This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).

1. תיקון הראש על כלב והטבעת פרפין הערה: כל אחד מהשלבים בתהליך הקיבוע צריך להיעשות במנדף. Methylbenzoate, ואילו לא המהווים סיכון בריאותי, יש שהריח מן המעלה הראשונה, יכול להיות מכריע אם לא מטופלים במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הרדמה זבובים, לפצות 50 מ&quot;ל של תמיסת Carnoy על ידי הוספת 15 מ&quot;ל של כלורופורם 5 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית 30 מ&quot;ל של 99% אתנול (לא לערבב את כלורופורם וחומצה אצטית). יוצקים אותו במיכל זכוכית עם תחתית שטוחה, כגון צלחת crystalizing, על מנת להבטיח כי צווארונים יכול להניח שטוח מכוסים לחלוטין על ידי פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים עם CO 2 או אתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זבובי נושא (עד 20 עם רוב הצווארונים) בצווארם ​​לתוך הצווארונים באמצעות מלקחיים. זכור כדי ליישר את כל הראשים באותו הכיוון, כפי שניתן לראות באיור 1 א, ו להיות עדין כדי לוודא ששום הנזק עולה על הראש או העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול זבובי oculis סינוס (חיצים, איור 1 א) על עמדות אקראיות כך שההסדר של הזבובים ניתן לזהות בקלות בסעיפים. בנוסף, אם הזבובים הניסיונות יש צבע עיניים בהיר או לבן, חוט כמה זבובים עם עיניים אדומות, כגון סוג בר, ביניהם כדי להבטיח פיגמנט מספיק נוכחת להכתים את השקופית. רשמו את סדר הזבובים על גיליון פרוטוקול יחד עם מספר צווארון אם משתמשים בכמות גדולה ממנת צווארון אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צווארון כבר סיימתי, למקם אותו פתרון Carnoy המוכן תמורת 3.5 - 4 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dump את הפתרון Carnoy לתוך הגליל לרשות המתאימה ולהתחיל שוטף אתנול. ודא לשפוך לאט כדי לא להפריע את המיקום של הצווארונים בתוך המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצווארונים למשך 30 דקות באתנול 99% פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את צווארונים באתנול 100% במשך 1 שעה. הקפד להחליף את הכביסות בזמן כדי למנוע overdehydration. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צווארוני methylbenzoateO / N ב RT. חותם את המיכל עם parafilm כדי למנוע אידוי של methylbenzoate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק את methylbenozate לתוך המכל הפנוי הנאה במנדף. להוסיף תערובת בעבר הכנה של 1: 1 נקודת התכה נמוכה (56 - 57 ° C) פרפין שעווה methylbenzoate. מנקודה זו ואילך, הצווארונים צריכים להישמר באינקובטור ב 65 מעלות צלזיוס כדי לוודא כי פרפין אינו להקשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את תערובת methylbenozate פרפין לתוך המכל הפנוי הנכון, ויוצקי פראפין טהור מותך, שמור על 65 מעלות צלזיוס, על הצווארונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את פרפין לאחר 30 דקות וחזרו לפחות 5 פעמים זה. לפחות 6 - 8 שוטף צריכה להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכביסות הושלמו, למקם את הצווארונים לתוך מגש קוביות קרח גומי עם חריצים בערך בגודל של הצווארונים. יוצקים פרפין מותך מעליהם עד מכוסה לחלוטין ולאפשר לו להקשיח O / N (מנסה למנוע בועות אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אבני פרפין contaiנינג הקולרים ממגש קוביית קרח. הפרד את בלוק פרפין מן הצווארון באמצעות סכין גילוח, בעדינות לנתק איתם את הצווארון. הראשי יהיה בבלוק פרפין ואילו הגופים יישארו הצווארון. אבני יכולים להישמר בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את צווארונים, להשרות אותם סוכן deparafinization על 65 מעלות צלזיוס להסיר את פרפין, נקי עם קרצוף אור, ולשטוף באתנול לפני שימוש חוזר. </li></ol> 2. חתך השמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם צלחת חימום עד 50 מעלות צלזיוס. מניח את מחזיקי אובייקט (או בלוקי הרכבת מתכת) ו סכיני גילוח על הצלחת ולתת להם להתחמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לכיוון הרצוי עבור חתך, לצרף את בלוק פרפין או עם הראשים כלפי הצד (סעיפים אופקיים) או כלפי מעלה (סעיפים חזיתית) כדי לחסום הרכבה מחוממת (בקצרה המסת הבלוק בצד המגע). הסר את הבלוק מן צלחת החימום ולאפשר לו להתקרר במשך לפחות 10 מייליםn על מנת להבטיח כי פרפין הוא קשוח מספיק עבור הדפסה נאותה על לחסום את ההרכבה. שמור על השורה של הראשים מיושרים במקביל פני השטח של הגוש ככל האפשר כדי למנוע חלקים אחידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח סכין גילוח וקוצץ את פרפין לנזול החוצה מהראשים לטוס כך שורה קטנה רק עם ראשי המוטבע נשארת (סכין הגילוח ניתן התחמם עבור זמירה קלה). ודא שלא לקצץ יותר מדי כך פרפין לא לשבור במהלך חתך (יותר זמירה יכול להיעשות במהלך חתך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גוש הרכבה לתוך מחזיק אובייקט של microtome ולהבטיח כי היישור של שורת ראשי מקביל ככל האפשר אל קצה הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שקופיות מיקרוסקופ על ידי מכסה אותם עם שכבה דקה של פתרון poly-L- ליזין (PLL) ולתת להם להתייבש במשך 5 דקות. מכסים אותם במים זמן קצר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 7 סעיפים מיקרומטר ולהעביר את סרט סעיפים לשקופית צף על פני המים. &lt;br /&gt; הערה: כדי להשיג את המוח כולו לחלקים אופקיים, אנו אוספים את הסרט מתוך כאשר מתחילים לחתוך לתוך העין עד הראש נחתך לחלוטין (חיתוך מן החוטם לתוך המוח). יותר משקופית אחת עשויה להיות נחוצה עבור כל הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על צלחת חום על 37 מעלות צלזיוס ולאפשר סרט להרחיב בערך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של עודפי מים (על ידי שפיכת אותו או באמצעות רקמות) ומייבשים את השקופיות O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שעוות פרפין משקופית ידי צבת את השקופיות בצנצנת שקופיות מכתימות גבוהה, אנכית מלאה סוכן deparafinization (לגמרי מכסה את הסעיפים). בצע 3 שוטף של 30 דק &#39;- 60 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את השקופית מן לשטוף הסופי. מניחים 2 טיפות של התקשורת הטבעה לשקופית ולכסות אותו עם coverslip גדול. </li></ol> 3. לצלם וניתוח סעיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר השקופיות המוכנות להתייבש במשך 1 - 2 ד. לאחר מכן בחן אותם על microsc הקרינהאופ תחת אור כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהגדלה נמוכה כדי לקבוע את הכיוון של זבובים כדי למצוא את האזור של עניין אם מתמקדים באזור מסוים. הערה: לקבלת זבובי SWS (ראה איור 2), אנו מוצאים את החלק המכיל השליך הגדול ולקחת תמונה (בדרך כלל 40X גדלה). כאשר מנתחים את המוח כולו (כמו באיור 3), אנו לגלול בין כל הקטעים מתוך ראש או לצלם את החלק עם פנוטיפ החמור ביותר או כל החלקים שמראים vacuoles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח כפול סמיות, לקחת ותמונות מספר בלי לדעת את הגנוטיפ ולהקליט את מספר צווארון המיקום של הראש בשורה לזהות אותם מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התמונות ננקטו, ולנתח אותם באמצעות תוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת vacuoles לכל סעיף או לנפש. כדי למדוד את גודל vacuole, לפתוח את התמונות מתוך התוכנה ובחר את vacuoles עם מבחר מדיl. לקבוע את כמות הפיקסלים vacuoles שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמרת מיקרומטר 2, לצלם תמונה של שקופית כיול מיקרומטר הבמה בהגדלה משמשת עבור רכישת תמונות. לקבוע את כמות הפיקסלים 100 מיקרומטר 2 כדי לחשב את מקדם המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את מספר הפיקסלים הכולל לתוך מיקרומטר 2 על ידי חלוקת מספר הפיקסלים במקדם ההמרה מחושב בשלב לעיל. </li></ol>

<ol>
	<li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer's+disease+and+other+neurodegenerative+diseases.">Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Front Genet. 5, 279 (2014).</li><li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila.">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).</li><li>Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+experimental+tool+for+the+study+of+complex+neurological+diseases:+Parkinson's+disease,+Alzheimer's+disease+and+autism+spectrum+disorder.">Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder.</a> Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).</li><li>Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+C.+elegans+to+discover+therapeutic+compounds+for+ageing-associated+neurodegenerative+diseases.">Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases.</a> Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodegenerative+diseases+in+transgenic+systems.">Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems.</a> Hum Genet. 131, 535-563 (2012).</li><li>Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+mechanisms+that+underlie+human+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila.">Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).</li><li>Konsolaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruitful+research:+drug+target+discovery+for+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila.">Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila.</a> Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).</li><li>Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+mutants+in+Drosophila:+a+means+to+identify+genes+and+mechanisms+involved+in+human+diseases.">Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases.</a> Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).</li><li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swiss+cheese+et+allii,+some+of+the+first+neurodegenerative+mutants+isolated+in+Drosophila.">Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila.</a> J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).</li><li>Li, J., Le, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+diseases+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).</li><li>Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+for+Alzheimer's+disease.">Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 8, (2013).</li><li>Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+and+tauopathy+studies+in+flies+and+worms.">Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms.</a> Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).</li><li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+locomotor,+learning,+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration.">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Barone, M. C., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+neurodegenerative+phenotypes+in+Drosophila+dopaminergic+neurons+by+climbing+assays+and+whole+brain+immunostaining.">Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining.</a> J Vis Exp. , e50339 (2013).</li><li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+expression+of+Swiss-cheese+(SWS),+the+Drosophila+orthologue+of+Neuropathy+Target+Esterase,+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function.">Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. , (2015).</li><li>Iijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta42+mutants+with+different+aggregation+profiles+induce+distinct+pathologies+in+Drosophila.">Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila.</a> PLoS One. 3, e1703 (2008).</li><li>Krishnan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+circadian+clock+accelerates+aging+in+neurodegeneration-prone+mutants.">Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants.</a> Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+and+its+use+in+a+genetic+screen+for+modifiers+of+Abeta(42)-induced+locomotor+decline+in+Drosophila.">Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila.</a> Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).</li><li>Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+phosphorylations+differentiate+Tau-dependent+learning+deficits+and+premature+mortality+in+Drosophila.">Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila.</a> Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).</li><li>Ping, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+abeta42-induced+hyperexcitability+to+neurodegeneration,+learning+and+motor+deficits,+and+a+shorter+lifespan+in+an+Alzheimer's+model.">Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model.</a> PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).</li><li>Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Induction+of+Human+NTE+(PNPLA6)+Rescues+Neurodegeneration+and+Mobility+Defects+of+Drosophila+swiss+cheese+(sws)+Mutants.">Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants.</a> PLoS One. 10, e0145356 (2015).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).</li><li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson's+disease+in+Drosophila+melanogaster.">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).</li><li>Navarro, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dopaminergic+neuronal+dysfunction+in+genetic+and+toxin-induced+models+of+Parkinson's+disease+in+Drosophila.">Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila.</a> J Neurochem. 131, 369-382 (2014).</li><li>Heisenberg, M., B&#246;hl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+anatomical+brain+mutants+of+Drosophila+by+histological+means.">Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means.</a> Zeitschrift f&#252;r Naturforschung C. 34, 143 (1979).</li><li>Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+brain+revisited+by+enhancer+detection.">The Drosophila brain revisited by enhancer detection.</a> J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).</li><li>Lin, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+in+situ+brain+imaging+for+mapping+the+Drosophila+connectome.">Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome.</a> J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).</li><li>Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mushroom+bodies+of+Drosophila+melanogaster:+an+immunocytological+and+golgi+study+of+Kenyon+cell+organization+in+the+calyces+and+lobes.">The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes.</a> Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).</li><li>Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swiss+Cheese,+a+protein+involved+in+progressive+neurodegeneration,+acts+as+a+noncanonical+regulatory+subunit+for+PKA-C3.">Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3.</a> J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).</li><li>Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Tau+results+in+defects+in+photoreceptor+development+and+progressive+neuronal+degeneration+in+Drosophila.">Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).</li><li>Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+RhoA+prenylation+in+the+loechrig+(loe)+mutant+leads+to+progressive+neurodegeneration.">Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration.</a> PLoS One. 7, e44440 (2012).</li><li>Wittmann, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauopathy+in+Drosophila:+neurodegeneration+without+neurofibrillary+tangles.">Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li><li>Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QUALITATIVE+AND+QUANTITATIVE+ANALYSES+OF+EYE+PIGMENTS+AND+PTERIDINES+IN+BACK-MUTATIONS+OF+THE+MUTANT+wa+IN+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Hereditas. 46, 635-650 (1960).</li><li>Bettencourt da Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+MAP1B-related+protein+FUTSCH+leads+to+changes+in+the+neuronal+cytoskeleton,+axonal+transport+defects,+and+progressive+neurodegeneration+in+Drosophila.">Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila.</a> Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).</li><li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila.">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).</li><li>Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+expression+of+Swiss+cheese+(SWS),+the+Drosophila+orthologue+of+neuropathy+target+esterase+(NTE),+is+required+for+neuronal+ensheathment+and+function.">Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function.</a> Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).</li><li>Davis, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocerebrosidase+Deficiency+in+Drosophila+Results+in+alpha-Synuclein-Independent+Protein+Aggregation+and+Neurodegeneration.">Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration.</a> PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).</li><li>Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+mediates+tau-induced+neurodegeneration+in+Drosophila.">Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila.</a> J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).</li><li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+expression+of+polyglutamine+proteins+induce+behavioral+changes+and+aggregate+formation+in+Drosophila.">Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila.</a> Glia. 49, 59-72 (2005).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy.">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השיטה המתוארת מספק אמצעי לכמת ניוון מוחיים במוח של דרוזופילה. בעוד שיטות אחרות, כמו לספור לסוג תא מסוים, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות ניווניות של מערכת העצבים, את היתרון של שיטה זו הוא כי זה יכול להיות מיושם באופן כללי יותר. ספירת תאים דורשת כי תאים אלה יכולים להיות ...

עם העלייה בתוחלת החיים, מחלות ניווניות כמו אלצהיימר או פרקינסון הפכו איום בריאותי הגובר באוכלוסיה הכללית. על פי המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב, 115 מיליון אנשים ברחבי העולם הם חזו להיות מושפעים דמנציה בשנת 2050. למרות התקדמות משמעותית נעשתה בזיהוי גנים וגורמי סיכון מעורבים לפחות חלק ממחלות אלה, עבור רבים מהם, נכס הבסיס מנגנונים מולקולריים עדיין אינם ידועים או לא הבין היטב. אורגניזמים מודל חסרי חוליות פשוטות כמו elegans Caenorhabditis ו תסיסנית מציעים מגוון רחב של יתרונות הניסיונות כדי לחקור את המנגנונים של מחלות ניווניות, כוללים מחזור חיים קצר, מספר רב של צאצאים, ואת הזמינות של ומבוססת ולפעמים ייחודי שיטות גנטיות ומולקולריות 1 -12. יתר על כן, אורגניזמים אלה ניתנים משוחדיםמסכי אינטראקציה שיכול לזהות גורמי תורמי מחלות אלה על ידי ההשפעות המחמירות או ממתן שלהם על פנוטיפים ניווניות. ניתוח אינטראקציות גנטיות כאלה והערכת השפעות ההזדקנות דורש פרוטוקולים כמותיים לזהות ניוון מוחיים, למדוד חומרתה. הערכה זו יכולה להיעשות בקלות יחסית כאשר מודדים היבטים התנהגותיים תסיסנית, כגון למידת חוש ריח, geotaxis השלילי, או מהר phototaxis, המספקים ערך ביצועים מספרי 13-21. כמו כן ניתן לקבוע את ההשפעות על הישרדות עצבית על ידי ספירת תאי עצב. עם זאת, זה אפשרי רק כאשר התמקדות אוכלוסייה מסוימת כי הוא שקל לזהות, כמו נוירונים דופאמינרגיים המושפעות במחלת פרקינסון, וגם אז, והתוצאות היו במחלוקת 22-24. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בשיטת הצווארון לבצע קטעי סדר פרפין, שיטהאשר פותחה במקור על ידי הייזנברג Bohl, שהשתמשו בו כדי לבודד מוטנטים המוח האנטומי תסיסנית 25. השימוש בשיטת הצווארון מכן הותאם, לרבות cryosections, חלקי vibratome, וחתכי פלסטיק 26-28. כאן, זוהי שיטה המופעלת להשיג חלקי סדרה של ראש הזבוב כולו, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי למדוד את vacuoles המתפתח זבובים עם פנוטיפים ניווניות 16,21,29-32. מדידות אלה ניתן לעשות זאת באזורים ספציפיים במוח או יכולות לכסות את כל המוח; הגישה השנייה מאפשרת לזהות פנוטיפים ניווניות אפילו חלש, כפי שנצפה במהלך ההזדקנות. לבסוף, בעת שימוש הצווארונים, עד 20 זבובים ניתן לעבד כהכנה אחד, וזה לא רק פחות זמן רב, אלא גם מאפשר לניתוח מלא זבובים הניסיונות באותה ההכנה, מזעור חפצים בשל שינויים קלים ההכנה.

<table><tbody><tr><td>Name of the Reagent/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Collar</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rubber ice cube tray for embedding</td><td>Household store</td><td></td><td>The size can be made-to-fit by glueing in additional walls&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Crystallizing dish</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Methylbenzoate</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Distinct Odor - Use in fume hood!</td></tr><tr><td>Low Melting Point Paraffin Wax</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Make sure to keep extra melted in a 65&amp;deg;C waterbath</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Three different containers for washes</td></tr><tr><td>Vertical Staining Jar with Cover</td><td>Ted Pella Inc.&amp;nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mass histology to quantify neurodegeneration in drosophila

מחלות ניווניות מתקדמות כמו מחלת אלצהיימר (AD) או מחלת פרקינסון (PD) מהוות איום הולך וגובר על בריאות אדם ברחבי העולם. למרות מודלים יונקים סיפקו תובנות חשובות המנגנונים של פתוגניות, את המורכבות של מערכות יונקים יחד עם העלויות הגבוהות שלהם הם מגבילים את השימוש בהם. לכן, תסיסנית פשוט אך ומבוססת מודל המערכת מספקת אלטרנטיבה לחקירת מסלולים מולקולריים המושפעות במחלות אלה. מלבד גירעונות התנהגותי, מחלות ניווניות המאופיינות פנוטיפים היסטולוגית כגון מוות עצב axonopathy. כדי לכמת ניוון עצבי ולקבוע כיצד הוא מושפע מגורמים גנטיים וסביבתיים, אנו משתמשים בגישה היסטולוגית המבוססת על מדידת vacuoles במוחות הזבוב הבוגר. כדי למזער את ההשפעות של טעות שיטתית ולהשוות חלקים ישירות מלא expזבובים erimental כהכנה אחד, אנו משתמשים בשיטת &quot;צווארון&quot; עבור חלקים פרפין. מוחייה אז נבחן על ידי מדידת הגודל ו / או מספר vacuoles שהתפתח במוח הזבוב. זה יכול להיעשות גם על ידי התמקדות באזור מסוים של עניין או על ידי ניתוח כל המוח על ידי קבלת קטעים סדרו כי היקף הראש המלא. לכן, שיטה זו מאפשרת למדוד לא רק ניוון חמור, אלא גם יחסית פנוטיפים קל כי ניתנים לזיהוי רק בעוד כמה סעיפים, כפי שקורה במהלך הזדקנות נורמלית.

באמצעות תוצאות השיטה המתוארת בסעיפים סדרתי יוכתמו הפיגמנט בעין 33 המקיפים את ראש זבוב כולו. חלק זה מוצג באיור 1B, שבו קטעים מתוך ראש הפרט מוצגים מלמעלה למטה. הסעיפים מפני זבובים שונים נראים משמאל לימין בדוגמה זו. כדי להקל על ההתמצאות זי?...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila at JoVE.com

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כמו דגימה אחת.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

mass-histology-to-quantify-neurodegeneration-in-drosophila

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

10.1K Views.  Oregon Health & Sciences University.  תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כ?...

Video: Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Genetics

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Developmental Biology

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons בדרוסופילה מלאנוסטר

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Direct Cryosectioning of Drosophila Heads for Enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression patterns. Traditional methods often involve challenges such as performing complex dissection, maintaining tissue integrity, and visualizing specific expression patterns during high-resolution imaging. We present an optimized protocol that combines cryosectioning with fluorescence staining and immunostaining. This method improves tissue preservation and signal clarity and reduces the need for laborious dissection for Drosophila brain imaging. The method entails rapid dissection, optimal fixation, cryoprotection, and cryosectioning, followed by fluorescent staining and immunostaining. The protocol significantly reduces tissue damage, enhances antibody penetration, and yields sharp, well-defined images. We demonstrate the effectiveness of this approach by visualizing specific neural populations and synaptic proteins with high fidelity. This versatile method allows for the analysis of various protein markers in the adult brain across multiple z-planes and can be adapted for other tissues and model organisms. The protocol provides a reliable and efficient tool for researchers conducting high-quality immunohistochemistry in Drosophila neurobiology studies. This method's detailed visualization facilitates comprehensive analysis of neuroanatomy, pathology, and protein localization, making it particularly valuable for neuroscience research.

This study presents a simplified protocol for tissue processing involving decapitation, fixation, cryosectioning, fluorescence staining, immunostaining, and imaging, which can be extended to confocal and multiphoton imaging. The method maintains efficacy comparable to complex dissections, bypassing the need for advanced motor skills. Quantitative image analysis provides extensive investigative potential.

הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

הערכת השלמות המבנית של הצמתים העצביים-שריריים האורכיים הגביים בדרוזופילה

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב

Summary

Explore More Videos