この研究はシカゴ大学女性委員会、ウェンディウィル症例基金、シカゴ大学総合がんセンター支援グラント（P30 CA014599）の支援を受けました。シカゴ大学のフローサイトメトリーコア（Flow Cytometry Core）に感謝したいと思います。この実験の設立には、ドゥ・ジョン研究所の他のメンバー、特にレスリー・ペドラザとショーン・マッコネルもお手伝いします。

ゼブラフィッシュのすべての手順は、シカゴ大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）の承認を受けています。シカゴ大学は、実験動物管理（AAALAC）の評価と認定協会の認定を受けています。 1.ゼブラフィッシュにおける蛍光標識T-ALL細胞の生成および単離<ol><li> 同系ゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション <ol><li>市販のキットを使用して、tol2トランスポゼース（プラスミドDNAの供給源については表を参照） 12によって認識される逆方向末端反復を含む環状rag2 ：c-mycおよびrag2 ：緑色蛍光タンパク質（ rag2 ：GFP）プラスミドDNAを単離し、滅菌水で洗浄した。 注：この研究ではGFPを使用していますが、蛍光タンパク質があれば動作します。 </li><li> pCS2-トランスポゼース（tol2）RNAを調製する<ol><li>市販のキットを用いてtol2プラスミドDNAを単離する（tプラスミドDNAの供給源の材料表） 12を用いて滅菌水でDNAを溶出させる。 </li><li>適切なバッファーに5単位のNotI制限酵素を加えて37℃で1時間、1μgのtol2 DNAをインキュベートしてプラスミドを線状化する。 NotIを65℃で20分間加熱失活させる。 </li><li>市販のRNA転写キット13を使用して、直鎖状DNAからSP6 RNAポリメラーゼでtol2 RNAを転写する。 -80°Cで1回分のアリコートにRNAを保存します。 </li></ol></li><li> 250ngのrag2 ：c-mycプラスミドDNA、250ngのrag2 ：GFPプラスミドDNA、150ngのtol2 RNA、および0.5μLのフェノールレッドを添加することによって、氷上で注入混合物を調製する。ヌクレアーゼフリーの水で10μLに調整する。 </li><li>先に確立された、ガラス毛細管から引き出されたマイクロインジェクターおよび針を使用して、1細胞段階の同系ゼブラフィッシュ胚の細胞に〜1nLの注射混合物を注入する。方法8,14を磨いた。 注：単為生殖により生成された同系ゼブラフィッシュは、移植後の遺伝的異種性および免疫拒絶を排除するためにここで使用される。しかし、野生型ゼブラフィッシュまたは任意の所望の株も使用することができる。 </li><li>注射後24時間および48時間で、死亡、発育不良、または不正な形式の胚を取り除く16 。 </li><li>注射後6日目に魚系に注射した魚を置き、標準プロトコールに従って魚を飼育する6 。 </li></ol></li><li> ゼブラフィッシュを注射し、腫瘍増殖をモニターする <ol><li>注入後21日目に、ペトリ皿上の胚培地の液滴中に単一注入幼虫を置き、エピ蛍光顕微鏡（励起バンドパス：470/40、放出バンドパス：525/50）を用いてGFP蛍光についてスクリーニングする。 注：ゼブラフィッシュの幼虫はhaveはrag2 ：c-mycとrag2 ：GFPの両方を統合し、緑色の蛍光胸腺（陽性魚）を有し、胸腺を越えて悪性緑色蛍光細胞の拡大をすでに示している可能性がある。 GFP +胸腺を有する全ての魚は、GFP + T-ALLを発症する。プラスミドの組込みを示さない幼虫は、緑色蛍光細胞（陰性魚）を有さない。 </li><li>陰性の魚（蛍光の欠如に基づいて）を別のタンクに分け、注射後28および35日に再び魚をモニターする。注射後28および35日目に、スクリーニング前に魚系水中の0.02％緩衝化トリカイン（MS-222）で魚を麻酔する。 </li><li>蛍光標識された胸腺または蛍光標識された腫瘍について陽性である各ゼブラフィッシュの幼虫を、腫瘍増殖をモニターするための個々のタンクに1週間に3回配置する。 </li></ol></li><li> 一次腫瘍魚からの蛍光標識T-ALL細胞の収集 <ol><li> 0.9Xのリン酸緩衝生理食塩水（FBS / PBS）中の10％熱不活性化ウシ胎児血清の少なくとも20ミリリットルを準備します。 </li><li>ヘパリンナトリウム塩（300単位）の1つのバイアルにFBS / PBSを1ml加えます。 </li><li>選択した魚の体の50％以上で腫瘍を保有する、またはこれらの魚は困難食べたり水泳を持ちます。トリカインまたは氷水浸漬することによって、それらを過剰投与により、魚を生け贄に捧げます。鰓の動きや心拍の欠如aで死亡を確認。 </li><li>魚の頭を削除するためにカミソリの刃を使用してください。 </li><li>余分な赤血球を除去するためにヘパリン溶液で魚の空洞を洗います。 <ol><li>ピペットを使用して、魚の体腔内に（ステップ1.3.2で調製した）ヘパリン溶液の100μLを注入します。こぼれ全ての液体を除去（これは血液細胞を含有する）および1.5mLのマイクロ遠心チューブにそれをピペット。 </li><li>再び体を洗うために、新鮮なピペットチップを使用してください。少なくとも3回の洗浄を行い、またはこぼれた液体は、BLの自由が表示されるまでおお</li><li>それ以上の分析には使用されないので、ステップ1.3.5.1および1.3.5.2の洗浄液からすべての液体を捨てる。 </li></ol></li><li>白血病細胞を収集する。 <ol><li> 100μLのFBS / PBSを魚の体腔に注入する。 </li><li>ピペットチップで魚の体の外側に穏やかな圧力をかけて、腫瘍細胞を絞る/押し出す。 注：このステップが解剖顕微鏡を使用して実行される場合、体腔から流出する腫瘍細胞が明らかになります。 </li><li>各洗浄液から1.5 mLのマイクロ遠心チューブに液体と細胞を集める。 </li><li>大部分の腫瘍細胞が採取されるまで（通常5〜10回）、ステップ1.3.6.1〜1.3.6.3を繰り返す。すべての腫瘍細胞を同じ1.5mLマイクロ遠心チューブに集める。細胞を室温に保つ。 </li></ol></li><li>穏やかにピペッティングすることにより、収集した腫瘍細胞をステップ1.3.6から混合し、細胞の塊を解離させる。細胞懸濁液を4つの0μmメッシュフィルター。 100μLのFBS / PBSでフィルターを1〜2回洗浄する。細胞を室温に保つ。 </li><li> 2μLの細胞懸濁液を18μLのトリパンブルー（0.4％、1:10に希釈して濾過したもの）と新しいチューブで混合する。血球計算器に10μLをロードし、生存（非青色）蛍光細胞の数を数えて、単離した腫瘍細胞の数を計算する。 注：非青色のGFP陰性細胞は、正常で非悪性のT細胞である可能性が高く、計数すべきではありません。 Hoechst 33342で細胞を染色するためには、少なくとも2×10 6個の細胞が必要である。 </li></ol></li></ol> Hoechst 33342を用いて蛍光標識したT-ALL細胞を染色し、側方集団を同定する。 <ol><li> Hoechst 33342 1:10をヌクレアーゼフリーのH 2 Oで希釈して、1mg / mLの作業濃度にする。 4℃および暗所で色素を保存する。 </li><li> 1 mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に49.1 mgを溶解して、ベラパミルの100 mM溶液を調製する。 注：ベラパミルはABCトランスポーターの阻害剤であり、側方集団実験の重要なコントロールである。サンプルにベラパミルを添加すると、Hoechst 33342色素を流出させるABCトランスポーターの能力が阻害される。したがって、ベラパミルをサンプルに添加すると、真の人口は消滅します。 </li><li>水浴を28℃に設定する。 </li><li>蛍光活性化セルソーター（FACS）チューブに細胞と溶液を加えることによって、暗所でサンプルとコントロールを準備します。 <ol><li> FACSチューブに10 6細胞、1 mg / mL Hoechst 33342 15μL、DMSO 2.5μLを加えてサンプルを調製します。 FBS / PBSで容量を1 mLに調整する。 </li><li> FACSチューブに10 6細胞、1 mg / mL Hoechst 33342 15μL、100 mMベラパミル2.5μLを加えてコントロールを調製する。 FBS / PBSで容量を1 mLに調整する。 注：少なくとも10 6細胞/サンプルが推奨されますが、より多くの細胞を染色することが推奨されます。特に、イオンセルは、さらなる分析のためにソートされます。 10個の6細胞/ mLを超え、及び15μgの/ mLのヘキスト33342濃度を維持しません。 10×10 6個の細胞が染色される場合、総反応容量は10 mLです。 </li></ol></li><li> 120分間、暗所で28℃の水浴中でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、直ちに氷上に細胞を配置し、暗所に保管してください。 </li><li> 300×gで6分間、4℃で細胞をペレット。上清を取り除きます。 FBS / PBS 1mLで洗浄します。 </li><li> 300×gで6分間、4℃で細胞をペレット。上清を取り除きます。 FBS / PBS 1mLに細胞を再懸濁。 </li><li>細胞選別まで4℃で保管してください。 </li><li> 15分前に、ソーティング、細胞FBS / PBS（最終濃度を2μg/ ml）を各1 mLのヨウ化プロピジウム（PI）ストック（1mg / ml）の2μLを追加します。よく混ぜます。 </li></ol> 3. FACS蛍光標識T-ALL細胞集団内のサイドポピュレーションを検索します<ol><li&gt;染色されたゼブラフィッシュT-ALL細胞懸濁液を、Hoechst 33342色素励起用のUVレーザーとPI励起用の488nmレーザーとGFP + T-ALL細胞の検出用のセルソーターで分析する。 </li><li>生きたGFP + T-ALL細胞のゲートを決定する。 <ol><li>破片をゲートアウトするには、前方散乱（FSC）およびサイド散乱（SSC）領域を使用します。 注記：FSCはセルサイズを区別するために使用され、SSCはセルの細分性を区別するために使用されます。 </li><li>二重線を識別するためにFSCおよびSSC幅を使用する。 注：フローサイトメーターの検出器で識別される3つの成分、面積、高さ、幅があります。面積は、典型的には、細胞の蛍光を測定するために使用される。幅は飛行時間を測定し、2つの細胞が一緒に凝集する場合、幅は2倍になります。 </li><li>生存腫瘍細胞については、適切な検出器（ 例えば 、GFPの場合はFITC、PIの場合はPerCP Cy5-5）を使用して、GFP陽性細胞およびPI陰性細胞の周囲にゲートを描く。 </li></ol></li><li&gt;生細胞のゲートで、Hoechst BlueおよびHoechst Redバンドパスフィルター（それぞれ450/50および670/30）を介してHoechst 33342蛍光を測定します。 注：サイドポピュレーションが存在する場合は、これが設定された後に明らかになります。重要なことに、側方集団は、本当の側方集団とみなされるためには、ベラパミル対照において消失しなければならない。 </li><li>さらなる実験のために側方集団細胞を選別する場合は、大きなノズル先端（100μm）を使用し、3mLの100％FBSを含むFACSチューブに細胞を集める。選別後の細胞の生存率を向上させるには、より小さなチップ（70μm）ではなく、より大きなノズルチップ（100μm）を使用してください。 </li></ol>

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著者は何も開示することはありません。

側方集団検定は非常に感度が高い。したがって、プロトコールのわずかな変更は、側方集団細胞を検出することを困難にする可能性がある。第1に、染色工程中の温度は、各動物/細胞系に特異的である。哺乳動物系では、側方集団検定は典型的には37℃で実施される 。ゼブラフィッシュT-ALL細胞を37℃でインキュベートすると、多くの細胞が死んだため、このインキュベーシ?...

側方集団アッセイは、細胞膜上の高レベルのATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質のために、DNA結合色素Hoechst 33342を流出させる組織内の特定の細胞の増強された能力を利用する。 Hoechst 33342色素を流出する細胞は、色素がUVレーザーによって励起された後、二波長フローサイトメトリー分析を用いて同定することができる。このアッセイは、マウス造血幹細胞（HSC） 1を同定するために最初に用いられたが、その後、多くの組織および癌において幹/前駆細胞集団を同定するために使用されている（参考文献2で検討されている）。しかし、細胞の集団のすべてに側面集団があるわけではなく、すべての側面集団が幹/前駆細胞に対して富化されているわけではありません。 ゼブラフィッシュは、ヒトの癌を研究するための強力な脊椎動物遺伝モデルシステムです3,4、伝統的なマウスよりも多くの利点がありますがんのうずき。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精され、光学的に透明であり、遺伝子導入および癌開始および進行を含む病理学的プロセスのインビボでの観察を促進する。今日まで、可能性のある幹細胞または前駆細胞を検出するための側方集団検定は、ゼブラフィッシュの腎臓骨髄にのみ適用され、HSCを同定したが、ゼブラフィッシュ癌モデルではなかった 5,6 。 T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルは、形態学的および遺伝的にヒトT-ALL 7,8,11に類似している。 T-ALLは、ヒトでは小児の10-15％、成人ALLの25％を占める攻撃的悪性腫瘍である9 。 T-ALLの治療が改善されたが、再発は依然として一般的であり、予後不良と関連している。 T-ALL腫瘍は異種遺伝子であるOUとは、白血病開始細胞（低所得国）を含む多くの異なる腫瘍細胞の亜集団を含みます。低所得国は、単一細胞から腫瘍全体を再成長する能力によって定義され、腫瘍細胞集団内で低所得国の周波数は、限界希釈移植アッセイ（LDA）を介して、レシピエントに変化する細胞用量を移植することにより算出することができます。 LDAの実験は低所得国8、10、11の周波数を計算するためにゼブラフィッシュで行われているが、この決意は、後知恵で作られており、低所得国の将来の分離を可能にしません。そのため、プロスペクティブにがん幹細胞活性のために濃縮された集団を分離する方法が欠けています。ゼブラフィッシュT-オールズからサイドポピュレーション細胞を同定および単離することは、この欠点に対処する第一歩です。 ここで紹介するプロトコルは、効率的にzebrでT-ALL腫瘍を生成する方法について説明しますT-ALL腫瘍細胞を採取し、Hoechst 33342でそれらを染色して、細胞の側面集団を同定する。ゼブラフィッシュT-ALLを用いた将来のin vivo実験には、側方集団細胞がLICに対して富化されているか、または他の幹または前駆体様の特性を有するかどうかが含まれ得る。

<table><tbody><tr><td>Syngeneic zebrafish (CG2)</td><td></td><td></td><td>See Mizgireuv &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2006</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt;:c-myc plasmid</td><td></td><td></td><td>Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt;:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt; promoter from Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>pCS2-transposase plasmid</td><td></td><td></td><td>Chien Laboratory</td></tr><tr><td>NotI -HF restriction enzyme</td><td>New England Bio-Labs Inc.</td><td>R3189S</td><td>500 units in 25 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>Thermo Fisher Scientific - AM1340</td><td>25 reactions</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Inc.</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V8 Microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>495015-0008-000</td><td></td></tr><tr><td>Digital microinjector</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td></td></tr><tr><td>Brass straight-arm needle holder</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base and stand</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MN153</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td>10 cm without filament</td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf North America Inc.</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma Life Science</td><td>P0290</td><td>0.5% concentration 100 mL</td></tr><tr><td>Plastic Transfer pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>137119D</td><td>graduated 7.5 mL bulb</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td>Fisher Scientific - NC0342409</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>Fisher Scientific - SH3007103</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>1001-023</td><td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>15 - 300 unit vials</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m mesh filter</td><td>Falcon Corning Brand</td><td>352340</td><td>Case of 50</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8154</td><td>20 mL - Solution (0.4%)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma Life Science</td><td>V4629</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D8418</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Life Technologies</td><td>P3566</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>FACSAria Fusion cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

異種細胞集団は、健常又は悪性のいずれかの組織から、DNA結合色素を流出する差動能力によって特徴づけられる細胞の集団を含んでいてもよいヘキスト33342細胞のこの「サイドポピュレーション」は、ヘキスト33342の後にフローサイトメトリー法を用いて同定することができます染料は、紫外線（UV）レーザによって励起されます。多くの細胞型のサイドポピュレーションは、ステムまたは前駆細胞様細胞が含まれています。しかし、全ての細胞型は、識別可能なサイドの人口を持っていません。 ゼブラフィッシュ 、ゼブラフィッシュは、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL） のin vivoモデルで堅牢なを持っているが、これらのゼブラフィッシュT-オールズは、サイドポピュレーションを持っているかどうかは不明です。ここで説明する方法は、ゼブラフィッシュのT-ALLにおけるサイドポピュレーション細胞を単離する方法について説明します。開始するには、ゼブラフィッシュにおけるT-ALLは1細胞期胚にTOL2プラスミドのマイクロインジェクションを介して生成されます。腫瘍は、彼らがより多くのANIの半分以上に拡大した段階まで成長したらT-ALL細胞を回収することができる。次いで、細胞をHoechst 33342で染色し、側面集団細胞についてフローサイトメトリーにより検査する。この方法は、ゼブラフィッシュのT-ALL研究において幅広い用途を有する。ゼブラフィッシュには、これらの側方集団細胞が癌幹細胞様であるかどうかを確認する既知の細胞表面マーカーは存在しないが、 in vivo機能性移植アッセイが可能である。さらに、これらの側方集団細胞の遺伝的特徴を同定するために、単一細胞トランスクリプトミクスを適用することができる。

ゼブラフィッシュで蛍光myc誘導T-ALL腫瘍を効率的に生成するために、tol2トランスポザーゼ部位に隣接する環状DNA構築物をtol2 RNAと同時注入することができる。線状化DNAのゼブラフィッシュ胚への注射からの以前の研究は、5％のトランスジェネシス速度を報告している8 。プロトコールをtol2媒介性の遺伝子導入を含むように調整することにより、10〜44...

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Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

ここで、我々は、MYC誘導性のT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離する技術が記載されています。このサイドポピュレーションアッセイは、高感度であり、ゼブラフィッシュT-ALLのために記載されているが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュの細胞型にも適用可能です。

ゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K ビュー.  The University of Chicago. ここで、我々は、MYC誘導性のT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離する技術が記載されています。このサイドポピュレーションアッセイは、高感度であり、ゼブラフィッシュT-ALLのために記載されているが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュの細胞型にも適用可能です。 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

免疫・感染学

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

発生生物学

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

<meta charset="utf8"></head><body>細胞増殖色素ソーティングを用いたゼブラフィッシュT-ALLのLSC頻度の推定

Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect CSCs from antiproliferative chemotherapy drugs. In T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) patient-derived xenograft (PDX) mouse models, quiescent cells are associated with treatment resistance and stemness. Cell proliferation dyes are popular tools for the tracking of cell division. The fluorescent dye is covalently anchored into amine groups on the membrane and macromolecules inside the cell. This allows for the tracking of labeled cells for up to 10 divisions, which can be resolved by flow cytometry.
Ultimately, cells with the highest proliferation rates will have low dye retention, as it will be diluted with each cell division, while dormant, slower-dividing cells will have the highest retention. The use of cell proliferation dyes to isolate dormant cells has been optimized and described in T-ALL mouse models. Complementary to the existing mouse models, the rag2:Myc-derived zebrafish T-ALL model provides an excellent venue to interrogate self-renewal in T-ALL due to the high frequency of leukemic stem cells (LSCs) and the convenience of zebrafish for large-scale transplant experiments.
Here, we describe the workflow for the staining of zebrafish T-ALL cells with a cell proliferation dye, optimizing the concentration of the dye for zebrafish cells, passaging successfully stained cells in vivo, and the collection of cells with varying levels of dye retention by live cell sorting from transplanted animals. Given the absence of well-established cell surface makers for LSCs in T-ALL, this approach provides a functional means to interrogate quiescent cells in vivo. For representative results, we describe the engraftment efficiency and the LSC frequency of high and low dye-retaining cells. This method can help investigate additional properties of quiescent cells, including drug response, transcriptional profiles, and morphology.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:ゼブラフィッシュT-ALLからの静止性白血病幹細胞の同定と単離

We used cell proliferation staining to identify quiescent cells in the zebrafish T-acute lymphoblastic leukemia model. The stain is retained in non-dividing cells and reduced during cell proliferation, enabling the selection of dormant cells for further interrogation. This protocol provides a functional tool to study self-renewal in the context of cellular quiescence.

細胞増殖染色を用いたゼブラフィッシュT細胞急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞の同定 

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect ...

がん研究

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

生物学

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

ゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離

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マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

移植片対宿主病の誘導および

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

細胞増殖染色を用いたゼブラフィッシュT細胞急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞の同定

細胞増殖染色を用いたゼブラフィッシュT細胞急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞の同定

細胞増殖染色を用いたゼブラフィッシュT細胞急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞の同定

同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること