Name: spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice
Uploaded: 2017-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
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著者には謝辞はありません。

この手技における動物のケアおよび治療は、コロラド大学の動物実験および使用委員会のガイドラインに従って行われた。 1.ソリューションの準備<ol><li> 表1に示すように、すべての溶液を適切な温度で調製して保管します。 </li></ol> 2.コーティングウェルとスライド注：ニューロンはプラスチックやガラスの表面には接着しません。 <ol><li>ニューロンの単離の1日前に、無菌の24ウェル培養プレートのウェルを0.5mLのPoly-D-Lysine（PDL; 表2 ）でコーティングし、それを層流フードO / Nに残す。 注：好ましい方法は、周辺ウェルからの蒸発がより加速され、一貫性のない結果につながる傾向があるため、24ウェルプレートを使用し、中心ウェルのみをコートすることである。さらに、ガラススライドはウェルの前に配置することができますoコーティング。ニューロンは、コーティングされたガラススライドに付着し、後でさらなる顕微鏡画像化のために除去することができる。 </li><li>分離の日に、ウェルからPDLを除去する。残りの水を取り除いて1時間乾燥させる前に、滅菌水で数分間洗ってください（下記参照）。 </li><li>乾燥後、スライドをラミニンで被覆する（ 表2 ）。 注：約10μLのラミニン（10μg/μL）で滅菌24ウェルプレートの各ウェルをコートできます。これは、ウェル全体を覆うために340μLの培地（総容量：350μL）と混合する。これを培養フード内で室温で2時間放置し、次に細胞をコーティングする前に吸引する。 </li></ol> 3.脊髄を収穫する注：すべての機器は、滅菌のためにオートクレーブ（135°Cおよび30 psi、4 x 7 minサイクル）する必要があります。 <ol><li>イソフルランを含むチャンバー内で1〜3日齢のC57BL / 6マウスを安楽死させる。待つ30秒後に動きが止まり、脚をつまんで応答がないことを確認します。 </li><li>ハサミを使って体から頭を離し、腹を立てやすい位置にします。 </li><li>背側を使用者に向けて、手順表の後足または尾と腕を安定させる。 </li><li>湾曲したアイリスはさみを使用して皮膚を切ってください。 </li><li>腰部の腰部から脊髄を切断し、胸部の両側を切断して体から分離させます。 注：これは、他の臓器（ 図1a ）への偶発的な損傷を避けるために内臓からの脊髄の注意深い解離を必要とする。 </li><li>余分な組織を除去するために0.2μmのフィルターで滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）5 mLを含む3 x 10 cmのペトリ皿で10秒間連続して洗浄します。 </li><li>脊柱の尾端にフィルター滅菌したPBS5mLを充填した22Gの針とシリンジを挿入し、経頭蓋に流し、コードto第4ペトリ皿に出る（ 図1b ）。 </li><li>氷上で5 mLのHABG（ 表1 ）を含む15 mLチューブに脊髄を採取する。脊髄を粉砕しないように注意してください。 </li><li>リターの各子犬についてステップ3.1~3.8を繰り返す。 注：理想的には、健康なニューロンの分離を確実にするために、このプロセスは脊髄あたり30分未満かかる必要があります。 </li></ol> 4.分離ニューロン注：次のステップは、層流フードで実行する必要があります。基本的な滅菌技術に精通していることが期待される。 <ol><li> ティッシュミッシング <ol><li>脊髄を含むチューブを軽く振り、組織を懸濁させます。 </li><li>チューブから組織を60 mmのガラスペトリ皿に注ぎ、かみそりの刃でサイコロを振って、〜0.5 mmの大きさの細片を作ります。 </li><li>広口ピペットで組織をHABG 5 mLを含む15 mLチューブに移す。 </li><li>それを30℃の水浴中で30分間インキュベートし、細胞をこの温度で平衡化させた。細胞を振とう器の上に置いて、液体中に浮遊させておきます。 注：このステップは、氷から消化培地への移動時に細胞にショックを与えないようにするために行われます。細胞を30°Cに保つと、37℃での代謝の増加に関連した細胞死を減少させるのに役立ちます。 </li></ol></li><li>消化培地を調製する（ 表1 ）。 </li><li> 密度勾配を準備する（表1）。 <ol><li> 表1に示すように、4つの層を4つの別々の15 mLチューブで準備します。 </li><li>各層から1mLを新しい15mLチューブに加える。一番下のレイヤー1から始めて、上のレイヤー4に達するまで順次追加します。追加中にレイヤーを妨害しないでください。 </li></ol></li><li>ステップ2.2のPDL被覆プレートを洗浄する。残りの水を取り除く前に滅菌水で数分間洗ってください。それらを1時間乾燥させる。 </li><li> 組織を消化培地に移す。 <ol><li> 30℃のシェーカー水浴から組織含有チューブを取り出し、数分間静置する。 </li><li> 37℃の水槽から消化液チューブを取り出し、リールロックシリンジに吸引します。 </li><li>組織含有チューブから余分なHABGを吸引する。 </li><li>シリンジにleur-lock 0.2μmフィルターを使用して、消化液を組織含有チューブに加えます。 </li><li>チューブを30℃のウォーターバスに30分間置きます。細胞を流体中に浮遊させるのに十分なだけ振とうさせる。 注：消化培地に細胞を長時間入れすぎないようにしたり、温度が高くなりすぎて過度の消化を招き、組織がゼラチン状の混合物に浮遊することがないようにすることが重要です。 </li></ol></li><li>この期間中、ステップ2.3と同様にラミニンをコートする。 </li> &lt;粉砕を行う（ すなわち 、細胞を組織から分離する）。 <ol><li> 30℃の振とう水槽からチューブを取り出し、数分間静置する。 </li><li>過剰な消化培地を吸引する。 </li><li> 2mLのHABGに組織を懸濁する。 </li><li>ナローボアピペットを使用して、45分間10倍に粉砕します。 注：これはおそらく単一の最も重要なステップであり、正しく行われていないと収量を大幅に減少させる可能性があります。 <ol><li>組織をピペットに吸引し、直ちに内容物を戻す。 </li><li>空気を導入することは避けてください。生存可能な収率を大幅に低下させます。 注：ピペットは、9インチのガラスピペットで、ピペットの先端を磨いて粗い表面を滑らかにし、クロロホルム中のジクロロジメチルシラン（DMDCS）の1:20溶液中に置き、 / Nその後、ピペットを取り出して風乾させ、その後、滅菌のためにオートクレーブにかけなければならない。 注意：DMDCSとクロロホルムは可燃性が高く、シリコンゴムはフュームフードで使用してください。 </li></ol></li><li>上清の上2 mLを吸引し、「コレクション」と名付けられた新しい15 mLチューブに入れます。 </li><li> 4.7.3-4.7.5の手順をさらに2回繰り返します（細胞回収チューブは最後に6 mLになるはずです）。 </li><li>収集チューブの内容物をステップ4.2で準備したグラジエントチューブにゆっくり移し、グラジエントの混乱を避けます。 </li></ol></li><li>この時点で、冷蔵庫から前もって調製した神経根培地（ 表1 ）を取り出し、37℃の温浴中で温める。 </li><li> ニューロンを精製する。 <ol><li>グラジエントチューブを800 xgおよび22℃で15分間遠心します。 </li><li>ピペットで目的の層を集め（ 図2 ）、新しい15 mLチューブに入れます。最高純度のニューロ（ すなわち &gt; 90％）、層3を集める。純度がより低い（ すなわち &gt; 70-80％）より多くの収率を得るために、層2および3を集める。 </li><li>新たに収集した層に5mLのHABGを加えることによって密度勾配を希釈する。 </li><li> 22℃で2分間200 xgで遠心分離する。 </li><li>上清を捨て、5mLのHABGに再懸濁し、細胞を懸濁させるためにペレットを軽くたたきます。 </li><li> 22℃で200×gで2分間遠心分離する。 </li><li>上清を捨て、3mLの神経細胞培地に再懸濁し、細胞を再懸濁するためにペレットを軽くたたきます。 </li></ol></li><li> 細胞を数える。 <ol><li> 10μLの溶液を、今では神経細胞培地に入れ、10μLのトリパンブルーと混合する。 </li><li>この混合物10μLをガラス計数室に入れる。 </li><li>標準のガラス計数チャンバを使用して、4つの4×4象限のそれぞれの細胞の数を数えます。カウントされたすべてのセルを追加する（n）、マルチ（希釈係数）、4で割る（象限の数）、3倍（神経基底培地の体積）、および10 4を掛けて細胞/ mL中の細胞濃度を得る。 <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> 細胞を培養プレート上に播種する <ol><li>細胞懸濁液を1mLの神経細胞培地中の300,000個の細胞に希釈する。 注：上記のステップで得られた細胞の濃度に基づいて、3×10 5細胞/ mLの最終濃度を得るために、追加の神経基底培地を添加する。式はC 1 V 1 = C 2 V 2であり、ここでC 1は収穫から得られた細胞の初期濃度であり、 V 1は3mLである。上記のように、C 2は3×10 5細胞/ mLである。方程式はV 2について解かれる。溶液中の細胞の総容量を等しくするために必要な神経細胞培地の容量を加えるV 2である 。 </li><li>静かに振とうして溶液中の細胞を分散させ、コーティングした24ウェルプレートの各ウェルに1 mLを加える。 </li></ol></li></ol>

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著者には開示がない。

この技術は、脊髄ニューロンの信頼できる培養を可能にする。技能の習熟度が達成されると、完了するまでに約3.5時間かかります。我々は、約4時間で2匹の別個の同腹仔（合計16匹のマウス）からニューロンの単離を行うことができた。実行可能性の重要なステップは、マウスから脊髄を巧みに抽出することができることです。歩留まりは、いくつかのウェルをメッキすること、および様々な...

<html>脊髄の病理を理解するには、巨視的レベルと顕微鏡レベルの両方で、様々なモデルを使用する必要があります。大小の動物モデル1,2,3は 、脊髄疾患および傷害のインビボ研究のために使用される。 インビボでこれらの問題を研究することにはメリットがありますが、脊髄の解析は全脊髄ホモジネートまたは組織切片4に限定されます。これは、居住ニューロンおよび周囲グリアの間で脊髄における特定の応答および標的を分離しようとするときに、あいまいさを生じる。遺伝的に操作されたマウスの利用可能性の増加は、細胞レベルおよび分子レベルでの生物学のより詳細な調査を可能にする。したがって、ここでは新生仔マウスモデルが使用され、 インビトロでの脊髄ニューロンの固有の特性および生物学の研究が可能になる。 in vitroでのニューロンの単離と維持は特に簡単ではない大人のげっ歯類の皮質組織からのニューロンの単離のための技術が比較的豊富にあり、それは相当数の単離されたニューロン（ すなわち数百万個）これとは対照的に、脊髄組織からのニューロンの収量は、組織の質量がより少ないために、部分的に8,9,10よりも低い。さらに、マウスでは、新生児の単離のための技術が相対的に不足している脊髄ニューロン、および既存の方法は、より低いニューロン収量（ すなわち数百）または胚性マウスの単離を必要とする手間と資源重い技術によって制限される10 。 このプロトコルでは、新生児マウスの脊髄からかなりの数のニューロンをコスト効率的かつリソース効率的に単離できる技術を使用する。以前に発表された技術でよく見られるように、我々は酵素プロテアーゼとしてパパインを使用し、脊髄組織からのニューロンの放出を可能にする。さらに、精製された細胞の分離には濃度勾配を使用していますが、これは以前は効果的であることが示されています6,10。細胞が培養される培地は様々であり得るが、我々の経験およびこれまでに公開された11のように 、新鮮なB27培地補充物はニューロンの寿命にとって重要であることが証明されている。ニューロンは、典型的には10日間まで生存可能であり、治療を行うことを可能にする。

<table><tbody><tr><td>Hibernate A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td><td>Brainbits</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr><tr><td>Glutamax 100X - 100 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td></tr><tr><td>B27 Supplement 50X - 10 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td></tr><tr><td>Papain, Lyophilized - 100 mg</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>Neurobasal A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Mouse Laminin - 1 mg</td><td>Thermo-Fisher</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>Trypan Blue - 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440272-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306-1L</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Glass Pippette - 9&quot;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-678-20C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Pipette bulb - 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>BRAND&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;Petri dish, glass - 60 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Sterile 24-Well Cell Culture Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-671-6</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td></tr><tr><td>Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td></tr><tr><td>NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice

我々は、脊髄ニューロンの単離および培養のためのプロトコールを提示する。ニューロンは、新生児C57BL / 6マウスから得られ、生後1〜3日に単離される。通常、1匹の繁殖対から生まれた4〜10匹の仔マウスを1回の実験で集め、イソフルランで安楽死させた後、各マウスから脊髄を個別に採取する。脊柱を切開し、次いで脊髄を柱から解放する。次いで、ニューロンおよび他の細胞が組織から放出されることを可能にする酵素的プロテアーゼの送達の表面積を増加させるために、脊髄を細かく切り刻む。次いで、粉砕を用いて細胞を溶液に放出する。その後、この溶液を密度勾配で分画して、溶液中の様々な細胞を分離し、ニューロンを単離することができるようにする。約1-2.5×10 6個のニューロンを1つの繁殖群から単離することができる。次いで、ニューロンを接着剤でコーティングされたウェル上に播種する適切な成長および成熟を可能にするrs。ニューロンは、成長および培養培地中で成熟に達するまでに約7日を要し、その後、治療および分析のために使用することができる。

この技術を用いて、1匹のリター（4〜10匹の仔）は、培養プレートへの播種に適した1-2.5×10 6個のニューロンの単離を可能にする。典型的には、4〜8ウェルを上記の濃度（ すなわち 300,000細胞/ mL）で播種する。 図3は低倍率（ a ）および高倍率（ b ）倍率の光学顕微鏡で培養して1週間後のこの濃度でのニュ?...

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Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

この研究は、WT新生児マウスからのニューロンの単離のための技術を提示する。新生仔マウスから脊髄を注意深く切開し、続いて脊髄組織からニューロンを機械的および酵素的に切断することが必要である。

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K ビュー.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. この研究は、WT新生児マウスからのニューロンの単離のための技術を提示する。新生仔マウスから脊髄を注意深く切開し、続いて脊髄組織からニューロンを機械的および酵素的に切断することが必要である。 

ビデオ: Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

神経科学

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

免疫・感染学

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

生物学

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

胚性マウス小脳から単離されたニューロンの一次培養

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

出生前イスルmnからのオキュロモータ、トロクレア、脊髄運動ニューロンの単離と培養 :GFPトランスジェニックマウス

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

感染と自然免疫を研究するためのマウス脳胚混合細胞培養

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

著者スポットライト:感染と自然免疫を研究するためのマウス胚脳からの混合ニューロン細胞培養とグリア細胞培養の確立  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

成体マウス脊髄からのアストロサイトおよびミクログリアの効率的な抽出

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

著者スポットライト:成体マウス脊髄からのグリア細胞の単離 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

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マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

脊髄電気生理学

胚性マウス小脳から単離されたニューロンの一次培養

出生前イス^ルmnからのオキュロモータ、トロクレア、脊髄運動ニューロンの単離と培養 :GFPトランスジェニックマウス

感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立

感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立

感染と自然免疫を研究するためのマウス胚性脳からの混合神経細胞およびグリア細胞培養の確立

成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)