This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).

1. tasmalar üzerinde Başkanı Tespit ve Parafin katıştırma Not: tespite tüm adımları, bir çeker ocak içinde yapılmalıdır. sağlık riski olduğu halde değil ise metilbenzoat, bir çeker ocak içinde ele takdirde çok zor olabilir, son derece belirgin bir koku vardır. <ol><li> sinekler anestezi önce, 15 ml kloroform ve% 99 etanol, 30 mL glasiyel asetik asit (5 mi kloroform ve asetik asit karışmaz) eklenerek Carnoy çözeltisi 50 mL oluşturur. yaka düz koymak ve tamamen çözelti ile kaplıdır emin olmak için, böyle bir kristalleştirme tabak gibi düz alt, bir cam kap içinde dökün. </li><li> CO 2 veya eter ile sinek anestezisi. </li><li> forseps kullanarak yaka içine boyunlarına Konu sinekler (yukarı çoğu yaka 20). Şekil 1A görüldüğü gibi, aynı yönde başkanları tüm hizalayın ve herhangi bir hasar ya da kafasına gözlerine meydana sağlamak için nazik olmayı unutmayın. </li><li> Sinekler sırası kolayca bölümleri tespit edilebilir, böylece herhangi bir konumda olmazsa oculis sinekler (oklar, Şekil 1A) içerir. Deneysel sinekler hafif ya da beyaz göz rengi varsa ek olarak, bu tür vahşi türü olarak bazı kırmızı gözlü sinekler, iplik aralarında yeterli pigment slayt leke mevcut olduğundan emin olmak için. Birden fazla yaka kullanıyorsanız yaka numarası ile birlikte bir protokol kağıda sinekler sırasını kaydedin. </li><li> 4 saat - yaka tamamlandıktan sonra, 3.5 için hazırlanan Carnoy çözeltisi içine koyun. </li><li> Uygun bertaraf kabına Carnoy çözüm dökümü ve etanol yıkar başlar. kapta yaka yerleşimini rahatsız etmeyecek şekilde yavaşça dökün emin olun. </li><li> iki kez% 99 etanol içinde 30 dakika boyunca halkalar yıkayın. </li><li> 1 saat boyunca% 100 etanol içinde yaka yıkayın. overdehydration önlemek için zamanında yıkar değiştirmek emin olun. </li><li> metilbenzoat içinde yaka koyunO / oda sıcaklığında N. metilbenzoat buharlaşmasını önlemek için parafilm kabı mühür. </li><li> davlumbaz uygun tek kullanımlık kap içine methylbenozate dökün. (- 57 ° C 56) parafın balmumu ve metilbenzoat 1 düşük erime noktası: 1, daha önceden hazırlanmış karışımı ekleyin. Bu noktadan itibaren, yaka parafın sertleşmesine olmadığından emin olmak için, 65 ° C&#39;de bir kuluçka tutulması gerekir. </li><li> Uygun tek kap içine methylbenozate parafin karışımı üzerinden dökün ve erimiş saf parafin dökün, bilezik üzerine, 65 ° C&#39;de tutuldu. </li><li> 30 dakika sonra parafin değiştirin ve bu en az 5 kez tekrarlayın. en az 6-8 yıkama yapılmalıdır. </li><li> yıkar tamamlandıktan sonra, yaklaşık yuvalara yaka boyutu ile bir lastik buz küpü tepsiye yaka yerleştirin. tamamen kapalı kadar onlar üzerinde erimiş parafin dökün ve O sertleşmesini sağlayan / N (hava kabarcıklarını önlemek için deneyin). </li><li> parafin blokları contai kaldırning buz küpü tepsisinden yaka. yavaşça yaka kopması, bir jilet kullanarak yaka parafin blok ayırın. organları yaka kalacak ise kafaları parafin blok olacak. blok, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li><li> yakaları temizlemek için, hafif fırçalama ile temiz parafin, kaldırmak ve tekrar kullanmadan önce etanol içinde yıkamak için 65 ° C&#39;de deparafinization ajan onları ıslatın. </li></ol> 2. Kesit ve Montaj <ol><li> 50 ° C&#39;ye kadar bir ısıtma plakası ısıtın. plaka üzerinde nesne tutucular (ya da metal montaj blokları) ve jilet yerleştirin ve onları ısınmasına izin verin. </li><li> kesit için istenen yönde bağlı olarak, parafin (yatay bölümler için) tarafına doğru başkanları ile ya blok veya (kısaca temas tarafında blok erime) ısıtılmış montaj bloğuna (frontal kesitler için) yukarı bakacak ekleyin. ısıtma plakası blok çıkarın ve en az 10 mil soğumasını bekleyinn, parafın montaj bloğu üzerine bir sızdırmazlık için yeterli sertleştirilmiş olduğundan emin olmak için. engebeler bilmek mümkün olduğu kadar bloğun yüzeyi ile paralel yerleştirilmiş kafalarının satır tutun. </li><li> Bir jilet alın ve gömülü başları sadece küçük bir satır kalacak şekilde uzak sinek kafaları aşırı parafin Döşeme (jilet daha kolay düzeltme için ısındı olabilir). parafin (kesit sırasında yapılabilir fazla kırpma) kesit sırasında sonu yok ki çok fazla süs için değil emin olun. </li><li> mikrotom amacı tutucu içine yerleştirme bloğu yerleştirin ve kafaları sırasının hizalama kanadın kenarı mümkün olduğu kadar paralel olduğundan emin olun. </li><li> poli-L-Lizin (PLL) solüsyonu ince bir tabaka ile kaplayarak mikroskop slaytlar hazırlayın ve 5 dakika boyunca kurumaya bırakın. kısa bir süre önce kullandığınız su ile bunları kapatın. </li><li> 7 mikron bölümleri kesmek ve su üzerinde yüzen slayt bölümlerin şerit aktarın. &lt;br /&gt; Not: Yatay bölümler için tüm beyin elde etmek için, biz baş tamamen kesilene kadar (beyine burnumun kesme) göz içine kesmek için başlarken gelen kurdele toplamak. Birden fazla slayt tüm kafa için gerekli olabilir. </li><li> 37 ° C&#39;de bir ısı plakasında slayt yerleştirin ve şerit 1 dakika için genişletilmesine izin verir. </li><li> (Kapalı dökme veya doku kullanılarak) aşırı su çıkarmak ve slaytlar O / N kurutun. </li><li> Bir deparafinization ajan (tamamen bölümlerini kapsayan) ile dolu uzun boylu, dik slayt boyama kavanoz slaytlar yerleştirerek slayt parafin çıkarın. 60 dakika - her 30 dakika 3 yıkar gerçekleştirin. </li><li> Nihai yıkama slayt çıkarın. slayt üzerine gömme medya 2 damla koyun ve büyük bir lamel ile örtün. </li></ol> 3. Bölümler Fotoğrafçılık ve Analizi <ol><li> 2 d - Hazırlanan slaytlar 1 kurumasını bekleyin. Sonra, bir floresan Microsc bunları incelemekmavi ışık altında ope. </li><li> Sineklerin yönünü belirlemek ve belirli bir bölge üzerinde odaklanarak, eğer ilgi bölgeyi bulmak için daha düşük bir büyütme kullanın. NOT: sws sinekler (Şekil 2) için, biz büyük komissürü içeren bölümünü bulun ve (genellikle 40X büyütme) bir görüntü alır. (Şekil 3&#39;te olduğu gibi), tüm beyin analiz ederken, bir kafa tüm bölümleri ilerlemek ve en ağır fenotip veya vakuoller göstermek tüm bölümleri ile bölüm fotoğraf ya. </li><li> Bir çift-kör analizi için, almak ve sayı görüntüleri genotipi bilmeden ve daha sonra onları tanımlamak için üst üste yaka numarasını ve başın pozisyonunu kaydedin. </li><li> görüntüler alınmıştır sonra bir görüntüleme yazılımı kullanarak bunları analiz eder. </li><li> Bölüm başına veya başına vakuol sayısını. , Vakuol boyutunu ölçmek bir yazılım programında görüntüleri açın ve çok bir seçim ile vakuoller seçmek içinl. Seçilen vakuoller piksellerin miktarını belirlemek. </li><li> Um 2 dönüşüm için, fotoğraf elde etmek için kullanılan büyütme bir sahne mikrometre kalibrasyonu slayt fotoğraf çekmek. Dönüşüm faktörünü hesaplamak için 100 um 2 piksel miktarını belirler. </li><li> Yukarıdaki adımda hesaplanan dönüşüm faktörü ile piksel sayısına bölünmesiyle mikron 2 içine toplam piksel sayısını dönüştürün. </li></ol>

<ol><li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Front Genet. 5, 279(2014).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+an+experimental+tool+for+the+study+of+complex+neurological+diseases%3A+Parkinson%27s+disease%2C+Alzheimer%27s+disease+and+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder.</a> Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).</li>
<li>Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+C.+elegans+to+discover+therapeutic+compounds+for+ageing-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Central+Journal%22%5BJournal%5D)">Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases.</a> Chemistry Central Journal. 9, 65(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodegenerative+diseases+in+transgenic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems.</a> Hum Genet. 131, 535-563 (2012).</li>
<li>Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+that+underlie+human+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).</li>
<li>Konsolaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruitful+research%3A+drug+target+discovery+for+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).</li>
<li>Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+mutants+in+Drosophila%3A+a+means+to+identify+genes+and+mechanisms+involved+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases.</a> Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+cheese+et+allii%2C+some+of+the+first+neurodegenerative+mutants+isolated+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila.</a> J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).</li>
<li>Li, J., Le, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegenerative+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).</li>
<li>Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li>
<li>Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+tauopathy+studies+in+flies+and+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms.</a> Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Barone, M. C., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+neurodegenerative+phenotypes+in+Drosophila+dopaminergic+neurons+by+climbing+assays+and+whole+brain+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining.</a> J Vis Exp. , e50339(2013).</li>
<li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+expression+of+Swiss-cheese+%28SWS%29%2C+the+Drosophila+orthologue+of+Neuropathy+Target+Esterase%2C+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. , (2015).</li>
<li>Iijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta42+mutants+with+different+aggregation+profiles+induce+distinct+pathologies+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila.</a> PLoS One. 3, e1703(2008).</li>
<li>Krishnan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+circadian+clock+accelerates+aging+in+neurodegeneration-prone+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants.</a> Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+and+its+use+in+a+genetic+screen+for+modifiers+of+Abeta%2842%29-induced+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila.</a> Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).</li>
<li>Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+distinct+phosphorylations+differentiate+Tau-dependent+learning+deficits+and+premature+mortality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila.</a> Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).</li>
<li>Ping, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+abeta42-induced+hyperexcitability+to+neurodegeneration%2C+learning+and+motor+deficits%2C+and+a+shorter+lifespan+in+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model.</a> PLoS Genet. 11, e1005025(2015).</li>
<li>Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Induction+of+Human+NTE+%28PNPLA6%29+Rescues+Neurodegeneration+and+Mobility+Defects+of+Drosophila+swiss+cheese+%28sws%29+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants.</a> PLoS One. 10, e0145356(2015).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).</li>
<li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).</li>
<li>Navarro, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dopaminergic+neuronal+dysfunction+in+genetic+and+toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila.</a> J Neurochem. 131, 369-382 (2014).</li>
<li>Heisenberg, M., Böhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+anatomical+brain+mutants+of+Drosophila+by+histological+means%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung+C%22%5BJournal%5D)">Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means.</a> Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143(1979).</li>
<li>Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+brain+revisited+by+enhancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila brain revisited by enhancer detection.</a> J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).</li>
<li>Lin, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+in+situ+brain+imaging+for+mapping+the+Drosophila+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome.</a> J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).</li>
<li>Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mushroom+bodies+of+Drosophila+melanogaster%3A+an+immunocytological+and+golgi+study+of+Kenyon+cell+organization+in+the+calyces+and+lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes.</a> Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).</li>
<li>Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swiss+Cheese%2C+a+protein+involved+in+progressive+neurodegeneration%2C+acts+as+a+noncanonical+regulatory+subunit+for+PKA-C3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3.</a> J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).</li>
<li>Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Tau+results+in+defects+in+photoreceptor+development+and+progressive+neuronal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).</li>
<li>Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+RhoA+prenylation+in+the+loechrig+%28loe%29+mutant+leads+to+progressive+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration.</a> PLoS One. 7, e44440(2012).</li>
<li>Wittmann, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+neurodegeneration+without+neurofibrillary+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QUALITATIVE+AND+QUANTITATIVE+ANALYSES+OF+EYE+PIGMENTS+AND+PTERIDINES+IN+BACK-MUTATIONS+OF+THE+MUTANT+wa+IN+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Hereditas%22%5BJournal%5D)">QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Hereditas. 46, 635-650 (1960).</li>
<li>Bettencourt da Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+MAP1B-related+protein+FUTSCH+leads+to+changes+in+the+neuronal+cytoskeleton%2C+axonal+transport+defects%2C+and+progressive+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila.</a> Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).</li>
<li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+expression+of+Swiss+cheese+%28SWS%29%2C+the+Drosophila+orthologue+of+neuropathy+target+esterase+%28NTE%29%2C+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).</li>
<li>Davis, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocerebrosidase+Deficiency+in+Drosophila+Results+in+alpha-Synuclein-Independent+Protein+Aggregation+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration.</a> PLoS Genet. 12, e1005944(2016).</li>
<li>Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+mediates+tau-induced+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila.</a> J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+expression+of+polyglutamine+proteins+induce+behavioral+changes+and+aggregate+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila.</a> Glia. 49, 59-72 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Tarif edilen yöntem, Drosophila beyinde nörodejenerasyonu ölçmek için bir araç sağlar. Belirli bir hücre tipi sayımı gibi diğer yöntemler, nörodejenerasyon tanımlamak için kullanılabilir, ancak bu yöntemin avantajı daha genel olarak uygulanabilir olmasıdır. hücrelerin sayılması bu hücrelerin güvenilir bir şekilde belirli bir antikor ya da her zaman mevcut değildir, bir hücreye özel markörün ekspresyonunu kullanarak tespit edilebilir olmasını gerektirir. Bundan başka, önemli ö...

beklenen yaşam süresinin artmasıyla birlikte, Alzheimer veya Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklar genel nüfus için artan bir sağlık tehdidi haline gelmiştir. Ulusal Sağlık Enstitüleri göre, 115 milyon insan, dünya çapında, altta yatan önemli bir ilerleme birçoğu için, bu hastalıkların en azından bazı rol oynayan genleri ve risk faktörlerini tanımlamada yapılmış olmasına rağmen 2050 yılında bunama etkilenecek tahmin edilmektedir moleküler mekanizmalar hala bilinmeyen ya da iyi anlaşılmış bulunmaktadır. Caenorhabditis elegans ve Drosophila melanogaster gibi basit omurgasız model organizma kısa bir yaşam döngüsü, döl çok sayıda ve köklü ve bazen de eşsiz genetik ve moleküler yöntemlerin 1 kullanılabilirliği de dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları incelemek için deneysel avantajlar sunuyoruz -12. Ayrıca, bu organizmaların tarafsız mükellef bulunmaktadırnörodejeneratif fenotipleri üzerine ağırlaştırıcı veya iyileştirmede etkileri ile bu hastalıklara katkıda bulunan faktörleri belirleyebilir etkileşim ekranlar. Böyle genetik etkileşimleri analiz ve yaşlanma etkilerini değerlendiren nörodejenerasyonu tespit etmek ve şiddetini ölçmek için nicel protokolleri gerektirir. Sayısal performans değeri 13-21 sağlamak gibi koku öğrenme, olumsuz geotaxis, ya da hızlı phototaxis olarak Drosophila davranış yönlerini, ölçerken Bu değerlendirme nispeten kolayca yapılabilir. Nöronlarının sayılması ile nöronal hayatta kalma etkileri belirlemek de mümkündür. PD etkilendiğini ve o zaman bile, sonuçları 22-24 tartışmalı olmuştur dopaminerjik nöronlar gibi, açıkça tanımlanabilir belirli bir nüfus odaklanarak Ancak, bu mümkündür. Burada açıklanan protokol parafin seri bölümleri gerçekleştirmek için yaka yöntemini kullanan bir yöntemBu aslında Drosophila 25 anatomik beyin mutantlar tecrit etmek için kullanılan Heisenberg ve Böhl, tarafından geliştirilmiştir. Yaka yönteminin kullanımı, daha sonra cryosections, vibratome bölümleri, ve plastik bölümlerin 26-28 de dahil olmak üzere, adapte edilmiştir. Burada, bu yöntem, daha sonra nörodejeneratif fenotipleri 16,21,29-32 olan sinekler gelişen hücre arası boşluklar ölçmek için kullanılabilir, tüm uçucu kafası seri bölümleri elde etmek için kullanılır. Bu ölçümler belirli beyin bölgelerinde yapılabilir ya da tüm beyin kapağı olabilir; İkinci yaklaşım yaşlanma sırasında gözlemlediği gibi biri bile zayıf dejeneratif fenotipleri tanımlamak için izin verir. yaka kullanıldığında, son olarak, 20 sinekler olan bir preparasyon olarak işlenebilir, sadece daha az zaman alan, ancak, aynı zamanda hafif değişikliklere eserler minimize, kumanda aynı hazırlanmasında deney sinekler analiz sağlar hazırlık.

<table><tbody><tr><td>Name of the Reagent/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Collar</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rubber ice cube tray for embedding</td><td>Household store</td><td></td><td>The size can be made-to-fit by glueing in additional walls&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Crystallizing dish</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Methylbenzoate</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Distinct Odor - Use in fume hood!</td></tr><tr><td>Low Melting Point Paraffin Wax</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Make sure to keep extra melted in a 65&amp;deg;C waterbath</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Three different containers for washes</td></tr><tr><td>Vertical Staining Jar with Cover</td><td>Ted Pella Inc.&amp;nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mass histology to quantify neurodegeneration in drosophila

Alzheimer hastalığı (AH) veya Parkinson hastalığı (PH) gibi ilerici nörodejeneratif hastalıklar dünya çapında insan sağlığı için artan bir tehdit vardır. Memeli modeller patojenite altında yatan mekanizmaların önemli bilgiler vermiş olsa da, birlikte maliyeti yüksek olan memeli sistemlerin karmaşıklığı kullanımını sınırlayan. Bu nedenle, basit ama köklü Drosophila modeli sistemi bu hastalıklarda etkilenen moleküler yolları araştırmak için bir alternatif sunuyor. Davranış bozukluklarla birlikte, nörodejeneratif hastalıklar, nöron ölümü ve axonopathy Histolojik fenotip ile karakterize edilir. nöronal dejenerasyonu ölçmek için ve genetik ve çevresel faktörlerden nasıl etkilendiğini belirlemek için, erişkin sinek beyinlerinde vakuoller ölçme dayalı bir histolojik yaklaşım kullanın. sistematik hata etkilerini en aza indirmek için doğrudan kontrol ve exp bölümler karşılaştırmak içinbir hazırlık erimental sinekler, biz parafin kesitler için &#39;yaka&#39; yöntemini kullanın. Nörodejenerasyon daha sonra uçucu beyin gelişmiştir vakuollerin boyutu ve / veya sayısı ölçülerek değerlendirilir. Bu da ilgi belirli bir bölgeye odaklanarak ya da tam kafa yayılan seri bölümleri alarak, tüm beyin analiz yapılabilir. Normal yaşlanma sırasında oluşur Bu nedenle, bu yöntem, bir ağır dejenerasyon değil, aynı zamanda bir kaç bölümlerde sadece saptanabilir nispeten hafif fenotipleri sadece ölçmek için sağlar.

Tüm sinek kafasını kapsayacak göz pigmenti 33 ile boyanan seri bölümlerde açıklanan yöntem sonuçları kullanarak. Bunun bir kısmı tek bir kafa bölümleri üstten alta gösterilir Şekil 1B, &#39;de gösterilmiştir. Farklı sineklerden bölümleri bu örnekte soldan sağa görülür. Yönlendirme ve sineklerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, bir gözsüz sinek (sinüs oculis) konumuna 3 (ok, Şekil 1B) bir belir...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila at JoVE.com

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir.

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

mass-histology-to-quantify-neurodegeneration-in-drosophila

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

10.1K Görüntüleme.  Oregon Health & Sciences University.  Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir. 

Video: Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Nörobilim

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Genetik

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Gelişim Biyolojisi

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Drosophila melanogaster'de Akson Ölümü Sırasında Aksonların ve Sinapslarının Morfolojik ve Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

Nörodejenerasyon ile Birlikte Erişkin Drosophila'da Sinaptik Dejenerasyonun Görselleştirilmesi

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Direct Cryosectioning of Drosophila Heads for Enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression patterns. Traditional methods often involve challenges such as performing complex dissection, maintaining tissue integrity, and visualizing specific expression patterns during high-resolution imaging. We present an optimized protocol that combines cryosectioning with fluorescence staining and immunostaining. This method improves tissue preservation and signal clarity and reduces the need for laborious dissection for Drosophila brain imaging. The method entails rapid dissection, optimal fixation, cryoprotection, and cryosectioning, followed by fluorescent staining and immunostaining. The protocol significantly reduces tissue damage, enhances antibody penetration, and yields sharp, well-defined images. We demonstrate the effectiveness of this approach by visualizing specific neural populations and synaptic proteins with high fidelity. This versatile method allows for the analysis of various protein markers in the adult brain across multiple z-planes and can be adapted for other tissues and model organisms. The protocol provides a reliable and efficient tool for researchers conducting high-quality immunohistochemistry in Drosophila neurobiology studies. This method's detailed visualization facilitates comprehensive analysis of neuroanatomy, pathology, and protein localization, making it particularly valuable for neuroscience research.

This study presents a simplified protocol for tissue processing involving decapitation, fixation, cryosectioning, fluorescence staining, immunostaining, and imaging, which can be extended to confocal and multiphoton imaging. The method maintains efficacy comparable to complex dissections, bypassing the need for advanced motor skills. Quantitative image analysis provides extensive investigative potential.

Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

Drosophila'da Dorsal Longitudinal Kas Nöromüsküler Kavşaklarının Yapısal Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize

Özet

Daha Fazla Video Keşfet