Diese Arbeit wurde von der University of Chicago Women&#39;s Board, der Wendy Will Case Fund und der University of Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599) unterstützt. Wir danken dem Flow Cytometry Core an der University of Chicago für ihre Hilfe bei der Erstellung dieses Experiments und auch für andere Mitglieder des de Jong Labors, insbesondere Leslie Pedraza und Sean McConnell.

Alle Verfahren mit Zebrabärbling wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Chicago genehmigt. Die University of Chicago wird von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditiert. 1. Erstellen und Isolierkanne fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen in Zebrabärbling <ol><li> Mikroinjektion in syngenen Zebrabärblingembryonen <ol><li> Im Handel erhältlichen Kits, Isolat Kreis rag2: c-myc und rag2: green fluorescent protein (rag2: GFP) Plasmid - DNA - invertierte terminale Repeats von TOL2 Transposase (siehe die Tabelle von Materialien für die Quelle von Plasmid - DNA) 12 und Eluieren der DNA erfasst enthaltend in sterilem Wasser. HINWEIS: GFP wird in dieser Studie verwendet wurden, aber jedes fluoreszierendes Protein funktioniert. </li><li> Bereiten Sie pCS2-Transposase (TOL2) RNA <ol><li> Isolieren TOL2 Plasmid DNA im Handel erhältlichen Kits (siehe ter Tabelle von Materialien für die Quelle von Plasmid - DNA) 12 und die DNA in sterilem Wasser eluieren. </li><li> Inkubiere 1 ug TOL2 DNA bei 37 ° C für 1 h mit 5 Einheiten Restriktionsenzym NotI in dem geeigneten Puffer das Plasmid linearisieren. Wärme-Inaktivierung der NotI bei 65 ° C für 20 min. </li><li> Transkribieren der RNA TOL2 mit SP6 RNA - Polymerase aus dem linearisierten DNA mit einer handelsüblichen RNA - Transkription unter Verwendung von 13 - Kit. Lagern Sie die RNA in Einweg- Aliquots bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Einspritzmischung auf Eis durch Zugabe von 250 ng rag2: c-myc - Plasmid - DNA, 250 ng von rag2: GFP - Plasmid - DNA, 150 ng von TOL2 RNA und 0,5 &amp; mgr; l Phenolrot. Stellen Sie die Lautstärke auf 10 &amp; mgr; l mit Nuklease-freien Wasser. </li><li> Einzuzuspritzen ~ 1 nL Injektionsmischung in die Zelle von einem Ein-Zell-Stadium syngenen Zebrafischembryo mit einem Mikroinjektor und die Nadel aus einer Glaskapillare gezogen, folgenden zuvor estabVerfahren 8 , 14 . HINWEIS: Synogene Zebrafiken, die durch Parthenogenese 15 erzeugt werden, werden hier verwendet, um genetische Heterogenität und Immunabstoßung nach der Transplantation zu eliminieren. Jedoch kann auch Wildtyp-Zebrafisch oder irgendein gewünschter Stamm verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie tote, unterentwickelte oder fehlerhafte Embryonen bei 24 h und 48 h nach der Injektion 16 . </li><li> Legen Sie den Spritzfisch auf das Fischsystem bei 6 Tagen nach der Injektion und heben Sie sie nach Standardprotokoll 6 an . </li></ol></li><li> Screening injiziert Zebrafisch und Überwachung des Tumorwachstums <ol><li> Nach 21 Tagen nach der Injektion eine einzelne injizierte Larve in ein Tröpfchen Embryo-Medium auf eine Petrischale geben und GFP-Fluoreszenz mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop (Anregungsbandpass: 470/40, Emissionsbandpass: 525/50) 8 auftragen. HINWEIS: Zebrafisch-Larven, die have integriert sowohl rag2: c-myc und rag2: GFP wird einen grün fluoreszierenden Thymus (positiver Fisch) hat und bereits die Expansion maligner grün fluoreszierender Zellen außerhalb des Thymus aufweist. Alle Fische mit einem GFP + Thymus wird weitergehen ein GFP + T-ALL zu entwickeln. Die Larven, die keine grün fluoreszierenden Zellen (negativer Fisch) haben keine Integration der Plasmide demonstrieren. </li><li> Trennen Sie den negativen Fisch (basierend auf einem Mangel an Fluoreszenz) in einen anderen Tank und Monitor wieder die Fische bei 28 und 35 Tagen nach der Injektion. Bei 28 und 35 Tage nach der Injektion, betäuben die Fische mit 0,02% gepuffertem Tricaine (MS-222) in Fischsystemwasser vor dem Screening. </li><li> Platzieren Sie jede Zebrabärbling Larve, die für ein fluoreszierend markiertes Thymus oder einen fluoreszierend markierten Tumor in einem einzelnen Tank zur Überwachung von Tumorwachstum dreimal pro Woche positiv ist. </li></ol></li><li> Sammlung von fluoreszenz T-ALL - Zellen aus dem Primärtumor Fisch markierte <ol><li> Vorbereiten mindestens 20 ml 10% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum in 0.9x phosphatgepufferter Salzlösung (FBS / PBS). </li><li> 1 ml FBS / PBS auf ein Fläschchen von Heparin-Natriumsalz (300 Einheiten). </li><li> Wählen Sie Fisch Lager Tumoren in mehr als 50% des Körpers, oder jene Fische, die Schwierigkeiten beim Essen oder Schwimmen. Opfern, um die Fische, indem sie mit Tricaine oder durch Eiswasser Tauchdosierung. Bestätigen Tod durch Mangel eines Kiemen Bewegung und Herzschlag. </li><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge den Kopf des Fisches zu entfernen. </li><li> Wäscht den Hohlraum des Fisches mit der Heparin-Lösung überschüssige rote Blutzellen zu entfernen. <ol><li> Mit einer Pipette injiziert 100 ul Heparin-Lösung (hergestellt in Schritt 1.3.2) in die Körperhöhle des Fisches. Entfernt alle Flüssigkeit, die aus Leckagen (es wird Blutzellen enthalten) und Pipetten es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Verwenden Sie eine frische Pipettenspitze wieder in den Körper zu waschen. Führen mindestens drei Wäschen, oder bis die Flüssigkeit, die frei schwappt aus bl erscheintOod </li><li> Verwerfen Sie alle Flüssigkeiten aus den Waschungen in den Schritten 1.3.5.1 und 1.3.5.2, da sie nicht in weiteren Analysen verwendet werden. </li></ol></li><li> Sammle die Leukämiezellen. <ol><li> 100 μl FBS / PBS in die Körperhöhle des Fisches injizieren. </li><li> Tragen Sie sanften Druck auf die Außenseite des Körpers des Fisches mit der Pipettenspitze, um die Tumorzellen zu quetschen / herauszudrücken. HINWEIS: Wenn dieser Schritt mit einem Seziermikroskop durchgeführt wird, sind die aus der Körperhöhle verschütteten Tumorzellen offensichtlich. </li><li> Sammeln Sie die Flüssigkeit und die Zellen aus jeder Waschung in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6.1-1.3.6.3 bis die meisten Tumorzellen gesammelt werden (meist 5-10 mal). Sammle alle Tumorzellen in das gleiche 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Zellen bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Mischen Sie die gesammelten Tumorzellen aus Schritt 1.3.6 durch sanftes Pipettieren, um die Klumpen der Zellen zu dissoziieren. Filtriere die Zellsuspension durch eine 40 &amp; mgr; m-Mesh-Filter. Das Filter wird 1-2 mal mit 100 ul FBS / PBS. Halten Sie die Zellen bei Raumtemperatur. </li><li> Mix 2 &amp; mgr; l der Zellsuspension mit 18 ul Trypanblau (0,4%, 1:10 verdünnt und filtriert) in einem neuen Röhrchen. Last 10 &amp; mgr; l auf einem Hämozytometer und zählen die Anzahl der lebenden (non-blue) fluoreszierende Zellen die Anzahl der isolierten Tumorzellen zu berechnen. HINWEIS: Nicht-blau GFP-negative Zellen sind wahrscheinlich normal, nicht-malignen T-Zellen und nicht gezählt werden sollen. Mindestens 2 x 10 6 Zellen benötigt , um die Zellen mit Hoechst 33342 zu färben. </li></ol></li></ol> 2. Die Färbung der fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen mit Hoechst 33342 identifizieren die Seiten Bevölkerung <ol><li> Man verdünnt im Verhältnis 1:10 mit Hoechst 33342 Nuklease-freien H 2 O , die 1 mg / ml Arbeitskonzentration zu bilden. Speichert den Farbstoff bei 4 ° C und im Dunkel. </li><li> Vorbereiten eine 100-mM-Lösung von Verapamil durch Auflösen von 49,1 mg in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). HINWEIS: Verapamil ist ein Inhibitor von ABC-Transportern und ist eine wichtige Kontrolle für Nebenbevölkerungsexperimente. Das Hinzufügen von Verapamil zu Proben hemmt die Fähigkeit der ABC-Transporter, den Hoechst 33342-Farbstoff auszulöschen. Daher wird eine wahre Seitenpopulation verschwinden, wenn Verapamil dem Stichprobe hinzugefügt wird. </li><li> Wasserbad auf 28 ° C stellen. </li><li> Bereiten Sie Proben und Kontrollen im Dunkeln vor, indem Sie Zellen und Lösungen für fluoreszenzaktivierte Zellsortierer (FACS) Röhrchen hinzufügen. <ol><li> Bereiten Sie die Proben durch Zugabe von 10 6 Zellen, 15 μl 1 mg / ml Hoechst 33342 und 2,5 μl DMSO zu einem FACS-Röhrchen vor. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 mL mit FBS / PBS ein. </li><li> Bereiten Sie die Kontrollen vor, indem Sie 10 6 Zellen, 15 μl 1 mg / ml Hoechst 33342 und 2,5 μl 100 mM Verapamil zu einem FACS-Röhrchen hinzufügen. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 mL mit FBS / PBS ein. HINWEIS: Es wird ein Minimum von 10 6 Zellen / Probe empfohlen, aber die Färbung von mehr Zellen wird bevorzugt, besonders wenn die Seitenbevölkerung bevorzugt istIonen-Zellen werden zur weiteren Analyse sortiert. 10 6 Zellen / ml nicht überschreiten und die Hoechst 33342-Konzentration bei 15 μg / ml aufrechterhalten. Wenn 10 x 10 &amp; sup6; Zellen gefärbt sind, beträgt das Gesamtreaktionsvolumen 10 ml. </li></ol></li><li> In einem 28 ° C Wasserbad im Dunkeln für 120 min inkubieren. </li><li> Nach der Inkubation legen Sie die Zellen sofort auf Eis und halten sie im Dunkeln. </li><li> Pellet die Zellen bei 4 ° C für 6 min bei 300 x g. Den Überstand entfernen. Mit 1 ml FBS / PBS waschen. </li><li> Pellet die Zellen bei 4 ° C für 6 min bei 300 x g. Den Überstand entfernen. Resuspendieren der Zellen in 1 ml FBS / PBS. </li><li> Bei 4 ° C bis zur Zellsortierung aufbewahren. </li><li> 15 min vor der Zellsortierung 2 μl Propidiumjodid (PI) -Stand (1 mg / ml) zu je 1 ml FBS / PBS (Endkonzentration: 2 μg / ml) zugeben. Gut mischen. </li></ol> 3. Verwenden Sie FACS, um die Seitenbevölkerung innerhalb der fluoreszenzbeschrifteten T-ALLE Zellpopulation zu finden <ol><li&gt; Analysieren Sie die gefärbten Zebrafisch-T-ALL-Zellsuspensionen auf einem Zellsortierer, der mit einem UV-Laser für Hoechst 33342-Farbstoffanregung und einem 488-nm-Laser für die PI-Anregung und zum Nachweis der GFP + T-ALL-Zellen ausgestattet ist. </li><li> Bestimmen Sie ein Tor für die Live, GFP + T-ALL Zellen. <ol><li> Verwenden Sie Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC), um Schutt zu verteilen. HINWEIS: FSC wird verwendet, um Zellgröße zu unterscheiden und SSC wird verwendet, um die Granularität der Zelle zu unterscheiden. </li><li> Verwenden Sie FSC und SSC Breite, um Dubletten zu unterscheiden. HINWEIS: Es gibt drei Komponenten, die durch die Durchflusszytometer-Detektoren identifiziert werden: Fläche, Höhe und Breite. Der Bereich wird typischerweise verwendet, um die Fluoreszenz der Zelle zu messen. Breite misst die Flugzeit und ist doppelt so breit, wenn zwei Zellen zusammengeklammert sind. </li><li> Für lebende Tumorzellen zeichnen Sie ein Gate um die Zellen positiv für GFP und negativ für PI mit den entsprechenden Detektoren ( zB FITC für GFP und PerCP Cy5-5 für PI). </li></ol></li><li&gt; Im Live-Zelltor messen Sie die Hoechst 33342 Fluoreszenz durch die Hoechst Blue und Hoechst Red Bandpassfilter (450/50 bzw. 670/30). HINWEIS: Die Seitenpopulation, falls vorhanden, wird nach dem Aufstellen offensichtlich sein. Wichtig ist, dass die Seitenpopulation in der Verapamil-Kontrolle verschwinden muss, damit sie als eine echte Seitenpopulation angesehen wird. </li><li> Bei der Sortierung der Seitenpopulationszellen für weitere Experimente die große Düsenspitze (100 μm) verwenden und die Zellen in ein FACS-Röhrchen sammeln, das 3 ml 100% FBS enthält. Verwenden Sie eine größere Düsenspitze (100 μm) anstelle der kleineren Spitze (70 μm), um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Sortierung zu verbessern. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Seiten Population Assay ist hochempfindlich; Daher kleine Änderungen an dem Protokoll kann in Nachweisseitenpopulation Zellen in einer Schwierigkeit führen. Zuerst wird die Temperatur während des Färbeschritt spezifisch für jedes Tier / Zellensystem. Für Säugetiersystemen wird die Seitenpopulation Assay typischerweise bei 37 ° C 2 durchgeführt. Wenn die Zebrabärbling T-ALL-Zellen bei 37 ° C inkubiert wurden, starben viele der Zellen, die diese Inkubationstemperatur inakzeptabel gem...

Die Seiten Population Assay nutzt die verbesserte Fähigkeit bestimmter Zellen in einem Gewebe, das den DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 aufgrund des hohen Niveaus von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Transporter-Proteine ​​auf der Zellmembran Efflux. Die Zellen, die den Farbstoff Hoechst 33342 Efflux können duale Wellenlänge Durchflusszytometrieanalyse identifiziert werden, nachdem der Farbstoff durch einen UV-Laser angeregt wird. Dieser Test wurde zuerst 1 murinen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) zu identifizieren , verwendet, aber es seither verwendet Stamm- / Vorläuferzellpopulationen in vielen Geweben und Krebserkrankungen zu identifizieren (in Bezug auf 2 überprüft). Allerdings sind nicht alle Populationen von Zellen haben eine Seitenpopulation, und nicht alle sind für die Populationen Seiten Stamm- / Vorläuferzellen angereichert ist. Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges wirbel genetisches Modellsystem zur Untersuchung von menschlichem Krebs 3, 4, mit einer Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichem Maus - models von Krebs. Zebrabärblingembryonen werden extern befruchtet und sind optisch klar, erleichtert und die Transgenese in vivo Beobachtung von pathologischen Prozessen, einschließlich Krebs Initiierung und Progression. Bis heute zu den Seiten Population Assay potentiellen Stamm- oder Vorläuferzellen erkennen wurde lediglich an der Nierenmark in Zebrabärbling angewendet worden HSCs zu identifizieren, und nicht auf irgendwelche Zebrabärbling Krebsmodellen 5, 6. Der Zebrafisch Modell der T-Zell - akute lymphatische Leukämie (T-ALL) ist morphologisch und genetisch ähnlich der menschlichen T-ALL 7, 8, 11. T-ALL ist eine aggressive Bösartigkeit , die beim Menschen macht 10-15% der Kinder und 25% der erwachsenen alle Fälle 9. Während die Behandlung von T-ALL verbessert hat, ist Rückfall immer noch üblich und ist mit einer schlechten Prognose verbunden. T-ALL-Tumoren sind heterogeneous und enthält viele verschiedene Subpopulationen von Tumorzellen, einschließlich Leukämie initiierende Zellen (LICs). LICs ist durch ihre Fähigkeit definiert, um den gesamten Tumor aus einer einzelnen Zelle, und die Frequenz des LICs in einer Tumorzellpopulation nachwachsen kann durch Verpflanzen unterschiedliche Zell Dosen in Empfänger über eine Grenzverdünnung Transplantation Assay (LDA) berechnet werden. Während LDA Experimente haben in Zebrabärbling durchgeführt worden , um die Häufigkeit des LICs 8, 10, 11 zu berechnen, wird diese Feststellung im Nachhinein gemacht und für die Isolierung von prospektiven LICs nicht gestattet. Deshalb, um ein Verfahren prospektiv eine Population von Krebsstammzellaktivität angereichert zu isolieren fehlt. Identifizierung und Isolierung von Nebenpopulation Zellen von Zebrabärbling T-All ist der erste Schritt auf dem Weg, diesen Mangels Adressierung. Das Protokoll hier vorgestellten, wie effizient T-ALL-Tumoren in Zebr erzeugenafish Verwendung TOL2-vermittelte Transgenese, ernten die T-ALL-Zellen Tumoren und verfärben sie mit Hoechst 33342 die Seiten Population von Zellen zu identifizieren. Zukunft in - vivo - Experimente mit Zebrabärbling T-ALL könnten , ob die Seitenpopulation Zellen für LICs angereichert oder andere Stamm- oder Vorläuferähnlichen Eigenschaften.

<table><tbody><tr><td>Syngeneic zebrafish (CG2)</td><td></td><td></td><td>See Mizgireuv &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2006</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt;:c-myc plasmid</td><td></td><td></td><td>Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt;:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;rag2&lt;/em&gt; promoter from Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>pCS2-transposase plasmid</td><td></td><td></td><td>Chien Laboratory</td></tr><tr><td>NotI -HF restriction enzyme</td><td>New England Bio-Labs Inc.</td><td>R3189S</td><td>500 units in 25 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>Thermo Fisher Scientific - AM1340</td><td>25 reactions</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Inc.</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V8 Microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>495015-0008-000</td><td></td></tr><tr><td>Digital microinjector</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td></td></tr><tr><td>Brass straight-arm needle holder</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base and stand</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MN153</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td>10 cm without filament</td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf North America Inc.</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma Life Science</td><td>P0290</td><td>0.5% concentration 100 mL</td></tr><tr><td>Plastic Transfer pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>137119D</td><td>graduated 7.5 mL bulb</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td>Fisher Scientific - NC0342409</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>Fisher Scientific - SH3007103</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>1001-023</td><td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>15 - 300 unit vials</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m mesh filter</td><td>Falcon Corning Brand</td><td>352340</td><td>Case of 50</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8154</td><td>20 mL - Solution (0.4%)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma Life Science</td><td>V4629</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D8418</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Life Technologies</td><td>P3566</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>FACSAria Fusion cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

Heterogene Zellpopulationen, aus entweder gesund oder malignes Geweben, enthalten können eine Population von Zellen durch eine Differential Fähigkeit gekennzeichnet können den DNA-bindenden Farbstoff Hoechst 33342 Diese „Neben population“ von Zellen Efflux durchflusszytometrischen Verfahren nach dem Hoechst 33342 identifiziert werden, unter Verwendung von Farbstoff wird durch ein Ultraviolett (UV) Laser angeregt. Die Seiten Bevölkerung vieler Zelltypen enthält Stamm- oder Vorläuferähnlichen Zellen. Allerdings sind nicht alle Zelltypen haben eine identifizierbare Seiten Bevölkerung. Danio rerio, Zebrafisch, hat eine robusten in vivo Modell der T-Zell - akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL), aber ob dieser Zebrabärbling T-All hat eine Seitenpopulation ist unbekannt. Das hier beschriebene Verfahren beschreibt, wie die Seiten Bevölkerung Zellen in Zebrabärbling T-ALL zu isolieren. Um zu beginnen, die T-ALL in Zebrabärbling wird über die Mikroinjektion von TOL2 Plasmide in eine Zellstadium Embryonen erzeugt. Sobald die Tumoren, bei denen auf eine Stufe gewachsen erweitern sie in mehr als der Hälfte des animal der Körper, die T-ALL-Zellen können geerntet werden. Die Zellen werden dann mit Hoechst 33342 und untersucht durch Durchflußzytometrie für Seitenpopulation Zellen gefärbt. Dieses Verfahren hat breite Anwendungen in Zebrabärbling T-ALL-Forschung. Zwar gibt es keine bekannten Zelloberflächenmarker in Zebrabärbling , dass diese Nebenpopulation Zellen Krebsstammzellen-like, in vivo Transplantation funktionelle Assays sind möglich sind , bestätigen , ob. Darüber hinaus könnte Single-Cell-Transkriptomik die genetischen Merkmale dieser Seite Bevölkerung Zellen zu identifizieren, angewandt werden.

Um effizient zu fluoreszierenden myc-induzierte T-ALL-Tumoren in Zebrabärbling, zirkuläre DNA-Konstrukte, flankiert von TOL2 Transposase Seiten zu erzeugen kann mit TOL2 RNA coinjiziert. Frühere Studien von der Injektion von linearisierter DNA in Zebrabärblingembryonen berichten über eine 5% Transgene Rate 8. Mit dem Protokoll TOL2-vermittelte Transgenese umfassen angepasst und reicht Transgenität Raten von 10 bis 44% kann (Tabelle 1) beobac...

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Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Hier beschreiben wir eine Technik, die die Seitenpopulation Zellen aus einem Zebrabärbling Modell der myc-induzierten T-Zell-akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) zu isolieren. Diese Seite Bevölkerung Test ist hochempfindlich und wird für Zebrabärbling T-ALL beschrieben, aber es kann auch auf andere maligne und nicht-maligne Zebrabärbling Zelltypen anwendbar.

Die Isolierung der Seiten Bevölkerung in Myc-induzierte T-Zell akute lymphatische Leukämie in Zebrabärbling

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K Aufrufe.  The University of Chicago.  Hier beschreiben wir eine Technik, die die Seitenpopulation Zellen aus einem Zebrabärbling Modell der myc-induzierten T-Zell-akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) zu isolieren. Diese Seite Bevölkerung Test ist hochempfindlich und wird für Zebrabärbling T-ALL beschrieben, aber es kann auch auf andere maligne und nicht-maligne Zebrabärbling Zelltypen anwendbar. 

Serie: Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Entwicklungsbiologie

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

<meta charset="utf8"></head><body>Abschätzung der LSC-Häufigkeit in Zebrafisch-T-ALL mit Hilfe der Zellproliferationsfarbstoffsortierung

Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect CSCs from antiproliferative chemotherapy drugs. In T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) patient-derived xenograft (PDX) mouse models, quiescent cells are associated with treatment resistance and stemness. Cell proliferation dyes are popular tools for the tracking of cell division. The fluorescent dye is covalently anchored into amine groups on the membrane and macromolecules inside the cell. This allows for the tracking of labeled cells for up to 10 divisions, which can be resolved by flow cytometry.
Ultimately, cells with the highest proliferation rates will have low dye retention, as it will be diluted with each cell division, while dormant, slower-dividing cells will have the highest retention. The use of cell proliferation dyes to isolate dormant cells has been optimized and described in T-ALL mouse models. Complementary to the existing mouse models, the rag2:Myc-derived zebrafish T-ALL model provides an excellent venue to interrogate self-renewal in T-ALL due to the high frequency of leukemic stem cells (LSCs) and the convenience of zebrafish for large-scale transplant experiments.
Here, we describe the workflow for the staining of zebrafish T-ALL cells with a cell proliferation dye, optimizing the concentration of the dye for zebrafish cells, passaging successfully stained cells in vivo, and the collection of cells with varying levels of dye retention by live cell sorting from transplanted animals. Given the absence of well-established cell surface makers for LSCs in T-ALL, this approach provides a functional means to interrogate quiescent cells in vivo. For representative results, we describe the engraftment efficiency and the LSC frequency of high and low dye-retaining cells. This method can help investigate additional properties of quiescent cells, including drug response, transcriptional profiles, and morphology.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Identifizierung und Isolierung von ruhenden Leukämie-Stammzellen aus Zebrafisch-T-ALL

We used cell proliferation staining to identify quiescent cells in the zebrafish T-acute lymphoblastic leukemia model. The stain is retained in non-dividing cells and reduced during cell proliferation, enabling the selection of dormant cells for further interrogation. This protocol provides a functional tool to study self-renewal in the context of cellular quiescence.

Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung 

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect ...

Krebsforschung

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Biologie

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

Bösartig und B-Zellen nicht bösartig aus Lck:eGFP Zebrafisch zu isolieren

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Die Isolierung der Seiten Bevölkerung in Myc-induzierte T-Zell akute lymphatische Leukämie in Zebrabärbling

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung

Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung

Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung

Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Bösartig und B-Zellen nicht bösartig aus Lck:eGFP Zebrafisch zu isolieren