Autoren wollen bei der Entwicklung der Verwendung von Nitrit Konservierungslösung für die Nitrit-Messungen in Blut kritischen Beiträge von Dr. A. entstören und MM Pelletier zu bestätigen.

Alle Protokolle Verwendung von Tieren, einschließlich wurden für die Verwendung von NIDDK Animal Care und Use Committee genehmigt und menschlichem Blut wurde aus NIH Blutbank von gesunden Spendern erhalten. 1. Probenvorbereitung <ol><li> Herstellung von Nitrit Konservierungslösung <ol><li> Bereiten einer Lösung , die 890 mM Kaliumferricyanid (K 3 Fe (CN) 6) und 118 mM NEM (N-Ethylmaleimid) in destilliertem Wasser. Man löst gut, bis es keine Kristalle vorhanden gelb klar. In NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) in einer 1: 9-Verhältnis (v / v, NP-40 / Lösung). Vorsichtig mischen zu vermeiden, Schäumen und lagern bei 4 ° C für etwa eine Woche). </li></ol></li><li> Sammlung und Aufbereitung von Blutproben <ol><li> Sammeln Blut unter Verwendung mindestens eine 20 G Nadel Hämolyse mit Heparin zu vermeiden Koagulation (5 U / ml) zu verhindern. Für die Vollblutprobe, mischen Blut mit Nitritlösung sofort in einem 1 zu erhalten: 4-Verhältnis (v/ V Lösung / Blut). </li><li> Für Plasma und roten Blutkörperchen Proben, zentrifugieren Sie das gesammelte Blut für 5 min bei 4000 xg bei 4ºC roten Blutzellen (RBC) und Plasma zu trennen. Nehmen Sie den Überstand (Plasma) und mischen Sie es mit Nitrit Konservierungslösung wie für die Bestimmung von Nitritspiegel im Plasma oben beschrieben. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig mit einem cut-off Pipettenspitze verbleibende Plasma und Buffy-Coat aus der Probe und Pipetten RBC Probe aus dem Boden des Röhrchens Kontamination durch andere Arten von Blutzellen zu vermeiden, und gibt sie in eine Röhre enthält, Nitrit Konservierungslösung in der gleichen Verhältnis wie oben. </li><li> Mischen jede Probe (Plasma und RBC) mit kaltem Methanol in einem Verhältnis 1: 1 oder 1: 2 (v / v sample / Methanol) und zentrifugiert sie bei 13000 × g bei 4 ° C für 15 min, um Proteine ​​auszufällen. Nehmen Sie den Überstand und nutzen es für Nitrit-Messung oder einfrieren vorbereiteten Proben, falls erforderlich, auf Trockeneis und bei -80 ° C. Hinweis: Nitrite schnell reacts mit Oxyhämoglobin (Oxy-Hb) im Blut bilden Nitrat. Da Oxy-Hb immer in großen Überschuss über Nitrit ist, führt diese Reaktion zu einer fast vollständigen Vernichtung der einheimischen Blut Nitrit mit einem Zeitrahmen von ~ 10 min. Um sich zu schützen die meisten endogenen Blut Nitrit, Nitrit-Konservierungslösung auf die Vollblut-Proben unmittelbar nach der Blutentnahme zugesetzt. Die Lösung wird schnell rote Blutkörperchen lysieren und Oxy-Hb in Methämoglobin (MetHb), eine inaktive Form von Hämoglobin oxidieren die chemisch nicht mit Nitrit reagiert. </li></ol></li><li> Vorbereitung von Proben aus anderen Arten von Körperflüssigkeit , <ol><li> Nach der Probensammlung in geeignete Behälter, gut mischen mit Nitrit Konservierungslösung, deproteinate und sofort messen oder einfrieren und bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Sammlung und Vorbereitung von Gewebeproben <ol><li> Sammeln Sie Gewebe von Tieren durchbluteten mit heparinisierter Kochsalzlösung (10 U Heparin / ml). Verbrauch etwa 1 g des gewünschten Gewebe und homogenisieren entweder eine manuelle oder eine automatisierte Homogenisator Homogenisator. </li><li> In bekannten Menge an Nitrit Konservierungslösung nach Bedarf glatt Homogenat zu erreichen. </li><li> Sobald Gewebe homogenisiert ist, auszufällen Proteine ​​unter Verwendung von kaltem Methanol (1: 1 oder 1: 2-Verhältnis v / v sample / Methanol) wie oben beschrieben, dann Zentrifuge Proben bei 13000 × g bei 4 ° C für 15 min. </li><li> Sammeln Sie den Überstand und Maß Nitritgehalt. Bei Bedarf einfrieren Proben in jeder Phase der Vorbereitung auf Trockeneis und bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung Lösungen Reduzierung <ol><li> Tri-Iodid (I 3) Reduktionslösung für Nitrit und R- (X) -NO Spezies Bestimmung 1,3,4 <ol><li> Eine Lösung aus 301 mM KI zusammen mit 138 mM I 2 - Lösung in Wasser. Mischen mit Eisessig in 2: 7-Verhältnis (v / v Lösung / Säure) auf einem Magnetrührer für ~ 30 min, bis das gesamteKristalle werden aufgelöst. halten vorzugsweise in dunklen Flasche, als Jodid empfindliche Licht ist, und innerhalb einer Woche Vorbereitung. Hinweis: Diese Lösung reduziert Nitrit in NO und es wird auch Release NO von R-SNO, R-NNO und Fe-NO funktionellen Gruppen (R- (X) -NO), aber Nitrat wird nicht beeinträchtigt. Das Signal von den oben NO-basierten funktionellen Gruppen können von der wahren Nitrit Signal durch Behandlung Hälfte der Probe mit angesäuertem Sulfanilamid (AS) und Vergleichens AS-behandelten und unbehandelten Signal getrennt werden. AS irreversibel bildet Diazoniumkations mit Nitrit und dieser Komplex nicht durch I 3 Lösung reduziert werden. Für AS Behandlung vorbereiten 290 mM Lösung von Sulfanilamid in 1 M HCl und fügen es zu einer aliquoten Probe im Verhältnis 1: 9 (v / v AS / Probe). Messung der CL-Signal in AS-behandelten und unbehandelten Teilen der Probe. Berechnen Sie die wahre Nitrit Signal als Differenz von AS-behandelten und unbehandelten Teil der Probe. Nitrite können auch durch die Verwendung eines selektiven nit gemessen werdenrite-reduzierende Lösung von Ascorbinsäure / Mischung Essigsäure, wie in Teil 2.2 beschrieben. Aufgrund der meist geringen Menge an R- (X) -NO Spezies vorhanden, Messungen mit AS-unbehandelten Proben sind in den meisten Fällen eine sehr gute Annäherung der gesamten Nitritgehalt. </li></ol></li><li> Ascorbinsäure / Essigsäure (4A) Lösung zur selektiven Bestimmung von Nitrit 2 <ol><li> Bereiten 500 mM Ascorbinsäure in Wasser. Mischen, diese Lösung mit Eisessig in einem Verhältnis 1: 7 (v / v, Ascorbinsäure / Essigsäure), um die Reaktionsmischung herzustellen. Anmerkung: Diese Lösung ist spezifisch für Nitrit, wird loslassen nicht NO aus jedem R- (X) -NO Spezies oder Nitrat. Jedoch muß die Lösung von Ascorbinsäure und Essigsäure frisch vor den Messungen jeden Tag hergestellt werden, wie Ascorbinsäure leicht in Lösung oxydiert. Abschluss der Nitritreduktion hängt von Ascorbinsäure-Konzentration; und mindestens 50 mM Ascorbinsäure zur vollständigen r empfohleneduction von Plasma-Nitrit. Es wird jedoch empfohlen, einige Pilotexperimente mit verschiedenen Konzentrationen von Ascorbinsäure und Nitrit-Standards in der erwarteten Nitrit Konzentrationsbereich vor der endgültigen Probe Messungen durchzuführen. Beachten Sie, dass etwas Ascorbinsäure während der Messungen dezimiert, so häufigen Wechsel der Reaktionsmischung in der Glasreaktionskammer empfohlen. </li></ol></li><li> Vanadium (III) chlorid - Reduktionslösung zur Nitratbestimmung 9 <ol><li> Vorbereitung 51 mM Lösung von VCl 3 in 1 M HCl. Filter-Lösung durch 200 &amp; mgr; m-Filter und Speicher in einer dunklen Flasche, verwenden Sie innerhalb von zwei Wochen. Hinweis: Diese Lösung reduziert Nitrat, Nitrit und alle R- (X) -NO Arten, so dass , wenn vergleichbare Mengen an Nitrit oder anderen R- (X) -NO Spezies vorhanden sind , zusammen mit Nitrat, hat die endgültige Nitratgehalt berechnet werden als die Differenz zwischen den Signalen CL mit VCl 3 und I erhalten3 Reduzierung Lösungen. </li></ol></li></ol> 3. Chemilumineszenz (CL) Analyzer-Setup und Messungen <ol><li> Standardlösung <ol><li> Vorbereitung 1 uM Lösung von Natriumnitrit (NaNO 2). Die gleiche Lösung kann für Nitrit und Nitrat-Bestimmungen verwendet werden. </li></ol></li><li> Mit NO - Analysator Hinweis: Derzeit gibt es zwei im Handel erhältlichen NO - Analysatoren , die für die Zwecke der biologischen Forschung empfindlich genug sind - Sievers NOA und Ecophysics CLD 88Y. Beide arbeiten nach dem gleichen Prinzip; Ozon (O 3) zu machen, während NOA benötigt eine externe Sauerstofftank für diesen Zweck der Hauptunterschied besteht darin , dass CLD 88Y Sauerstoff aus der Raumluft verwendet. Das folgende Verfahren beschreibt die Menge für die Sievers NOA auf. <ol><li> Die Geräteeinstellung <ol><li> Führen Sie die erstmalige Konfiguration des NO-Analysator gemäß den Empfehlungen des Herstellerswie in Abbildung 1 zu sehen. </li><li> Öffnen O 2 Tank mit dem Gerät verbunden. Wählen Sie &quot;Analyse&quot; und &quot;Enter&quot; aus dem Hauptmenü auf der Frontplatte. Auf dem nächsten Bildschirm wählen Sie &quot;Start&quot; und drücken Sie &quot;Enter&quot;. Verbinden der Säurefalle (mit 1 M NaOH) an das Gerät wie in Figur 1 gesehen. </li><li> Warten, bis Photomultiplier auf Temperatur unter -12 ° C abgekühlt und die Reaktionskammer wird auf 6 Torr evakuiert. Es dauert etwa 30 Minuten eine stabile flache Basislinie zu erreichen. Die Baseline muss innerhalb von 1 zu stabilisieren - 2 mV, dessen Nennwert ist weniger wichtig als seine Stabilität. Hinweis: Wenn Nitrat gemessen wird, schalten Sie das Kühlwasserbad (eingestellt bei 4 ° C, die für die Säure und Wasserdampf als Kühlfalle dient) und Heizung Wasserbad (Hauptreaktionskammer, 95 ° C). Die Geschwindigkeit der Reduktion von Nitrat zu NO in VCl 3 Lösung ist temperaturabhängig, und es ist sehr langsam bei Raum tempetur, so wesentliche Erhöhung der Temperatur benötigt wird, um die Reaktion zu beobachten. </li><li> Öffnen Sie den Tank Er und schließen Sie das Glasreaktionskammer Säurefalle , wie in Abbildung 1 zu sehen. Füllen Sie die Reaktionskammer mit geeigneten Reduktionslösung, reduzieren Sie die sprudelnden auf ein Minimum und schließen Reaktionskammer zu der Säurefalle. Mit Versuch und Irrtum, stellen Sie die Er sprudelt Rate des Instruments Saugvolumenstrom anzupassen (in der Regel ~ 200 ml / min für Siever der NOA). </li><li> Schalten Sie den Computer das Gerät zu steuern und starten Labview-basierte flüssige Software. So schalten Sie die Kommunikation zwischen dem Instrument und der Erfassungssoftware, drücken Sie &quot;Enter&quot;, wenn sie in &quot;Daten-Menü&quot;, bis das Bild liest &quot;Ausgang freigegeben&quot;, dann &quot;clear&quot; drücken, um Daten-Bildschirm zurückzukehren. </li><li> Warten Sie auf eine stabile Basislinie Spur auf dem Bildschirm und starten Proben und Nitrit Standards Injektion in Lösung durch das Septum zu verringern. Warten Sie immer eine stabile Basislinie achtern zu erreichener den Gipfel. Dies kann bis zu 2 Minuten dauern. Das Liquid-Software verfügt über eine Option &quot;Markierung&quot; Zeiten der Einspritzung und die Injektion mit Anmerkungen versehen und es wird diese Kommentare in eine separate Datei (filename.info) als sinnvolle Ergänzung zu der Datendatei (filename.data) exportieren. </li><li> Sobald Proben und Standards gemessen werden, wählen Sie &quot;Stopp&quot; Option in dem Liquid Software-Menü - diese werden die Daten aus einer temporären Datei in eine permanente Datei schreiben als &quot;filename.data&quot; bekannt. Durch Drücken von &quot;Abbruch&quot; Option Messung beenden, ohne erfassten Daten in eine permanente Datei zu schreiben. </li><li> Zum Beenden Experiment, trennen Sie das Gerät aus dem Reaktionsgefäß durch den Hahn auf der Spitze des Reaktionsgefäßes auszuschalten und trennen Sie den Schlauch zwischen Säurefalle und Reaktionsgefäß (siehe Abbildung 1). Jetzt NOA Analysator stoppen - drücken Sie &quot;klar&quot;, gehen Sie auf &quot;Analyse&quot;, legte Maschine auf &quot;Standby&quot; und &quot;Bestätigen&quot; Standby-Modus. Bei regelmäßiger Anwendung derInstrument kann für mehrere Wochen im Standby-Modus bleiben. Schalten Sie Zufuhr von Sauerstoff. Dann spülen Sie die Reduktionslösung aus der Reaktionskammer, trennen und schließen Sie den Er Tank aus dem Reaktionsgefäß aus Glas und Reaktionsbehälter fertig zu reinigen. </li></ol></li><li> Standards und Probeninjektionen <ol><li> Einzuspritzen 50 ul von 1 uM Nitritlösung in das Reaktionsgemisch eine gut gewaschene Hamilton Spritze. Warten für mindestens 1 bis 2 min zwischen den Injektionen gute Trennung von Peaks zu erzielen. Wiederholen Sie die Injektion von 50 &amp; mgr; l auf Duplikate zu jedem Datenpunkt erhalten. Waschen Sie Spritze mit VE-Wasser nach jeder Injektion. </li><li> Um eine volle Satz von Daten für Standardkurve erwerben, weiterhin mit doppelten Injektionen von 100, 150 &amp; mgr; l (weitere 200 &amp; mgr; l ist erforderlich, wenn hohe Konzentrationen von Nitrit oder Nitrat zu erwarten sind) von 1 &amp; mgr; M Nitritlösung. In jedem Fall darauf achten, zu warten, bis das Signal auf den Ausgangswert zurückfällt und erwerben dann 1 bis 2 min der Basislinie eine gute Trennung von Peaks zu erreichen. Anmerkung: Nitrite Standards können jederzeit während der Experimente gemessen werden. Jedoch ist es bevorzugt, die Standardkurve vor der Datenmessung zu erfassen, da es auch als eine unabhängige Überprüfung der Gerätefunktionalität dient. Wenn die Daten erhoben werden, injiziert Probenmenge zu gut ausgeprägten Spitzen führen sollte. Es sollte jedoch im Auge behalten werden, daß der Photomultiplier linear bis zu ~ 800 mV nur ist, so dass keiner der Spitze sollte höher als ~ 700 mV sein. Dies kann entweder erreicht werden, indem der Betrag injizierten Probe abnimmt oder die Probe mit VE-Wasser verdünnt. Jeder Punkt sollte mindestens doppelt gemessen werden. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Dr. Alan Schechter als Miterfinder auf mehrere Patente erteilt aufgeführt zu den National Institutes of Health für die Verwendung von Nitritsalze zur Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen. Er erhält Lizenzgebühren auf Basis von NIH Lizenzierung dieser Patente für die klinische Entwicklung, aber keine andere Entschädigung.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Aliquots aller Lösungen (einschließlich Wasser), die zur Herstellung, verdünnt oder anderweitig Originalproben zu behandeln haben für mögliche Nitrit oder (häufiger) Nitratbelastung gespeichert und überprüft werden. Wir fanden, dass die meisten Verunreinigungen von Wasser kommt, und viele Chemikalien verwendet Probe (ferricyanide insbesondere) zur Behandlung auch erhebliche Menge an Nitratbelastung in einigen Partien enthalten, die mit dem end...

Nitrite und zu einem weniger verlängern Nitrat-Spiegel im Blut reflektieren Gesamtzustand der Körper nicht den Stoffwechsel. Nitrit-Konzentrationen in Blut und die meisten Organe und Gewebe sind nur in hohen nanomolaren oder niedrigen mikromolaren Bereich, Nitrat in wesentlich höheren Mengen in der Regel vorhanden ist - in mikromolaren Bereich. Änderungen in der Nitritwerte wegen Krankheitsprogression oder Veränderungen der Ernährungsgewohnheiten sind recht klein und kann nur über eine sehr empfindliche Methode gemessen werden. Aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen Ebenen und mit unterschiedlichen Stoffwechselprozesse, separate Bestimmung von Nitrit und Nitratgehalt ist von wesentlicher Bedeutung. So genannte &quot;NO x Bestimmung&quot; von Nitrit und Nitrat gemessen werden zusammen hat sehr wenig Wert. Mehrere Verfahren zur Nitrit in verschiedenen biologischen Proben zu quantifizieren entwickelt wurden - die häufigste die älteste, basiert auf der Griess-Reaktion, die mit modernen modificatio in 1879. Selbst ursprünglich beschrieben worden warns, ist die Empfindlichkeitsgrenze für Nitrit erreichbar durch Griess &#39;Methode in niedrigen mikromolaren Bereich. Chemilumineszenz (CL), kombiniert mit Tri-Jodid - Lösung zu reduzieren, ist derzeit die empfindlichste Methode betrachtet, so dass eine Quantifizierung im niedrigen nanomolaren Bereich von Nitritkonzentrationen 1-8,10,11. Das gleiche Verfahren CL, kombiniert mit Vanadin (III) -chlorid - Lösung zu reduzieren, kann für empfindliche Messungen von Nitrat verwendet werden, mit Präzision im nanomolaren Bereich 9. CL erkennt freies Gas NO. Daher, Nitrit, Nitrat, R-Nitrosothiole (R-SNO), R-Nitrosoamine (R-NNO) oder Metall-NO-Verbindungen (später in Manuskript bezeichnet als &quot;R- (X) -NO&quot;) muss in umgewandelt werden frei von NO-Gas, um ihre ursprünglichen Beträge über CL zu quantifizieren. Umwandlung zu NO ist, mehrere verschiedene Reduktionslösungen erreichen mit, je nach Art des NO-Metaboliten. Nach der Umwandlung wird frei NO-Gas aus dem Reaktionsgefäß durch ein Trägergas (He, N gespült2 oder Ar) in die Reaktionskammer von CL - Analysator , wo Ozon (O 3) mit NO kombiniert wird Stickstoffdioxid (NO 2) in seinem aktivierten Zustand zu bilden. Mit Rückkehr zum Grundzustand, NO 2 * emittiert im Infrarotbereich und emittierten Photons durch Photomultiplier (PMT) von CL Instrument detektiert. Die Intensität des emittierten Lichts ist direkt proportional zur NO-Konzentration in der Reaktionskammer, die Berechnung der Konzentration der ursprünglichen Spezies unter Verwendung geeigneter Kalibrierungskurven ermöglicht. In unserem Protokoll haben wir zunächst vorliegende CL-basierte Bestimmung von Nitrit und Nitrat in den am häufigsten verwendeten klinischen Einstellungen - im Blut und Plasma, und dann besprechen wir, wie diese Ionen in Gewebeproben zu bestimmen. Wir erklären auch im Detail, wie die ursprüngliche physiologischen Nitritkonzentration in Nitrit-reaktive Umgebungen zu erhalten, wie zum Beispiel Blut und seine Fächer, Plasma und roten Blutkörperchen.

<table><tbody><tr><td>potassium ferricyanide; K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide; AS&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid, glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>potassium iodide; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>iodine; I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>light sensitive, toxic</td></tr><tr><td>sodium nitrite; NaNO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>vanadium(III) chloride; VCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>ligt sensitive, toxic</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&amp;nbsp;Ecophysics&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

Stickstoffmonoxid (NO) ist einer der wichtigsten Reglermolekülen in der vaskulären Homöostase und auch ein Neurotransmitter. Enzymatisch erzeugte NO wird durch Wechselwirkungen mit verschiedenen Oxy-Häm-Proteine ​​und andere noch nicht bekannte Wege in Nitrit und Nitrat oxidiert. Der umgekehrte Vorgang, Reduzierung von Nitrit und Nitrat in NO hatte bei Säugetieren in den letzten zehn Jahren entdeckt worden, und es gewinnt Aufmerksamkeit als einer der möglichen Wege entweder zu verhindern oder eine ganze Reihe von Herz-Kreislauf-, Stoffwechsel- und Muskelerkrankungen lindern, die gedacht sind mit verminderter NO-Spiegel in Verbindung gebracht werden. Es ist daher wichtig, die Menge von NO und seinen Metaboliten in verschiedenen Kompartimenten abzuschätzen - Blut, Körperflüssigkeiten und den verschiedenen Geweben. Blut, aufgrund seiner leichten Zugänglichkeit ist die bevorzugte Fach für die Abschätzung der NO-Metaboliten verwendet. Aufgrund seiner kurzen Lebensdauer (einige Millisekunden) und niedrige subnanomolarer Konzentration, direkte zuverlässige Messungen des Blut NO &lt;em&gt; in vivo vor große technische Schwierigkeiten. Somit wird keine Verfügbarkeit in der Regel bezogen auf die Menge der Oxidationsprodukte, Nitrit und Nitrat geschätzt. Diese beiden Metaboliten werden immer separat gemessen. Es gibt mehrere gut etablierte Methoden ihre Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten und Geweben zu bestimmen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Chemilumineszenz-Methode (CL) bezogen auf spektrophotometrische Detektion von NO nach Nitrit oder Nitrat-Reduktion durch Triiodid-oder Vanadium (III) chlorid-Lösungen, respectively. Die Empfindlichkeit für Nitrit und Nitrat-Erkennung ist in niedrigen nanomolaren Bereich, der CL als die empfindlichste Methode setzt derzeit zur Verfügung stehenden Änderungen der NO Stoffwechselwege zu bestimmen. Wir erklären im Detail, wie Proben aus biologischen Flüssigkeiten und Geweben herzustellen, um zu bewahren ursprünglichen Mengen an Nitrit und Nitrat anwesend zum Zeitpunkt der Sammlung und wie ihre jeweiligen Mengen in Proben zu bestimmen. Einschränkungen der CL-Technik sind auch explained.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse von Normen gesammelt und fünf verschiedenen Proben. Wie in dieser Figur gezeigt, Photomultiplier Spannung steigt unmittelbar nach nitrithaltigen Lösung (Standards oder Proben) in Reduktionslösung eingespritzt wird und kehrt zu dem Ausgangswert, sobald alle Nitrit in der injizierten (Injektionen Zeiten werden durch rote Pfeile unterhalb der Kurve angegeben) Lösung wurde reduziert. Es ist auch klar aus dieser Figur, die eine...

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Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

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Serie: Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted mechanism of metabolic activation involves formation of &#945;-hydroxynitrosamines that spontaneously decompose to DNA alkylating agents. Accumulation of DNA damage and the resulting mutations can ultimately lead to cancer. New evidence indicates that &#945;-hydroxynitrosamines can be further oxidized to nitrosamides processively by cytochrome P450s. Because nitrosamides are generally more stable than &#945;-hydroxynitrosamines and can also alkylate DNA, nitrosamides may play a role in carcinogenesis. In this report, we describe a general protocol for evaluating nitrosamide production from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines. This protocol utilizes a general approach to the synthesis of the relevant nitrosamides and an in vitro cytochrome P450 metabolism assay using liquid chromatography-nanospray ionization-high resolution tandem mass spectrometry for detection. This method detected N&#8242;-nitrosonorcotinine as a minor metabolite of N&#8242;-nitrosonornicotine in the example study. The method has high sensitivity and selectively due to accurate mass detection. Application of this method to a wide variety of nitrosamine-cytochrome P450 systems will help determine the generality of this transformation. Because cytochrome P450s are polymorphic and vary in activity, a better understanding of nitrosamide formation could aid in individual cancer risk assessment.

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

&#945;-hydroxylation of carcinogenic nitrosamines by cytochrome P450s is the accepted metabolic pathway that produces DNA-damaging intermediates, which cause mutations. However, new data indicates further oxidation to nitrosamides can occur. We describe a general method for detecting nitrosamides produced from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines.

Eine allgemeine Methode zur Erkennung von Nitrosamide Formation in der In-vitro- Metabolismus von Nitrosaminen durch Cytochrom P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Forschung

Krebsforschung

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

Verfahren der Labor-Begasung für die Schädlingsbekämpfung mit Gas Stickstoffmonoxid

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

Umwelt

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Medizin

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH oxidase has critical signaling functions that modulate the inflammatory response 1. Thus, the development of a method to measure in "real-time" the kinetics of NADPH oxidase-derived ROS generation is expected to be a valuable research tool to understand mechanisms relevant to host defense, inflammation, and injury.
Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder of the NADPH oxidase characterized by severe infections and excessive inflammation. Activation of the phagocyte NADPH oxidase requires translocation of its cytosolic subunits (p47phox, p67phox, and p40phox) and Rac to a membrane-bound flavocytochrome (composed of a gp91phox and p22phox heterodimer). Loss of function mutations in any of these NADPH oxidase components result in CGD. Similar to patients with CGD, gp91phox -deficient mice and p47phox-deficient mice have defective phagocyte NADPH oxidase activity and impaired host defense 2, 13. In addition to phagocytes, which contain the NADPH oxidase components described above, a variety of other cell types express different isoforms of NADPH oxidase.
Here, we describe a method to quantify ROS production in living mice and to delineate the contribution of NADPH oxidase to ROS generation in models of inflammation and injury. This method is based on ROS reacting with L-012 (an analogue of luminol) to emit luminescence that is recorded by a charge-coupled device (CCD). In the original description of the L-012 probe, L-012-dependent chemiluminescence was completely abolished by superoxide dismutase, indicating that the main ROS detected in this reaction was superoxide anion 14. Subsequent studies have shown that L-012 can detect other free radicals, including reactive nitrogen species 15, 16. Kielland et al. 16 showed that topical application of phorbol myristate acetate, a potent activator of NADPH oxidase, led to NADPH oxidase-dependent ROS generation that could be detected in mice using the luminescent probe L-012. In this model, they showed that L-012-dependent luminescence was abolished in p47phox-deficient mice.
We compared ROS generation in wildtype mice and NADPH oxidase-deficient p47phox-/- mice 2 in the following three models: 1) intratracheal administration of zymosan, a pro-inflammatory fungal cell wall-derived product that can activate NADPH oxidase; 2) cecal ligation and puncture (CLP), a model of intra-abdominal sepsis with secondary acute lung inflammation and injury; and 3) oral carbon tetrachloride (CCl4), a model of ROS-dependent hepatic injury. These models were specifically selected to evaluate NADPH oxidase-dependent ROS generation in the context of non-infectious inflammation, polymicrobial sepsis, and toxin-induced organ injury, respectively. Comparing bioluminescence in wildtype mice to p47phox-/- mice enables us to delineate the specific contribution of ROS generated by p47phox-containing NADPH oxidase to the bioluminescent signal in these models.
Bioluminescence imaging results that demonstrated increased ROS levels in wildtype mice compared to p47phox-/- mice indicated that NADPH oxidase is the major source of ROS generation in response to inflammatory stimuli. This method provides a minimally invasive approach for "real-time" monitoring of ROS generation during inflammation in vivo.

NADPH oxidase is the major source of reactive oxygen species (ROS) in phagocytes. Because of the ephemeral nature of ROS, it is difficult to measure and monitor ROS levels in living animals. A minimally invasive method for serial quantification of ROS in living mice is described.

Biolumineszenz Imaging von NADPH-Oxidase-Aktivität in verschiedenen Tiermodellen

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Immunologie und Infektion

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Eine neue Technik zur Erzeugung und Observing Chemilumineszenz in einem biologischen Rahmen

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Biotechnik

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Biologie

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the effects of nitrosated compounds. Measuring NO metabolites is essential to studying NO activity both at vascular levels and in other tissues, especially in the experimental settings where exogenous NO is administered. Ozone-based chemiluminescence assays allow precise measurements of NO and NO metabolites in both fluids (including plasma, tissue homogenates, cell cultures) and gas mixtures (e.g., exhaled breath). NO reacts with ozone to generate nitrogen dioxide in an excited state. The consequent light emission allows photodetection and the generation of an electric signal reflecting the NO content of the sample. Aliquots from the same sample can be used to measure specific NO metabolites, such as nitrate, nitrite, S-nitrosothiols, and iron-nitrosyl complexes. In addition, NO consumed by cell-free hemoglobin is also quantified with chemiluminescence analysis. An illustration of all these techniques is provided.

Here, we present protocols for detecting nitric oxide and its biologically relevant derivatives using chemiluminescence-based assays with high sensitivity.

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Die Anwendung von genetisch kodierter Fluorescent Stickstoffmonoxid (NO) • Sonden, die geNOps, für Echtzeit-Imaging von NO • Signale in Einzelzellen

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...