Bu çalışma Chicago Kadın Kurulu Üniversitesi Wendy Will Vaka Fonu ve Şikago Kapsamlı Kanser Merkezi Destek Hibe Üniversitesi (P30 CA014599) tarafından desteklenmiştir. Bu deneme oluşturmayla katkılarından dolayı Chicago Üniversitesi&#39;nde Sitometrisi Core teşekkür etmek istiyorum ve iyi de Jong laboratuarında diğer üyeleri, özellikle Leslie Pedraza ve Sean McConnell olarak.

Zebra balığı ile ilgili tüm prosedürler Chicago Üniversitesinde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Chicago Üniversitesi, Laboratuar Hayvan Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Birliği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir. 1. Floresanla Etiketli T-ALL Hücrelerini Zebra bağı ile Üretme ve İzole etme <ol><li> Eşzamanlı zebrabalık embriyolarına mikroenjeksiyon <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak, tol2 transposaz (plazmid DNA kaynağı için Malzeme Tablosuna bakınız) tarafından tanınan ters terminal tekrarlarını içeren plazmid DNA&#39;yı izole edin ve DNA&#39;yı elute edin Steril su içinde. NOT: Bu çalışmada GFP kullanılır, ancak herhangi bir flüoresan proteini işe yarayacaktır. </li><li> PCS2-transposaz (tol2) RNA hazırlayın <ol><li> Ticari olarak temin edilebilir kitleri kullanarak tol2 plazmid DNA&#39;yı izole edin (bakınız tPlazmid DNA kaynağı için Tablo Malzemesi) 12 ve steril suda DNA&#39;yı elute edin. </li><li> Plazmid doğrusallaştırmak için uygun tampon 5 birim NotI kısıtlama enzimi ile 1 saat 37 ° C&#39;de 1 μg tol2 DNA inkübe edin. NotI&#39;yi 65 ° C&#39;de 20 dakika ısı ile inaktive edin. </li><li> Ticari olarak mevcut bir RNA transkripsiyon kiti 13 kullanarak doğrusallaştırılmış DNA&#39;dan tol2 RNA&#39;sını SP6 RNA polimeraz ile kopyalayın 13 . RNA&#39;yı -80 ° C&#39;de tek kullanımlık bölümler halinde saklayın. </li></ol></li><li> 250 ng rag2 : c-myc plazmid DNA, 250 ng rag2 : GFP plazmid DNA, 150 ng tol2 RNA ve 0.5 μL fenol kırmızısı ekleyerek buz üzerine enjeksiyon karışımını hazırlayın. Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 μL&#39;ye ayarlayın. </li><li> ~ 1 nL enjeksiyon karışımını, tek hücreli bir evre syngeneic zebra balığı embriyonunun hücresine enjekte edin, daha önce kurulmuş bir cam kılcal borudan çekilen bir mikroenjektör ve iğne kullanarakBitmiş Yöntemler 8 , 14 . NOT: Transgenik süreç 15 ile üretilen sinsinik zebrafish, transplantasyondan sonra genetik heterojenliği ve bağışıklık reddini ortadan kaldırmak için kullanılır. Bununla birlikte, vahşi tip zebra bifiş veya herhangi bir istenen suş da kullanılabilir. </li><li> Enjeksiyondan 24 saat 48 saat sonra ölü, az gelişmiş veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoları çıkarın. </li><li> Enjekte edilen balıkları enjeksiyondan 6 gün sonra balık sistemine yerleştirin ve standart protokole göre yükseltin 6 . </li></ol></li><li> Tarama enjekte edilen zebra balığı ve tümör büyümesinin izlenmesi <ol><li> Enjeksiyondan 21 gün sonra, bir epifluorescent mikroskop (uyarılma band pass: 470/40, emisyon bandpass: 525/50) kullanarak bir Petri kabı ve ekran GFP floresan embriyo orta bir damla tek bir enjekte larva yerleştirin. NOT: Zebra balığı larvaları oHem rag2 : c-myc hem de rag2&#39;yi entegre etmiştir : GFP, yeşil bir flüoresan timusa (pozitif balık) sahip olacak ve timüsün ötesinde habis yeşil fluoresan hücrelerinin genişlemesi gösterebilir. Bir GFP + timüslü tüm balıklar, bir GFP + T-ALL geliştirmeye devam edecektir. Plazmitlerin entegrasyonunu göstermeyen larvalar, herhangi bir yeşil floresan hücresi (negatif balık) içermezler. </li><li> Negatif balı (flüoresans eksikliğine bağlı olarak) ayrı bir tüp içine yerleştirin ve enjeksiyondan 28 ve 35 gün sonra balıkları tekrar izleyin. Enjeksiyondan 28 ve 35 gün sonra, balıkları taramadan önce balık sistemi suyunda% 0.02 tamponlu trikain (MS-222) ile anestezi altına alınız. </li><li> Bir floresan etiketli timüs veya floresan etiketli bir tümör için pozitif olan her bir zebra balığı larva&#39;yı, haftada üç kez tümör büyümesini izlemek için tek bir tanka yerleştirin. </li></ol></li><li> Primer tümör balıklarından floresan etiketli T-ALL hücrelerinin toplanması <ol><li> 0.9x fosfat tamponlu salin (FBS / PBS) içinde en az 20 mL% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetüs sığır serumu hazırlayın. </li><li> Bir şişe heparin sodyum tuzu (300 ünite) 1 mL FBS / PBS ekleyin. </li><li> Vücudun% 50&#39;sinden fazlasındaki balık içeren tümörleri veya yeme veya yüzme konusunda zorluk çeken balıkları seçin. Balıkları tricaine ile aşırı dozda kurutun veya buzlu suyla daldırın. Solunum hareketleri ve kalp atışlarından yoksun olarak ölümü onaylayın. </li><li> Balık başını çıkarmak için traş bıçağı kullanın. </li><li> Aşırı kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için balık kavitesini heparin solüsyonu ile yıkayın. <ol><li> Bir pipet kullanarak, balıkların vücut boşluğuna 100 mcL heparin solüsyonu (adım 1.3.2&#39;de hazırlanmıştır) enjekte edin. Dışa akan tüm sıvıları (kan hücreleri içerecektir) çıkarın ve 1,5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. </li><li> Vücudunu tekrar yıkamak için yeni bir pipet kullanın. En az üç kez yıkayın ya da dökülen sıvı berrak hale gelinceye kadarood. </li><li> Daha sonraki analizlerde kullanılmayacağı için, 1.3.5.1 ve 1.3.5.2 adımlarında yıkamalardaki tüm sıvıyı atın. </li></ol></li><li> Lösemi hücrelerini toplayın. <ol><li> Balıkların vücut boşluğuna 100 μL FBS / PBS enjekte edin. </li><li> Tüm hücreleri sıkmak / itmek için pipetin ucuyla balık gövdesinin dışına nazik bir basınç uygulayın. NOT: Eğer bu adım bir diseksiyon mikroskopu kullanılarak gerçekleştirilirse, vücut boşluğundan dökülen tümör hücreleri belirgindir. </li><li> Her bir yıkamadan 1,5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne sıvı ve hücreler toplayın. </li><li> Tümör hücrelerinin çoğu toplanana kadar (genellikle 5-10 defa) adım 1.3.6.1-1.3.6.3&#39;ü tekrarlayın. Tüm tümör hücrelerini aynı 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüpüne alın. Hücreleri oda sıcaklığında tutun. </li></ol></li><li> Adım 1.3.6&#39;daki toplanan tümör hücrelerini, hücrelerin yığınlarını ayırmak için hafifçe pipetleyerek karıştırın. Hücre süspansiyonunu 4&#39;ten0 um gözenekli filtre. Filtre 1-2 kez 100 uL FBS / PBS ile yıkanır. Hücreleri oda sıcaklığında tutun. </li><li> Yeni bir tüpte tripan mavisinin (0.4%, seyreltilmiş 1:10 ve filtrelenmiş) 18 μL&#39;lik hücre süspansiyonunun 2 μL&#39;sini karıştırın. Bir hemositometre üzerine 10 mcL yükleyin ve izole edilmiş tümör hücrelerinin sayısını hesaplamak için canlı (mavi olmayan) floresan hücrelerinin sayısını hesaplayın. NOT: Mavi olmayan GFP negatif hücreler büyük olasılıkla normal, kötü huylu olmayan T hücreleridir ve sayılmamalıdır. Hoechst 33342 ile hücrelerin lekelenmesi için en az 2 x 106 hücre gereklidir. </li></ol></li></ol> 2. Florokimyasal olarak Etiketli T-ALL Hücrelerini, Hoechst 33342 ile Boyanarak Yan Populasyonu Belirleyin <ol><li> 1 mg / mL çalışma konsantrasyonunu oluşturmak için Hoechst 33342 1:10 &#39;ı nükleaz içermeyen H20 ile seyreltin. Boya 4 ° C&#39;de ve karanlıkta saklanmalıdır. </li><li> 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 49.1 mg eriterek bir 100 mM verapamil solüsyonu hazırlayın. NOT: Verapamil, ABC taşıyıcılarının bir inhibitörüdür ve yan popülasyon deneyleri için önemli bir kontroltür. Numunelere verapamil ilavesi, ABC taşıyıcılarının Hoechst 33342 boyasını atma kabiliyetini engelleyecektir. Dolayısıyla, verapamil numuneye eklendiğinde doğru bir yan nüfus kaybolur. </li><li> 28 ° C&#39;ye kadar su banyosu yapın. </li><li> Floresansla aktive hücre ayırıcı (FACS) tüplerine hücre ve solüsyon ekleyerek örnekleri ve kontrolleri karanlıkta hazırlayın. <ol><li> Numuneleri, bir FACS tüpüne 10 6 hücre, 15 uL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 μL DMSO ilave ederek hazırlayın. FBS / PBS ile hacmi 1 mL&#39;ye ayarlayın. </li><li> Bir FACS tüpüne 10 6 hücre, 15 uL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 uL 100 mM verapamil ilave ederek kontrolleri hazırlayın. FBS / PBS ile hacmi 1 mL&#39;ye ayarlayın. NOT: Minimum 10 6 hücre / numune önerilir, ancak özellikle yan populatİyon hücreleri daha ileri analiz için sıralanacaktır. 10 6 hücre / mL&#39;yi aşmayın ve Hoechst 33342 konsantrasyonunu 15 μg / mL&#39;de tutun. 10 x 10 6 hücre lekelenirse, toplam reaksiyon hacmi 10 mL&#39;dir. </li></ol></li><li> Karanlıkta 120 dakika boyunca 28 ° C su banyosunda inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücreleri hemen buz üzerine koyun ve karanlıkta tutun. </li><li> Hücreleri 4 ° C&#39;de 6 dakika 300 x g&#39;de peletleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS / PBS ile yıkayın. </li><li> Hücreleri 4 ° C&#39;de 6 dakika 300 x g&#39;de peletleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS / PBS&#39;de hücreleri tekrar süspanse edin. </li><li> Hücrenin sınıflandırılıncaya kadar 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> Hücre ayırmadan 15 dakika önce, her bir 1 mL FBS / PBS (son konsantrasyon: 2 ug / mL) 2 μL propidyum iyodür (PI) stokunu (1 mg / mL) ekleyin. İyice karıştırın. </li></ol> 3. Floresanla Etiketlenmiş T-ALL Hücre Popülasyonunda Yan Popülasyonu Bulmak için FACS kullanın <ol><li&gt; Hoechst 33342 boya uyarma için bir UV lazer ve PI uyarma için bir 488-nm lazeri ile ve GFP + T-ALL hücrelerinin saptanması için donatılmış bir hücre sıralayıcı lekeli zebra balığı, T-ALL hücresi süspansiyonları analiz edin. </li><li> canlı için bir kapı belirleyin, GFP + T-ALL hücreleri. <ol><li> kapı üzerinden çöp Kullanım İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) alan. NOT: FSC hücre boyutunu ayırt etmek için kullanılır ve SSC hücresinin ayrıntı düzeyini ayırt etmek için kullanılır. </li><li> çiftleri ayırt FSC ve SSC genişliği kullanım. NOT: Alan, boy ve genişlik: detektörleri akış sitometresi ile tanımlanan üç bileşeni vardır. Konum tipik olarak hücrenin floresan ölçmek için kullanılır. Genişliği uçuş süresini ölçen ve iki hücre yığılmaz ve sanki iki kat geniştir. </li><li> Canlı tümör hücreleri için uygun dedektörleri kullanarak PI için GFP için pozitif ve negatif hücrelerin etrafındaki bir kapı çizin (örneğin GFP ve PI için PerCP Cy5-5 için FITC). </li></ol></li><li&gt; Canlı hücre kapısı olarak, (sırasıyla 450/50 ve 670/30), Hoechst Mavi ve Hoechst kırmızı bant geçiş filtreleri içinden Hoechst 33342 floresan ölçer. NOT: Bu kurulduktan sonra yan nüfus varsa, belirgin olacaktır. gerçek bir yan nüfus düşünülmesi için önemlisi, yan nüfus sırayla verapamil kontrolünde kaybolur gerekir. </li><li> başka deneyler için yan nüfus hücreleri sıralama durumunda, büyük meme ucu (100 um) kullanmak ve% 100 FBS 3 mL içeren bir FACS tüpü içine hücreleri toplamak. sıralama sonra hücre canlılığı artırmak için daha büyük bir meme ucu (100 um) yerine daha küçük bir uç (70 um) kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).</li><li>Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+marrow+contains+ABCG2-dependent+side+population+cells+exhibiting+hematopoietic+stem+cell+properties.">Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.</a> Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299, 887-890 (2003).</li><li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish.">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> J Vis Exp. , e2790 (2011).</li><li>Martelli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+signaling+pathways+in+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+initiating+cells.">Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells.</a> Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).</li><li>Smith, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).</li><li>Blackburn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+enhances+leukemia-propagating+cell+frequency+in+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia+through+Akt/mTORC1+pathway+activation.">Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation.</a> Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Plasmid+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Komuro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+side+population+cells+(stem-like+cell+population)+in+pediatric+solid+tumor+cell+lines.">Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines.</a> J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).</li><li>Moshaver, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+small+subpopulation+of+candidate+leukemia-initiating+cells+in+the+side+population+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia.</a> Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yan popülasyon tahlili oldukça duyarlıdır; Bu nedenle, protokoldeki küçük değişiklikler, yan popülasyon hücrelerinin saptanmasında zorluklara neden olabilir. İlk olarak, boyama aşamasındaki sıcaklık, her bir hayvan / hücre sistemine özeldir. Memeli sistemleri için yan popülasyon tahlili tipik olarak 37 ° C&#39;de yapılır. Zebra balığı T-ALL hücreleri 37 ° C&#39;de inkübe edildiğinde, çoğu hücre öldü ve bu inkübasyon sıcaklığını kabul edilemez duruma getirdi (veriler gösterilmed...

Yan nüfus tahlili hücre zarı ATP bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcı proteinler, yüksek düzeyde bir DNA bağlanma boya Hoechst 33342 akıttığı bir doku içinde belli hücrelerinin gelişmiş yetenek istifade. Hoechst 33342 boya dışa akımı, hücreler boya UV lazeri tarafından uyarılır sonra dual dalga boyu akış sitometrik analizi kullanılarak tespit edilebilir. Bu deney, ilk olarak fare hematopoietik kök hücreler (HSC), 1 tanımlamak için kullanılmıştır, ancak güne kadar bir çok doku ve kanser kök / progenitör hücre popülasyonlarının belirlenmesi için kullanılmıştır (referans 2 de incelenmiştir). Ancak, bütün hücre popülasyonları bir yan nüfusu ve tüm yan popülasyonları kök / progenitör hücreler açısından zenginleştirilmiş olan değil. Zebra balığı, geleneksel fare mo üzerinde avantaj sayı ile insan kanseri 3, 4 çalışmak için güçlü bir omurgalı genetik model sistemKanserin DELS. Balığı embriyolar harici transgenesis ve kanser başlangıcında ve ilerlemesinde de dahil olmak üzere patolojik süreçlerin, in vivo gözlem kolaylaştıran döllenir ve optik açıdan berrak olan edilir. Bugüne kadar, yan nüfus tahlil potansiyel kök veya progenitör hücreler sadece HKH&#39;lerin tespit etmek zebrabalıkları böbrek iliği uygulanır ve herhangi bir Zebra balığı kanser modelleri 5, 6 olmuştur algılamak için. T-hücresi akut lenfoblastik lösemi zebra balığı modeli (T-ALL) morfolojik ve insan T-ALL 7, 8, 11 arasındaki genetik olarak benzer. T-ALL, insanlarda, pediatrik% 10-15&#39;ini ve TÜM vakaların 9 yetişkin% 25&#39;i oluşturuyor saldırgan kanseridir. T-ALL tedavisi geliştirilmiş olsa da, nüks hala yaygındır ve kötü prognoz ile ilişkilidir. T-ALL tümörler Heterojen olanLösemi başlatan hücreler (LIC&#39;ler dahil olmak üzere birçok farklı tümör hücresi alt popülasyonu içerir. LIC&#39;ler tek bir hücreden tüm tümörü yeniden başlatma kabiliyetleri ile tanımlanır ve bir tümör hücre popülasyonu içerisindeki LIC&#39;lerin sıklığı, sınırlayıcı bir seyreltme transplantasyon testi (LDA) aracılığıyla çeşitli hücre dozlarını alıcılara naklederek hesaplanabilir. LICs 8 , 10 , 11 frekansını hesaplamak için zebrafish&#39;de LDA deneyleri yapılırken, bu belirleme gezinme sırasında yapılır ve LIC&#39;lerin prospektif izolasyonuna izin vermez. Bu nedenle, kanserli kök hücre aktivitesi için zenginleştirilmiş bir popülasyonu prospektif olarak izole etmek için bir yöntem bulunmamaktadır. Zebra balığı T-ALL&#39;lerinden yan popülasyon hücrelerinin belirlenmesi ve izole edilmesi bu eksikliği gidermeye yönelik ilk adımdır. Burada sunulan protokol, Zebr&#39;de T-ALL tümörlerinin nasıl verimli bir şekilde üretileceğini açıklamaktadırafish tol2 aracılı transgenesis kullanan T-ALL tümörler hücreleri hasat ve hücrelerin yan popülasyonu tespit Hoechst 33342 ile boyanır. Zebra balığı, T-ALL in vivo deney gelecek yan popülasyonu, hücrelerin Lics için zenginleştirilmiş ya da diğer stem- veya projenitör benzeri özelliklere sahip olup olmadığı içerebilir.

<table><tbody><tr><td>Syngeneic zebrafish (CG2)</td><td></td><td></td><td>See Mizgireuv &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2006</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt;:c-myc plasmid</td><td></td><td></td><td>Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt;:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt; promoter from Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>pCS2-transposase plasmid</td><td></td><td></td><td>Chien Laboratory</td></tr><tr><td>NotI -HF restriction enzyme</td><td>New England Bio-Labs Inc.</td><td>R3189S</td><td>500 units in 25 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>Thermo Fisher Scientific - AM1340</td><td>25 reactions</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Inc.</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V8 Microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>495015-0008-000</td><td></td></tr><tr><td>Digital microinjector</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td></td></tr><tr><td>Brass straight-arm needle holder</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base and stand</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MN153</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td>10 cm without filament</td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf North America Inc.</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma Life Science</td><td>P0290</td><td>0.5% concentration 100 mL</td></tr><tr><td>Plastic Transfer pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>137119D</td><td>graduated 7.5 mL bulb</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td>Fisher Scientific - NC0342409</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>Fisher Scientific - SH3007103</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>1001-023</td><td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>15 - 300 unit vials</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m mesh filter</td><td>Falcon Corning Brand</td><td>352340</td><td>Case of 50</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8154</td><td>20 mL - Solution (0.4%)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma Life Science</td><td>V4629</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D8418</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Life Technologies</td><td>P3566</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>FACSAria Fusion cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

Hem sağlıklı hem de habis dokudan heterojen hücre popülasyonları, DNA bağlama boyası Hoechst 33342&#39;yi dışarı atma yeteneği ile karakterize bir hücre popülasyonu içerebilir. Hücrelerin bu &quot;yan popülasyonu&quot;, Hoechst 33342&#39;den sonra akış sitometrik yöntemleri kullanılarak tanımlanabilir Boya ultraviyole (UV) lazerle uyarılır. Birçok hücre tipinin yan popülasyonu stem veya progenitor benzeri hücreler içerir. Bununla birlikte, tüm hücre tiplerinin tanımlanabilir yan popülasyonu yoktur. Danio rerio , zebrafish, T hücreli akut lenfoblastik löseminin (T-ALL) sağlam bir in vivo modeline sahip ancak bu zebra bağı T-ALL&#39;lerin bir yan popülasyonu olup olmadığı bilinmiyor. Burada açıklanan yöntem, zebra balığı T-ALL&#39;deki yan popülasyon hücrelerinin nasıl izole edilebileceğini açıklamaktadır. Başlamak için, zebra balığı içindeki T-ALL, tol2 plazmidlerinin bir hücre evresi embriyolarına mikroenjeksiyonu yoluyla üretilir. Tümörler aniden yarısından fazlasına genişlediği bir aşamaya geldiğindeMalın vücudu, T-ALL hücreleri hasat edilebilir. Hücreler daha sonra Hoechst 33342 ile lekelenir ve yan popülasyon hücreleri için akış sitometrisi ile muayene edilir. Bu yöntem, zebra balığı T-ALL araştırmasında geniş uygulamalara sahiptir. Zebra balığı içinde bu yan popülasyon hücrelerinin kanserli kök hücre benzeri olup olmadığını teyit eden bilinen bir hücre yüzeyi belirteçleri bulunmamakla birlikte, in vivo fonksiyonel transplantasyon testleri mümkündür. Ayrıca, bu yan popülasyon hücrelerinin genetik özelliklerini tanımlamak için tek hücreli transkriptomikler uygulanabilir.

Zebra balığı içinde fluoresan myc kaynaklı T-ALL tümörleri verimli bir şekilde üretmek için, tol2 transposaz bölgeleri ile çevrili dairesel DNA yapıları tol2 RNA ile birlikte enjekte edilebilir. Doğrusallaştırılmış DNA&#39;nın zebrafish embriyolarına enjeksiyonundan önceki çalışmalar,% 5 transgenesis oranı 8 bildirmektedir. Protokol, tol2 aracılıklı transgenezi içerecek şekilde ayarlandığında,% 10-44 arasında değişen transgene...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish at JoVE.com

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir.

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K Görüntüleme.  The University of Chicago.  Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir. 

Video: Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Gelişim Biyolojisi

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı T-ALL'de Hücre Proliferasyonu Boya Sıralaması Kullanılarak LSC Frekansının Tahmin Edilmesi

Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect CSCs from antiproliferative chemotherapy drugs. In T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) patient-derived xenograft (PDX) mouse models, quiescent cells are associated with treatment resistance and stemness. Cell proliferation dyes are popular tools for the tracking of cell division. The fluorescent dye is covalently anchored into amine groups on the membrane and macromolecules inside the cell. This allows for the tracking of labeled cells for up to 10 divisions, which can be resolved by flow cytometry.
Ultimately, cells with the highest proliferation rates will have low dye retention, as it will be diluted with each cell division, while dormant, slower-dividing cells will have the highest retention. The use of cell proliferation dyes to isolate dormant cells has been optimized and described in T-ALL mouse models. Complementary to the existing mouse models, the rag2:Myc-derived zebrafish T-ALL model provides an excellent venue to interrogate self-renewal in T-ALL due to the high frequency of leukemic stem cells (LSCs) and the convenience of zebrafish for large-scale transplant experiments.
Here, we describe the workflow for the staining of zebrafish T-ALL cells with a cell proliferation dye, optimizing the concentration of the dye for zebrafish cells, passaging successfully stained cells in vivo, and the collection of cells with varying levels of dye retention by live cell sorting from transplanted animals. Given the absence of well-established cell surface makers for LSCs in T-ALL, this approach provides a functional means to interrogate quiescent cells in vivo. For representative results, we describe the engraftment efficiency and the LSC frequency of high and low dye-retaining cells. This method can help investigate additional properties of quiescent cells, including drug response, transcriptional profiles, and morphology.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Zebra Balığı T-ALL'den Hareketsiz Lösemi Kök Hücrelerinin Tanımlanması ve İzolasyonu

We used cell proliferation staining to identify quiescent cells in the zebrafish T-acute lymphoblastic leukemia model. The stain is retained in non-dividing cells and reduced during cell proliferation, enabling the selection of dormant cells for further interrogation. This protocol provides a functional tool to study self-renewal in the context of cellular quiescence.

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması 

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect ...

Kanser Araştırmaları

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Biyoloji

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı