This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).

1. Befestigung des Kopfes auf Krägen und Einbettung in Paraffin Hinweis: Alle Schritte in dem Fixierungsprozess sollte in einem Abzug durchgeführt werden. Methylbenzoat, während kein gesundheitliches Risiko darstellen, hat einen sehr deutlichen Geruch, die überwältigend sein kann, wenn nicht in einem Abzug behandelt. <ol><li> Bevor die Fliegen anesthetizing, bilden 50 ml Carnoy-Lösung durch Zugabe von 15 ml Chloroform und 5 ml Eisessig auf 30 ml 99% Ethanol (nicht das Chloroform mischen und Essigsäure). Gießen Sie es in einem Glasbehälter mit einem flachen Boden, wie ein Kristallierschale, um sicherzustellen, dass die Kragen flach legen kann und vollständig von der Lösung bedeckt. </li><li> Anesthetize die Fliegen mit CO 2 oder Äther. </li><li> Thread Fliegen (bis zu 20 bei den meisten Krägen) durch den Hals in die Krägen mit einer Pinzette. Denken Sie daran , alle Köpfe in der gleichen Orientierung auszurichten, wie in 1A zu sehen ist , und sanft sein , um sicherzustellen , dass keine Beschädigung des Kopfes oder der Augen auftritt. </li><li> Umfassen sine oculis Fliegen (Pfeile, 1A) an zufälligen Positionen so dass die Reihenfolge der Fliegen können leicht in den Abschnitten identifiziert werden. Darüber hinaus, wenn die experimentellen Fliegen einen hellen oder weißen Augenfarbe haben, Gewinde einige rote Augen Fliegen, wie Wildtyp, zwischen ihnen, dass genügend Pigment, um sicherzustellen, vorhanden ist, um die Folie zu färben. Notieren Sie sich die Reihenfolge der Fliegen auf einem Protokollblatt zusammen mit dem Bund Nummer, wenn mehr als ein Kragen verwendet wird. </li><li> Sobald ein Kragen abgeschlossen ist, legen Sie sie in die vorbereitete Carnoy-Lösung für 3,5 - 4 Std. </li><li> Dump die Carnoy-Lösung in den entsprechenden Entsorgungsbehälter und die Ethanol wäscht beginnen. Stellen Sie sicher, langsam zu gießen, um nicht die Platzierung der Krägen in dem Behälter zu stören. </li><li> Waschen Sie die Kragen für 30 min in 99% Ethanol zweimal. </li><li> Waschen Sie die Krägen in 100% Ethanol für 1 h. Achten Sie darauf, die Waschungen auf Zeit zu ändern overdehydration zu verhindern. </li><li> Setzen Sie die Kragen in methylbenzoateO / N bei RT. Abdichten des Behälters mit Parafilm die Verdampfung des methylbenzoat zu verhindern. </li><li> Gießen Sie die methylbenozate in die richtige Einwegbehälter in der Abzugshaube. Fügen Sie eine zuvor hergestellte Mischung von 1: 1 mit niedrigem Schmelzpunkt (56 - 57 ° C) Paraffinwachs und methylbenzoate. Von diesem Zeitpunkt an müssen die Kragen in einem Inkubator bei 65 ° C gehalten werden, um sicherzustellen, dass das Paraffin nicht aushärtet. </li><li> Gießen Sie die methylbenozate und Paraffingemisch in die richtige Einwegbehälter, und gießen geschmolzene reine Paraffinwachs, gehalten bei 65 ° C, auf den Kragen. </li><li> Ändern Sie das Paraffin nach 30 Minuten und wiederholen Sie diesen mindestens 5-mal. Mindestens 6 - 8 Waschungen durchgeführt werden sollte. </li><li> Sobald die Waschungen abgeschlossen sind, legen Sie die Kragen in einen Gummieiswürfelschale mit Schlitzen in etwa die Größe der Kragen. Gießen geschmolzene Paraffin über sie, bis sie vollständig bedeckt und lassen Sie es O zu härten / N (versuchen Sie Luftblasen zu vermeiden). </li><li> Entfernen Sie die Paraffinblöcke containing die Kragen aus dem Eiswürfelschale. Trennen Sie den Paraffinblock vom Kragen mit einer Rasierklinge, sanft den Kragen abbrach. Die Köpfe werden im Paraffinblock, während die Körper im Kragen bleiben. Die Blöcke können bei Raumtemperatur gehalten werden. </li><li> Um die Kragen reinigen, genießen sie in einem deparafinization Mittel bei 65 ° C, um das Paraffin, sauber und mit Licht Wäsche zu entfernen und waschen in Ethanol vor der Wiederverwendung. </li></ol> 2. Sectioning und Montage <ol><li> Aufzuwärmen eine Heizplatte auf 50 ° C. Legen Sie die Objektträger (oder Metallmontageblöcke) und Rasierklingen auf der Platte und lassen Sie sie erwärmen. </li><li> Je nach der gewünschten Ausrichtung zum Schneiden, befestigen den Block Paraffin entweder mit den Köpfen in Richtung der Seite (für horizontale Segmente) oder nach oben (zum frontalen Abschnitte) zu einem beheizten Befestigungsblock (kurz den Block an der Kontaktseite Schmelzen). Entfernen Sie den Block von der Heizplatte und lassen Sie es mindestens 10 mi abkühlenn, um sicherzustellen, dass das Paraffin für eine einwandfreie Abdichtung auf den Befestigungsblock genügend ausgehärtet ist. Halten Sie die Reihe der Köpfe parallel ausgerichtet mit der Oberfläche des Blocks so viel wie möglich Unebenheiten zu verhindern. </li><li> Nehmen Sie eine Rasierklinge und schneiden Sie das überschüssige Paraffin weg von den Fliegenköpfen, so dass nur eine kleine Reihe mit den eingebetteten Köpfen bleibt (der Rasierklinge bis zum leichteren Trimmen erwärmt werden). Achten Sie darauf, nicht zu viel zu trimmen, so dass das Paraffin nicht während des Schneidens (mehr Trimmen kann während des Schneidens erfolgen) nicht bricht. </li><li> Platzieren des Montageblocks in den Objekthalter des Mikrotoms und sicherzustellen, dass die Ausrichtung der Reihe von Köpfe möglichst parallel zu dem Rand der Klinge. </li><li> Bereiten Sie Mikroskop-Objektträger, indem sie mit einer dünnen Schicht aus Poly-L-Lysin (PLL) Lösung abdeckt und lassen Sie sie für 5 Minuten trocknen lassen. Decken Sie sie mit Wasser kurz vor dem Gebrauch. </li><li> Schneiden 7 um Abschnitte und übertragen das Band der Abschnitte mit dem Schlitten auf dem Wasser schwimmen. &lt;br /&gt; Hinweis: Um das gesamte Gehirn für horizontale Schnitte zu erhalten, sammeln wir das Band von beim Start in das Auge zu schneiden, bis der Kopf vollständig geschnitten wurde (von den Rüssel in das Gehirn schneiden). Mehr als eine Folie kann für den gesamten Kopf benötigt werden. </li><li> Legen Sie die Folie auf einer Heizplatte bei 37 ° C und lassen Sie das Band für ca. 1 min zu erweitern. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Wasser (Aus- oder mit einem Gewebe Gießen) und trocknen Sie die Dias O / N. </li><li> Entfernen Sie das Paraffinwachs aus dem Schlitten durch die Folien in einem hohen, vertikalen Schiebe Färbeküvette mit einem deparafinization Mittel gefüllt platzieren (vollständig die Abschnitte abdeckt). Führen Sie 3 Waschungen von 30 min - 60 min je. </li><li> Entfernen Sie die Folie aus der letzten Wäsche. Platz 2 Tropfen Einbettungsmittel auf die Folie und decken Sie es mit einem großen Deckglas. </li></ol> 3. Fotografieren und Analyse der Bereiche <ol><li> Lassen Sie die vorbereiteten Objektträger 1 zum Trocknen - 2 d. Dann untersuchen sie auf einem Fluoreszenz Microscope unter blauem Licht. </li><li> Verwenden Sie eine niedrigere Vergrößerung der Ausrichtung der Fliegen zu bestimmen und die Region von Interesse zu finden, wenn auf eine bestimmte Region konzentrieren. HINWEIS: Für die sws Fliegen (siehe Abbildung 2), finden wir den Abschnitt, der die große Kommissur enthält und ein Bild nehmen ( in der Regel bei 40 - facher Vergrößerung). Wenn das gesamte Gehirn Analyse (wie in Abbildung 3), blättern wir durch alle Abschnitte aus einem Kopf und entweder fotografieren Sie den Abschnitt mit den schwersten Phänotyp oder alle Abschnitte , die Vakuolen zeigen. </li><li> Für eine Doppelblind-Analyse nehmen und die Anzahl Bilder, ohne den Genotyp zu kennen und den Kragen Nummer und Position des Kopfes in der Reihe aufnehmen um sie später zu identifizieren. </li><li> Sobald die Bilder aufgenommen wurden, analysieren sie eine Imaging-Software verwenden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Vakuolen pro Abschnitt oder pro Kopf. Um die Vakuole Größe messen, öffnen Sie die Bilder in einem Software-Programm und wählen Sie die Vakuolen mit einer Auswahl zul. Bestimmen die Anzahl der Pixel in der ausgewählten Vakuolen. </li><li> Für die Umstellung auf &amp; mgr; m 2, nehmen Sie ein Foto von einem Stufenmikrometer Kalibrierungsdia an der Vergrößerung für den Erwerb von Fotos verwendet. Bestimmung der Menge von Pixeln in 100 &amp; mgr; m 2 einen Umrechnungsfaktor zu berechnen. </li><li> Wandeln die Gesamtpixelzahl in &amp; mgr; m 2 durch die Anzahl der Pixel mit dem Umrechnungsfaktor in dem obigen Schritt berechnet dividiert wird . </li></ol>

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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das beschriebene Verfahren stellt ein Mittel Neurodegeneration im Gehirn von Drosophila zu quantifizieren. Während andere Methoden, wie einen spezifischen Zelltyp zu zählen, kann die Neurodegeneration zu identifizieren, verwendet werden, ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass es im Allgemeinen angewendet werden kann. Zählen erfordert, dass Zellen können diese Zellen zuverlässig identifiziert werden unter Verwendung entweder eines spezifischen Antikörpers oder die Expression eines zellspezifischen Marker,...

Mit der Zunahme der Lebenserwartung haben neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer oder Parkinson eine zunehmende Gesundheitsbedrohung für die allgemeine Bevölkerung geworden. Nach Angaben der National Institutes of Health, 115 Millionen Menschen weltweit sind voraussichtlich von Demenz im Jahr 2050 betroffen sein Obwohl erhebliche Fortschritte für viele von ihnen bei der Identifizierung von Genen und Risikofaktoren beteiligt in zumindest einige dieser Krankheiten gemacht worden, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch nicht bekannt oder nicht gut verstanden. Einfache invertebrate Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster bieten eine Vielzahl von experimentellen Vorteile , die Mechanismen von neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen, einschließlich eines kurzen Lebenszyklus, eine große Anzahl von Nachkommen, und die Verfügbarkeit von gut etablierten und manchmal einzigartigen genetischen und molekularen Methoden 1 -12. Weiterhin sind diese Organismen zugänglich unvoreingenommeneInteraktion Bildschirme, die Faktoren, die zu diesen Krankheiten, die durch ihre erschwerende oder lindernde Wirkung auf neurodegenerative Phänotypen identifizieren können. Die Analyse solcher genetischer Interaktionen und Beurteilung Alterungseffekte erfordert quantitative Protokolle Neurodegeneration zu erkennen und deren Schweregrad zu messen. Diese Bewertung kann relativ einfach durchgeführt werden , wenn Verhaltensaspekte in Drosophila, wie olfaktorische Lernen, negativ geotaxis oder schnelle Phototaxis zu messen, die 13-21 einen numerischen Leistungswert. Es ist auch möglich, die Wirkungen auf das neuronale Überleben durch Zählen Neuronen zu bestimmen. Dies ist jedoch nur möglich , wenn auf einer bestimmten Population konzentrieren , die eindeutig identifizierbar sind , wie die dopaminergen Neuronen, die bei Parkinson betroffen sind, und selbst dann waren die Ergebnisse umstritten 22-24. Das hier beschriebene Protokoll verwendet den Kragen Methode Paraffin Serienschnitte durchzuführen, ein Verfahrendas ursprünglich von Heisen und Böhl entwickelt, der es verwendet , um das Gehirn anatomisch Mutanten von Drosophila 25 isolieren. Die Verwendung des Kragens Methode wurde anschließend angepasst, in Kryoschnitten einschließlich Vibratom Abschnitte und Kunststoffprofile 26-28. Hier wird diese Methode Serienschnitte des gesamten Fliegenkopf zu erhalten , verwendet werden , die dann dazu verwendet werden kann , die Vakuolen zu messen , die 16,21,29-32 in Fliegen mit neurodegenerative Phänotypen zu entwickeln. Diese Messungen können in bestimmten Gehirnbereichen durchgeführt werden oder kann das gesamte Gehirn bedecken; der letztere Ansatz ermöglicht es, selbst schwache degenerative Phänotypen zu identifizieren, da während des Alterns beobachtet. Wenn schließlich der Kragen verwendet wird, kann bis zu 20 Fliegen wie einer Zubereitung verarbeitet werden, die nicht nur weniger zeitaufwendig, sondern ermöglicht auch die Analyse von Kontroll- und experimentellen Fliegen in der gleichen Zubereitung, Artefakte aufgrund von geringen Änderungen minimiert in die Vorbereitung.

<table><tbody><tr><td>Name of the Reagent/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Collar</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rubber ice cube tray for embedding</td><td>Household store</td><td></td><td>The size can be made-to-fit by glueing in additional walls&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Crystallizing dish</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Methylbenzoate</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Distinct Odor - Use in fume hood!</td></tr><tr><td>Low Melting Point Paraffin Wax</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Make sure to keep extra melted in a 65&amp;deg;C waterbath</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Three different containers for washes</td></tr><tr><td>Vertical Staining Jar with Cover</td><td>Ted Pella Inc.&amp;nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mass histology to quantify neurodegeneration in drosophila

Progressive neurodegenerative Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit (AD) oder Parkinson-Krankheit (PD) sind weltweit eine zunehmende Bedrohung für die menschliche Gesundheit. Obwohl Säugetiermodelle wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der Pathogenität zur Verfügung gestellt haben, begrenzen die Komplexität von Säugetiersystemen zusammen mit ihren hohen Kosten ihre Verwendung. Daher stellt die einfache , aber gut etablierte Drosophila - Modell-System eine Alternative für die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die bei diesen Erkrankungen betroffen sind. Neben Verhaltensdefizite sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch histologische Phänotypen wie neuronaler Tod und Axonopathie charakterisiert. Um neuronale Degeneration zu quantifizieren und zu bestimmen, wie sie durch genetische und Umweltfaktoren beeinflusst wird, verwenden wir einen histologischen Ansatz, der auf die Messung der Vakuolen in erwachsenen Fliege Gehirn basiert. Um die Auswirkungen der systematischen Fehler minimieren und direkt vergleichen Abschnitte von Steuerung und experimental Fliegen in einem Präparat, verwenden wir den &#39;Kragen&#39; Methode für Paraffinschnitten. Neurodegeneration wird dann durch Messen der Größe und / oder Anzahl der Vakuolen beurteilt, die in der Flug Gehirn entwickelt haben. Dies kann entweder durch die Konzentration auf eine bestimmte Region von Interesse durchgeführt werden oder durch das gesamte Gehirn Analyse von Serienschnitten zu erhalten, die den gesamten Kopf erstrecken. Daher ermöglicht dieses Verfahren nicht nur eine schwere Degeneration zu messen, sondern auch relativ mild Phänotypen, die nur nachweisbar in einigen Abschnitten sind, wie während der normalen Alterung auftritt.

Mit Hilfe der beschriebenen Methode führt in Serienschnitten durch das Auge Pigment gefärbt 33, die das gesamte Fliegenkopf umfassen. Ein Teil davon ist in 1B gezeigt, wobei die Abschnitte von einem einzelnen Kopf von oben nach unten dargestellt. Die Abschnitte aus verschiedenen Fliegen werden in diesem Beispiel nach rechts gesehen links. Zur Orientierung und Identifizierung der Fliegen zu erleichtern, ein eyeless fly (sine oculis) als Marker an Pos...

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Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.

Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

mass-histology-to-quantify-neurodegeneration-in-drosophila

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

10.1K Aufrufe.  Oregon Health & Sciences University.  Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe. 

Serie: Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Forschung

Neurowissenschaften

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Genetik

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Entwicklungsbiologie

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Axonen und ihren Synapsen während des Axon-Todes bei Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

Visualisierung der synaptischen Degeneration bei erwachsenen Drosophila in Verbindung mit Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Direct Cryosectioning of Drosophila Heads for Enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression patterns. Traditional methods often involve challenges such as performing complex dissection, maintaining tissue integrity, and visualizing specific expression patterns during high-resolution imaging. We present an optimized protocol that combines cryosectioning with fluorescence staining and immunostaining. This method improves tissue preservation and signal clarity and reduces the need for laborious dissection for Drosophila brain imaging. The method entails rapid dissection, optimal fixation, cryoprotection, and cryosectioning, followed by fluorescent staining and immunostaining. The protocol significantly reduces tissue damage, enhances antibody penetration, and yields sharp, well-defined images. We demonstrate the effectiveness of this approach by visualizing specific neural populations and synaptic proteins with high fidelity. This versatile method allows for the analysis of various protein markers in the adult brain across multiple z-planes and can be adapted for other tissues and model organisms. The protocol provides a reliable and efficient tool for researchers conducting high-quality immunohistochemistry in Drosophila neurobiology studies. This method's detailed visualization facilitates comprehensive analysis of neuroanatomy, pathology, and protein localization, making it particularly valuable for neuroscience research.

This study presents a simplified protocol for tissue processing involving decapitation, fixation, cryosectioning, fluorescence staining, immunostaining, and imaging, which can be extended to confocal and multiphoton imaging. The method maintains efficacy comparable to complex dissections, bypassing the need for advanced motor skills. Quantitative image analysis provides extensive investigative potential.

Direkte Kryosektion von Drosophila-Köpfen zur verbesserten Fluoreszenzfärbung und Immunfärbung des Gehirns

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

Beurteilung der strukturellen Integrität der neuromuskulären Verbindungen des dorsalen Längsmuskels bei Drosophila

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in

Zusammenfassung

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