Yazarlar kanda nitrit ölçümleri için nitrit koruyarak çözeltisinin kullanımı gelişmekte olan Dr. A. Dejam ve MM Pelletier kritik katkıları kabul etmek istiyorum.

Hayvanların kullanımını dahil olmak üzere tüm protokoller NIDDK Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kullanılmak üzere onaylanmış ve insan kan sağlıklı donörlerden NIH Kan bankasından elde edilmiştir. 1. Numune Hazırlama <ol><li> Nitrit koruyucu çözeltisinin hazırlanması <ol><li> 890 mM potasyum ferrisiyanür ihtiva eden bir çözelti hazırlayın (K3Fe (CN) 6) ve damıtılmış su içinde 118 mM NEM (N-etilmaleimit). mevcut hiçbir kristalleri ile sarı netleşene kadar iyi çözülür. 9 oranı (h / h, NP-40 / çözelti) bir 1: NP-40 (oktil phenoxylpolyethoxylethanol) ekleyin. ) Yaklaşık bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de köpürme ve mağaza önlemek için yavaşça karıştırın. </li></ol></li><li> Toplama ve kan örneklerinin hazırlanması <ol><li> pıhtılaşmayı (5 U / ml) önlemek için heparin ile hemoliz önlemek için en azından bir 20 G iğne kullanılarak kan toplayın. (4 oranında v: Tam kan örneği için, nitrit 1 hemen çözüm koruyarak ile kan mix/ Hac çözeltisi / kan). </li><li> plazma ve kırmızı kan hücreleri numuneler için, santrifüj, 4 ° C&#39;de 4000 x g&#39;de 5 dakika boyunca alınan kan, kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ve plazma ayrılır. Süpernatant (plazma) almak ve plazma nitrit düzeylerinin belirlenmesi için, yukarıda tarif edildiği gibi nitrit çözeltisi korunması ile karıştırın. </li><li> Dikkatli bir kesme pipet kullanarak kan hücrelerinin diğer türlerine göre kirlenmesini önlemek için borunun alt numune ve pipet eritrosit numunesinden plazmanın ve buffy coat kalan kaldırmak ve aynı nitrit koruyucu çözeltisi içeren bir tüp içine transfer yukarıdaki gibi oranı. </li><li> 1 ya da 1: oranında 1 soğuk metanol ile her bir örnek (plazma ve RBC) karıştırın 2 (h / h örneği / metanol) ve proteinleri çökeltmek için 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 13,000 x g&#39;de santrifüj. -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza, gerekirse, süpernatant atın ve nitrit ölçümü için kullanmak ya da hazırlanmış örnekleri dondurma. Not: Nitrit hızla reakan yapıcı nitrat oksihemoglobin (oxyHb) ile cts. oxyHb her nitrit üzerinde daha büyük miktarda mevcut olduğu için, bu reaksiyon, 10 dakika aralığında bir süre ile ana kan nitrit neredeyse tamamen yok olmasına yol açar. endojen kan nitrit en korumak amacıyla, nitrit koruyucu çözelti hemen kan alımından sonra tam kan numuneleri ilave edilir. Çözelti hızla kimyasal nitrit ile reaksiyona girmeyen hemoglobin etkin olmayan bir biçimi, kırmızı kan hücrelerinin lize edildi ve methemoglobin (metHb) içine oxyHb okside olur. </li></ol></li><li> Diğer türlü vücut sıvısı örneklerinin hazırlanması <ol><li> Uygun bir kap içine numune toplama sonra, nitrit koruyarak çözüm, deproteinate ile iyice karıştırın ve hemen ölçmek veya -80 ° C&#39;de dondurulması ve depolanması. </li></ol></li><li> Toplama ve doku örneklerinin hazırlanması <ol><li> heparinize tuzlu su çözeltisi (10 U HEPA ile perfüze hayvanlardan dokuları toplayınrin / ml). istenen dokuya tüketim 1 g homojen ya elle homojenleştirici veya otomatik homojenleştirici kullanılarak. </li><li> düz Homojenat elde etmek için gerektiği kadar çözelti koruyucu nitrit bilinen miktarda ekleyin. </li><li> 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de yukarıda tarif edildiği gibi (2 oranı hacim / hacim Örnek / metanol: 1 ya da 1: 1), 13000 x g hızında daha sonra santrifüj örnekleri dokusu homojenize sonra soğuk metanol kullanılarak proteinlerin çökeltilmesi. </li><li> süpernatant ve tedbir nitrit seviyelerini toplayın. Gerekirse, -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza hazırlık herhangi bir aşamasında örnekleri dondurma. </li></ol></li></ol> Çözümler Azaltma 2. Hazırlık <ol><li> Tri-iyodür (I 3) nitrit ve R (x) = NO türlerinin tespiti 1,3,4 çözüm indirgeme <ol><li> Su içinde 138 mM I 2 çözeltisi ile birlikte 301 mM KI bir çözelti hazırlayın. Tüm kadar ~ 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde 7 oranında (hacim / hacim çözeltisi / asit): 2, buzlu asetik asit ile karıştırınKristaller eritilir. Tercihen iyodür ışığa duyarlı olarak, karanlık şişe tutmak ve hazırlık itibaren bir hafta içinde kullanın. Not: Bu çözüm NO içine Nitrit azaltacak ve aynı zamanda R-SNO, R-nHayır ve Fe-NO fonksiyonel gruplar (R (X) = NO) NO yayınlayacak, ancak nitrat etkilenmeyecektir. Yukarıdaki NO bazlı fonksiyonel grup sinyal asitleştirilmiş sülfanilamid (AS) ve AS-muamele karşılaştırılması ve işlenmemiş sinyal ile numunenin yarısının işlenerek gerçek nitrit sinyalinden ayrılabilir. Geri dönülmez bir şekilde nitrit ile diazonyum katyonu oluşturan ve bu kompleks bir 3 çözeltisi ile indirgenemez. AS tedavisi için, 1 M HCl in sülfanilamid 290 mM&#39;lik çözelti hazırlayın ve 1 oranında örneğinin bir bölümüne ekleyin: 9 (h / h AS / numune). örnek AS-tedavi edilen ve edilmeyen bölgelerinde CL sinyali ölçer. örnek AS-tedavi edilen ve edilmeyen kısmının bir fark olarak, gerçek nitrit sinyali hesaplayın. Nitrit, aynı zamanda, seçici bir NIT kullanılarak ölçülebilirayin indirgeyici parça 2.2 de tarif edildiği gibi, askorbik / asetik asit karışımı çözeltisi. Bununla birlikte, -NO tür mevcut R- (X) genellikle az miktarda AS işlenmemiş numuneler kullanılarak ölçümler toplam nitrit çok iyi bir yaklaşım çoğu durumda bağlı. </li></ol></li><li> Nitrit 2 seçici belirlenmesi için askorbik asit / asetik asit (4A) çözeltisi <ol><li> su içinde 500 mM askorbik asit hazırlayın. Reaksiyon karışımı hazırlamak için 7 (h / h, askorbik asit / asetik asit): bir oranda 1 buzlu asetik asit ile çözelti karıştırın. Not: Bu çözelti, nitrit için spesifik olan, herhangi bir R (x) = NO türlerinin ya da nitrat NO bırakmayacaktır. askorbik asit, kolay bir çözelti içinde okside Ancak, askorbik ve asetik asit solüsyonu, her gün ölçümleri yapılmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır. nitrit azaltma tamamlanması askorbik asit konsantrasyonuna bağlıdır; ve en az 50 mm askorbik asit, tam bir R önerilirPlazma nitrit eduction. Bununla birlikte, önceki son örnek ölçümleri beklenen nitrit konsantrasyon aralığında, askorbik asit ve nitrit standartları farklı konsantrasyonları ile birkaç pilot deneyleri için tavsiye edilir. askorbik asit biraz ölçümler sırasında tüketir unutmayın, cam reaksiyon odasındaki reaksiyon karışımının çok sık değişiklikler tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Nitrat belirlenmesi 9 Vanadyum (III) klorid indirgeme çözeltisi <ol><li> 1 M HCl içinde VCL 3 51 mM çözeltisi hazırlayın. Karanlık bir şişe 200 mikron filtre ve mağaza üzerinden filtre çözümü, iki hafta içinde kullanın. Not: Bu çözüm nitrat, nitrit ve tüm R (X) = NO türleri azaltacaktır, böylece hesaplanacak nitrit veya diğer R- kıyaslanabilir miktarda (X) = NO türlerinin beraberce nitrat ile mevcut, son nitrat içeriği varsa vcl 3 ve I elde edilen CL sinyalleri arasındaki fark olarak3 çözüm azaltır. </li></ol></li></ol> 3. Kemilüminesans (CL) Çözümleyici Kurulumu ve Ölçümler <ol><li> Standart çözüm <ol><li> Sodyum nitrit 1 mcM çözeltisi (NaNO 2) hazırlayın. Aynı çözelti, nitrit ve nitrat belirlemeleri için kullanılabilir. </li></ol></li><li> YOK analizörü kullanarak Not: Şu anda biyolojik araştırma amaçlı yeterince duyarlı iki piyasada mevcut hiçbir analiz vardır - Sievers NOA ve Ecophysics CLD 88Y. Her ikisi de aynı prensiple çalışır; Temel fark, CLD 88Y ozon yapmak için oda havadan oksijen kullanır (O 3), NOA, bu amaç için bir dış oksijen tankı gerektiren ise. Aşağıdaki prosedür Sievers NOA için setini açıklar. <ol><li> enstrüman kurulum <ol><li> üretici tavsiyelerine göre YOK analizör ilk kurulum gerçekleştirinolarak Şekil 1&#39;de görülen. </li><li> Cihaza bağlı Açık O 2 tankı. &quot;Analizi&quot; seçin ve ön paneldeki ana menüden &quot;enter&quot;. Bir sonraki ekranda seçim &quot;start&quot; basın &quot;girin.&quot; Şekil 1 &#39;de görüldüğü gibi, cihaza (1 M NaOH içeren) asit tuzak bağlayın. </li><li> photomultiplier -12 ° C&#39;nin altında sıcaklığa soğur ve reaksiyon haznesi 6 Torr tahliye kadar bekleyin. Istikrarlı bir düz taban çizgisini ulaşmak için yaklaşık 30 dakika sürer. Bazal 1 içinde stabilize ihtiyacı - 2 mV, nominal değeri istikrarı daha az önemlidir. Not: nitrat ölçülür, soğutma (asit ve su buharları gibi soğuk tuzak hizmet veren 4 ° C&#39;de set) su banyosu ve ısıtma suyu banyosu (ana reaksiyon haznesi, 95 ° C) açın. Vcl 3 çözeltide içine nitrat indirgeme oranı sıcaklığa bağlıdır ve bu oda Tempe çok yavaşrature, sıcaklık bu nedenle önemli bir artış reaksiyon gözlemlemek için gereklidir. </li><li> O tankı açın ve Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi asit tuzak cam reaksiyon odasına bağlayın. Uygun indirgeme çözeltisi ile reaksiyon haznesine doldurmak minimuma kabarcık oluşumunu azaltmak ve asit yakalamak için, reaksiyon odası bağlayın. deneme ve yanılma yöntemiyle, enstrüman emme oranı (Siever en NOA için genellikle ~ 200 ml / dk) eşleşecek O köpürme oranını ayarlayın. </li><li> Cihazı kontrol Bilgisayarı açın ve Labview tabanlı sıvı yazılımını başlatın. alet ve satın alma yazılımı, basın arasındaki iletişim açmak için ekran okuyana kadar &quot;veri menüsünden&quot; in &quot;çıkış aktif&quot;, o zaman &quot;net&quot; tuşuna veri ekranına geri dönmek için &quot;enter&quot;. </li><li> Ekranda istikrarlı bir temel iz bekleyin ve septum yoluyla çözüm azaltarak içine örnekleri ve nitrit standartlarını enjekte başlar. Her zaman istikrarlı bir temel kıç ulaşmak için sabırsızlanıyorumzirveye er. Bu 2 dakika kadar sürebilir. Sıvı yazılım enjeksiyon bir seçenek için &quot;işareti&quot; kat vardır ve enjeksiyon açıklama ve veri dosyası (filename.data) için yararlı bir tamamlayıcısı olarak ayrı bir dosya (filename.info) içine bu yorumları ihraç edecek. </li><li> Numuneler ve standartlar ölçülür kez, seçim Sıvı yazılım menüsünde &quot;dur&quot; - bu &quot;filename.data&quot; olarak bilinen kalıcı bir dosyaya geçici bir dosyaya veri yazar. Basmak &quot;iptal&quot; seçeneği kalıcı dosyaya edinilen verileri yazmadan ölçüm sonlanacaktır. </li><li> Deney sona reaksiyon kabının üzerine musluğunu kapatarak reaksiyon kabından makine kesin ve asit tutucu ve reaksiyon kabı arasındaki boru bağlantısını kesmek için (Şekil 1 e bakınız). Şimdi NOA analizörü durdurmak - Basın &quot;net&quot;, &quot;bekleme&quot; ve &quot;onayla&quot; bekleme makineyi koymak &quot;analiz&quot;, gidin. Düzenli olarak kullanıldığındaenstrüman birkaç hafta bekleme modunda kalabilir. oksijen kaynağını kapatın. Daha sonra reaksiyon haznesi, kesmek gelen azaltılması çözüm yıkayın ve cam reaksiyon kabından O tankı kapatın ve reaksiyon kabı temizliği bitirmek. </li></ol></li><li> Standartlar ve örnek enjeksiyonları <ol><li> iyi yıkandı, Hamilton şırıngası kullanarak reaksiyon karışımı içerisindeki 1 uM nitrit çözeltisinin 50 ul enjekte edilir. piklerin iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak için enjeksiyonlar arasında 2 dakika - en az 1 bekleyin. 50 ul enjeksiyon tekrarlayın her bir veri noktasına kopyalarını elde etmek. Her enjeksiyondan sonra, iyonu giderilmiş su ile şırınga yıkayın. </li><li> 1 uM nitrit çözeltisi 100, 150 ul yinelenen enjeksiyonları ile devam standart eğri için veri tam set elde etmek için (nitrit veya nitrat yüksek konsantrasyonlarda bekleniyor, ek 200 ul gerektirir). Her durumda, sinyal başlangıca geri düşene kadar beklemek özen ve sonra 1 kazanmak - 2 milBaşlangıçta n zirvelerinden iyi ayrılmasını sağlamak için. Not: Nitrit standartları deneyler sırasında herhangi bir zamanda ölçülebilir. Ayrıca, gösterge işlevselliği bağımsız bir kontrol olarak hizmet eder Ancak, veri ölçümü önce standart bir eğri elde etmek için tercih edilir. verilerin toplandığı zaman, numune miktarı iyi telaffuz zirveleri gitmelidir enjekte edilir. Ancak photomultiplier, sadece ~ 800 mV kadar doğrusal olduğu akılda tutulmalıdır böylece zirve hiçbiri ~ 700 mV daha yüksek olmalıdır. Bu miktar enjekte numunenin azaltılması ya da deiyonize su ile örnek seyreltilmesi yoluyla elde edilebilir. Her bir nokta iki kez, en azından ölçülmelidir. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Nitrite+in+Blood+Samples+Using+the+Ferricyanide-Based+Hemoglobin+Oxidation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay.</a> Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Nagababu, E., Rifkind, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+nitrite+by+chemiluminescence+without+interference+of+S-%2C+N-nitroso+and+nitrated+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species.</a> Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).</li>
<li>Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinder%2C+AG+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Redox-Mediated+Signal+Transduction%22">Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction</a>. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).</li>
<li>Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+blood+and+plasma+nitrite+by+chemiluminescence%3A+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions.</a> Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).</li>
<li>Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+circulating+nitrite+and+S-nitrosothiols+by+reductive+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B%22%5BJournal%5D)">Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence.</a> J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).</li>
<li>Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+gas-phase+chemiluminescence+and+flow+injection+analysis+for+measurement+of+nitric+oxide+pool+in+biological+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices.</a> Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).</li>
<li>Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+the+sensitive+and+specific+measurement+of+S-nitrosothiols%2C+iron-nitrosyls+and+Nitrite+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples.</a> Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).</li>
<li>Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+serum+nitrate%2C+a+stable+end+product+of+nitric+oxide%2C+in+women+with+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li>
<li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%3A+A+companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li>
<li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroprotocols%3A+A+companion+to+Methods+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li>
</ol>

Dr Alan Schechter kardiyovasküler hastalıkların tedavisi için nitrit tuzlarının kullanılması Ulusal Sağlık Enstitüleri verilen çeşitli patentler ortak mucidi olarak listelenir. O klinik gelişim ama başka tazminat Bu patentlerin NIH lisans dayalı telif alır.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar orijinal numune hazırlanması, seyreltik ya da tedavi etmek için kullanılabilir (su dahil) çözeltiler alikoları kaydedilmesi gerekir ve olası nitrit ya da (daha çok) nitrat kirlenme kontrol etti. Çoğu kirlenme su gelir ve bir çok kimyasal endojen nitrat belirlenmesine müdahalede bulunan bir çok nitrat kirlilik önemli bir miktarını ihtiva örnek (özellikle ferrisiyanür) tedavisinde kullanılan bulundu. Biz düzenli deneyde kullanmadan ön...

Nitrit ve daha az uzatmak nitrat, kandaki düzeyleri vücutta genel devlete YOK metabolizmasını yansıtmaktadır. mikromolar - nitrit kandaki konsantrasyonu ve en çok organ ve dokuların sadece yüksek nanomolar ya da düşük mikromolar, nitrat çok daha yüksek miktarlarda, genellikle mevcut bulunmaktadır. nedeniyle hastalığın ilerlemesi nitrit düzeylerindeki değişiklikler veya diyet alışkanlıklarındaki değişiklikler oldukça küçük ve sadece çok hassas bir yöntem kullanılarak ölçülebilir. Çünkü onların çok farklı düzeylerde ve farklı metabolik süreçlerin, nitrit ve nitrat düzeyleri ayrı belirlenmesi esastır. Nitrit ve nitrat birlikte ölçülen çok az değere sahip olan &quot;NO x belirlenmesi&quot; olarak adlandırılan. Çeşitli biyolojik numunelerde nitrit ölçülmesi için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir - En yaygın başlangıçta bile, modern modificatio ile 1879 yılında açıklanan olmuştu Griess reaksiyonu dayalı, eski bir varlıkNS, Griess &#39;yöntemiyle elde edilebilen nitrit duyarlılık sınırı düşük mikromolar arasındadır. Tri-iyodür çözeltisi azaltılması ile birlikte Kemilüminesans (CL), şu anda nitrit konsantrasyonlarının 1-8,10,11 düşük nanomolar aralığında sayılmasına olanak tanıyan, en hassas yöntem olarak kabul edilir. Vanadyum (III) klorür çözeltisi azaltılması ile birlikte, aynı CL yöntem olup, nanomolar aralıkta 9 hassasiyetle, nitrat, hassas ölçümler için de kullanılabilir. CL ücretsiz gaz NO algılar. Bu nedenle, nitrit, nitrat, R-nitrozo tiyol (R TARGET), R NİTROSOAMİNLERİN (R NNO), ya da metal-NO bileşikleri (daha sonra el yazması olarak anılacaktır &quot;R- (X) = NO&quot;), dönüştürülmelidir CL aracılığıyla kendi özgün miktarlarda ölçmek için NO gazı boşaltın. NO dönüşüm NO metabolitin doğasına bağlı olarak, çeşitli indirgeyici çözüm kullanılarak elde edilir. Dönüştürmeden sonra, kuru NO gazı bir taşıyıcı gaz (O, N, reaksiyon kabından temizlenir2 veya ozon (O 3), azot dioksit oluşturmak üzere NO ile birleştirilir CL analizörünün reaksiyon haznesine, Ar) (NO 2), aktive edilmiş bir halde. Zemin durumuna dönüşü ile, NO 2 * kızılötesi bölgede yayar ve yayılan foton CL aracının photomultiplier (PMT) tarafından tespit edilir. yayılan ışığın yoğunluğu, uygun bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak, orijinal türlerin konsantrasyonunun hesaplanmasını sağlar tepkime haznesi NO konsantrasyonu ile doğrudan orantılıdır. Protokolde, biz en çok kullanılan klinik ortamlarda nitrit ve nitrat ilk bugünkü CL-bazlı tayininin - kan ve plazmada, ve sonra biz doku örneklerinde bu iyonları nasıl belirleneceği tartışmak. Biz de böyle bir kan ve bölmeleri, plazma ve kırmızı kan hücreleri olarak nitrit-reaktif ortamlarda, orijinal fizyolojik nitrit konsantrasyonunu korumak için nasıl ayrıntılı olarak açıklar.

<table><tbody><tr><td>potassium ferricyanide; K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide; AS&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid, glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>potassium iodide; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>iodine; I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>light sensitive, toxic</td></tr><tr><td>sodium nitrite; NaNO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>vanadium(III) chloride; VCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>ligt sensitive, toxic</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&amp;nbsp;Ecophysics&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

Nitrik oksit (NO) damar homeostazının ve aynı zamanda bir nörotransmiter ana düzenleyici moleküllerin biridir. Enzimatik olarak üretilen NO çeşitli oksi-heme proteinleri ve diğer hala iyi bilinmemektedir yollar ile etkileşimleri tarafından nitrit ve nitrat içine oksitlenir. Ters işlem, NO içine nitrit ve nitrat indirgeme son on yılda memelilerde keşfedildi ve o önlemek veya düşünülen kardiyovasküler, metabolik ve kas hastalıklarının bir dizi kolaylaştırmak için ya olası yolların biri olarak dikkat kazanıyor NO azalan düzeyleri ile bağlantılı olabilir. kan, vücut sıvıları ve çeşitli dokularda - Farklı vücut bölümlerinde NO ve metabolitlerinin miktarını tahmin etmek önemlidir. Kan, nedeniyle kolay erişilebilirlik, NO metabolitlerinin tahmini için kullanılan tercih edilen bölme olduğunu. Nedeniyle kısa ömrü (birkaç milisaniye) ve düşük alt nanomolar konsantrasyonu NO kan direkt güvenilir ölçümler &lt;em&gt; in vivo mevcut büyük bir teknik zorluklar. Böylece YOK kullanılabilirlik genellikle oksidasyon ürünleri, nitrit ve nitrat miktarına dayalı tahmin edilmektedir. Bu iki metabolitler her zaman ayrı ayrı ölçülür. biyolojik sıvılar ve dokular konsantrasyonlarını belirlemek için çeşitli iyi bilinen yöntem bulunmaktadır. Burada, sırasıyla üç iyodür veya vanadyum (III) klorür çözeltileri, nitrit veya nitrat indirgeme sonrası NO spektrofotometrik tespit göre, kemilüminesans yöntemi (CL) için bir protokol mevcut. nitrit ve nitrat tespiti için duyarlılık YOK metabolik yollarda değişiklikleri belirlemek için şu anda mevcut en hassas yöntem olarak CL setleri düşük nanomolar aralığında yer almaktadır. Biz örneklerinde kendi miktarlarını belirlemek için toplanması ve nasıl sırasında nitrit ve nitrat mevcut orijinal miktarda korumak için biyolojik sıvılarda ve dokulardan örnekler nasıl hazırlanacağını ayrıntılı olarak açıklar. CL tekniğinin sınırlamalar da exp vardırLained.

Şekil 2, standart ve beş farklı numune toplanmıştır Örnek sonuçlarını gösterir. Bu Şekilde gösterildiği gibi, photomultiplier gerilim artar nitrit içeren çözelti (standartları veya numune) çözümü azaltılması enjekte edilir hemen sonra başlangıç ​​değerine ve getiri enjekte kez tüm nitrit mevcut (enjeksiyon kez kırmızı eğrinin altında oklarla gösterilir) çözelti düşürülmüştür. Ayrıca, doğru hacim ölçümü yüksek tekrarl...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method at JoVE.com

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu&#39;ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

measuring-nitrite-nitrate-metabolites-nitric-oxide-pathway-biological

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

22.4K Görüntüleme.  NIDDK, NIH. Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Video: Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted mechanism of metabolic activation involves formation of &#945;-hydroxynitrosamines that spontaneously decompose to DNA alkylating agents. Accumulation of DNA damage and the resulting mutations can ultimately lead to cancer. New evidence indicates that &#945;-hydroxynitrosamines can be further oxidized to nitrosamides processively by cytochrome P450s. Because nitrosamides are generally more stable than &#945;-hydroxynitrosamines and can also alkylate DNA, nitrosamides may play a role in carcinogenesis. In this report, we describe a general protocol for evaluating nitrosamide production from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines. This protocol utilizes a general approach to the synthesis of the relevant nitrosamides and an in vitro cytochrome P450 metabolism assay using liquid chromatography-nanospray ionization-high resolution tandem mass spectrometry for detection. This method detected N&#8242;-nitrosonorcotinine as a minor metabolite of N&#8242;-nitrosonornicotine in the example study. The method has high sensitivity and selectively due to accurate mass detection. Application of this method to a wide variety of nitrosamine-cytochrome P450 systems will help determine the generality of this transformation. Because cytochrome P450s are polymorphic and vary in activity, a better understanding of nitrosamide formation could aid in individual cancer risk assessment.

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

&#945;-hydroxylation of carcinogenic nitrosamines by cytochrome P450s is the accepted metabolic pathway that produces DNA-damaging intermediates, which cause mutations. However, new data indicates further oxidation to nitrosamides can occur. We describe a general method for detecting nitrosamides produced from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines.

Nitrosamide oluşumu nitrozaminler sitokrom P450s tarafından in Vitro metabolizma saptamak için bir genel yöntem

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Kanser Araştırmaları

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

Laboratuvar İlaçlama haşere kontrolü ile nitrik oksit gaz için prosedürleri

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

Çevre

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Tıp

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH oxidase has critical signaling functions that modulate the inflammatory response 1. Thus, the development of a method to measure in "real-time" the kinetics of NADPH oxidase-derived ROS generation is expected to be a valuable research tool to understand mechanisms relevant to host defense, inflammation, and injury.
Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder of the NADPH oxidase characterized by severe infections and excessive inflammation. Activation of the phagocyte NADPH oxidase requires translocation of its cytosolic subunits (p47phox, p67phox, and p40phox) and Rac to a membrane-bound flavocytochrome (composed of a gp91phox and p22phox heterodimer). Loss of function mutations in any of these NADPH oxidase components result in CGD. Similar to patients with CGD, gp91phox -deficient mice and p47phox-deficient mice have defective phagocyte NADPH oxidase activity and impaired host defense 2, 13. In addition to phagocytes, which contain the NADPH oxidase components described above, a variety of other cell types express different isoforms of NADPH oxidase.
Here, we describe a method to quantify ROS production in living mice and to delineate the contribution of NADPH oxidase to ROS generation in models of inflammation and injury. This method is based on ROS reacting with L-012 (an analogue of luminol) to emit luminescence that is recorded by a charge-coupled device (CCD). In the original description of the L-012 probe, L-012-dependent chemiluminescence was completely abolished by superoxide dismutase, indicating that the main ROS detected in this reaction was superoxide anion 14. Subsequent studies have shown that L-012 can detect other free radicals, including reactive nitrogen species 15, 16. Kielland et al. 16 showed that topical application of phorbol myristate acetate, a potent activator of NADPH oxidase, led to NADPH oxidase-dependent ROS generation that could be detected in mice using the luminescent probe L-012. In this model, they showed that L-012-dependent luminescence was abolished in p47phox-deficient mice.
We compared ROS generation in wildtype mice and NADPH oxidase-deficient p47phox-/- mice 2 in the following three models: 1) intratracheal administration of zymosan, a pro-inflammatory fungal cell wall-derived product that can activate NADPH oxidase; 2) cecal ligation and puncture (CLP), a model of intra-abdominal sepsis with secondary acute lung inflammation and injury; and 3) oral carbon tetrachloride (CCl4), a model of ROS-dependent hepatic injury. These models were specifically selected to evaluate NADPH oxidase-dependent ROS generation in the context of non-infectious inflammation, polymicrobial sepsis, and toxin-induced organ injury, respectively. Comparing bioluminescence in wildtype mice to p47phox-/- mice enables us to delineate the specific contribution of ROS generated by p47phox-containing NADPH oxidase to the bioluminescent signal in these models.
Bioluminescence imaging results that demonstrated increased ROS levels in wildtype mice compared to p47phox-/- mice indicated that NADPH oxidase is the major source of ROS generation in response to inflammatory stimuli. This method provides a minimally invasive approach for "real-time" monitoring of ROS generation during inflammation in vivo.

NADPH oxidase is the major source of reactive oxygen species (ROS) in phagocytes. Because of the ephemeral nature of ROS, it is difficult to measure and monitor ROS levels in living animals. A minimally invasive method for serial quantification of ROS in living mice is described.

Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Biyolojik ortamda oluşturuluyor ve Gözlem Kemilüminesans için Yeni Bir Teknik

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Biyomühendislik

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Biyoloji

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the effects of nitrosated compounds. Measuring NO metabolites is essential to studying NO activity both at vascular levels and in other tissues, especially in the experimental settings where exogenous NO is administered. Ozone-based chemiluminescence assays allow precise measurements of NO and NO metabolites in both fluids (including plasma, tissue homogenates, cell cultures) and gas mixtures (e.g., exhaled breath). NO reacts with ozone to generate nitrogen dioxide in an excited state. The consequent light emission allows photodetection and the generation of an electric signal reflecting the NO content of the sample. Aliquots from the same sample can be used to measure specific NO metabolites, such as nitrate, nitrite, S-nitrosothiols, and iron-nitrosyl complexes. In addition, NO consumed by cell-free hemoglobin is also quantified with chemiluminescence analysis. An illustration of all these techniques is provided.

Here, we present protocols for detecting nitric oxide and its biologically relevant derivatives using chemiluminescence-based assays with high sensitivity.

Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Genetik Kodlanmış Floresan Nitrik Oksit Uygulama (• NO) Tek Hücrelerde YOK • Sinyallerin Gerçek zamanlı Görüntüleme için sondalar, geNOps,

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu'ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet