracoabdominal+aortic+aneurysm+repair.">Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair.</a> Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).</li><li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-2+agonist+attenuates+ischemic+injury+in+spinal+cord+neurons.">Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons.</a> J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).</li><li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+protection+via+alpha-2+agonist-mediated+increase+in+glial+cell-line-derived+neurotrophic+factor.">Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklamaları yok.

Bu teknik, omurilik nöronlarının güvenilir bir şekilde kültürlenmesine izin verir. Teknik yeterlilik elde edildiğinde, tamamlanması yaklaşık 3,5 saat sürer. Nöronların izolasyonunu, yaklaşık 4 saat içinde 2 ayrı çöpten (toplam 16 fare) gerçekleştirebildik. Fizibilitedeki ana adım, omurilik kablolarını farelerden ayıklamaktır. Verim, çeşitli kuyucukların kaplanmasına ve çeşitli koşullar altında nöronların test edilmesine imkan verir. Olgunlaşma sonrasındaki nöronları tedavi edebil...

<html> Spinal kord patolojisini anlamak, makroskopik ve mikroskobik seviyelerde çeşitli modellerin kullanılmasını gerektirir. Büyük ve küçük hayvan modelleri 1 , 2 , 3 spinal kord hastalığının ve yaralanmasının in vivo araştırmalarında kullanılır. Bu sorunların in vivo incelenmesi esastır ancak omurilik analizi, tüm omurilik homojenatı veya doku kesitleri 4 ile sınırlıdır. Bu, var olan nöronlar ve çevresindeki glialar arasında omurilikteki spesifik tepkileri ve hedefleri ayırmaya çalışırken bazı belirsizlik yaratır. Genetik olarak manipüle edilmiş farelerin artan miktarda bulunması, biyolojinin hücresel ve moleküler seviyelerde daha ayrıntılı araştırılmasına olanak tanır. Böylece, in vitro omurilik nöronlarının benzersiz özelliklerini ve biyolojisini incelemek için, burada neonatal bir fare modeli kullanılır. In vitro olarak nöronların izolasyonu ve bakımı özellikle net değildir Yetişkin kemirgenlerin korteks dokusundan nöron tecrit teknikleriyle nispeten bol miktarda izole nöron ( yani milyonlarca) elde edilmesi beklenir , 6 , 7. Bunun aksine, omurilik dokusundan alınan nöronların verimi, daha az doku kütlesi nedeniyle kısmen 8 , 9 , 10&#39;dur . Ayrıca, farelerde, yenidoğanın izolasyonu için teknikler göreceli olarak az sayıdadır Omurilik nöronları ve mevcut yöntemler, daha düşük nöron verimleri (yüzlerce) veya embriyonik farelerin izolasyonunu gerektiren zahmetli ve ağır kaynaklı tekniklerle sınırlıdır 10 . Bu protokolde,Yenidoğan farelerinin spinal kordlarından önemli miktarda nöronun maliyet ve kaynak etkili bir şekilde izole edilmesini sağlayan bir teknik kullanın. Daha önce yayınlanan tekniklerde yaygın olarak görüldüğü gibi papain enzimatik bir proteaz olarak kullanılmaktadır ve 5 , 6 omurilik dokusundan nöronların salınmasına izin vermektedir. Ek olarak, rafine edilmiş hücre ayrıştırması için daha önce etkili olduğu 6,10 olduğu gösterilen yoğunluk derecesini kullanıyoruz. Hücrelerin inkübe edildiği ortam tecrübemiz ve daha önce yayınlanan 11&#39;de farklılık gösterse de, taze B27 kültürü takviyesi takviyesi, nöron ömrü için kritik olduğu kanıtlanmıştır. Nöronlar, tipik olarak, tedavinin yapılmasına olanak tanıyan 10 gün boyunca uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Hibernate A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td><td>Brainbits</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr><tr><td>Glutamax 100X - 100 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td></tr><tr><td>B27 Supplement 50X - 10 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td></tr><tr><td>Papain, Lyophilized - 100 mg</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>Neurobasal A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Mouse Laminin - 1 mg</td><td>Thermo-Fisher</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>Trypan Blue - 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440272-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306-1L</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Glass Pippette - 9&quot;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-678-20C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Pipette bulb - 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>BRAND&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;Petri dish, glass - 60 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Sterile 24-Well Cell Culture Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-671-6</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td></tr><tr><td>Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td></tr><tr><td>NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice

Spinal kord nöronlarının izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunmaktayız. Nöronlar yenidoğan C57BL / 6 farelerinden elde edilir ve 1-3 doğum sonrası izole edilir. Bir fare çöpü, genellikle bir üreme çiftinden doğan 4-10 yavru, bir deney için toplanır ve izofluran ile ötenazi yapıldıktan sonra omurilik kordları her fareden ayrı ayrı toplanır. Spinal kol disseke edilir ve omurilik o kolondan salınır. Omurga kordonları nöronların ve diğer hücrelerin dokudan salınmasına izin veren bir enzimatik proteaz için teslimat yüzey alanını arttırmak üzere kıyılır. Tritürasyon daha sonra hücreleri çözeltiye boşaltmak için kullanılır. Bu çözelti, daha sonra, nöronların izole edilmesine olanak tanıyan, çözeltideki çeşitli hücreleri ayırmak için bir yoğunluk derecesinde fraksiyon haline getirilir. Bir çöp grubundan yaklaşık 1-2.5 x 106 nöron izole edilebilir. Nöronlar daha sonra yapışkanlı fiillerle kaplanmış oyukların üzerine serilirUygun gelişme ve olgunlaşma için izin verilen rs. Nöronlar büyüme ve kültür ortamında olgunluğa erişmek için yaklaşık 7 gün alır ve bundan sonra tedavi ve analiz için kullanılabilir.

Bu tekniği kullanarak, tek bir çöp (4-10 yavru), kültür plakalarına eklenmeye uygun 1-2.5-106 nöronların izolasyonuna olanak tanır. Tipik olarak, 4-8 oyuk yukarıda belirtilen konsantrasyonda tohumlanır ( yani 300.000 hücre / mL). Şekil 3 , düşük ( a ) ve yüksek ( b ) büyütme ışık mikroskopisinde kültürde bir hafta sonra nöronların bu konsantrasyonda görünüşünü göstermektedir. Bununla...

Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice at JoVE.com

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

spinal-cord-neurons-isolation-and-culture-from-neonatal-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Görüntüleme.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir. 

Video: Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Nörobilim

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biyoloji

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Prenatal Islmn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Enfeksiyon ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Embriyonik Fare Beyni Karışık Hücre Kültürleri

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

Yazar Spotlight: Enfeksiyon ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Embriyonik Fare Beyinlerinden Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürlerinin Kurulması  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Yetişkin Fare Omuriliğinden Astrositlerin ve Mikroglia'nın Verimli Ekstraksiyonu

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Yazar Spotlight: Yetişkin Fare Omuriliğinden Glial Hücrelerin İzolasyonu 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Omurilik Elektrofizyoloji

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Prenatal Isl^mn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu