Name: synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes at JoVE.com

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, 1386 / 17-1 Wa) tarafından finansal destek Araştırma Eğitim Grubu (DFG tarafından finanse edilen) GRK 2039 ve KIT minnetle kabul edilmektedir.

Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. ve bu sentezlerde kullanılan kimyasalların çeşitli zehirli ve kanserojendir. tipik olarak, bir laboratuvar önlüğü giyen emniyet gözlükleri ve eldiven gibi organik kimya laboratuvarlarında, gerekli olan tüm uygun güvenlik uygulamalarını kullanın. Boyaların 1. Sentezi . Her iki boya da reaksiyonun aynı türleri tarafından sentezlenebilir 2 Bu reaksiyonların genel bir görünüşünü göstermektedir, Şekil Not:. <ol><li> 1- (3-azidopropil) sentezi -4- (2- (1-metil-1 H-indol-3-il) vinil) piridin-1-yum iyodür (boya 1) <ol><li> 1- (3-iyodopropil) -4-metilpiridin-1-yum iyodür sentezi (Şekil 2A, aşama a) <ol><li> Eritin 466 mg kadar 4-pikolin ve 5.91 g 20 mi tepe boşluğu cam şişede, 10 ml asetonitril 1,3-Diiyodopropan ve bölmeli kapak ile sıkıca kapatın. </li><li> 16 saat boyunca 85 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir. </li><li> Geriye kalan yağa etil asetat ve 20 ml ilave edilir ve 3 dakika için bir 120 W ultrasonik banyoda karışımı tedavi. </li><li> süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak ve etil asetat ile beş kere yıkayın. Vakum O / N altında katı ürün kurutun. </li></ol></li><li> 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-yum sentezi (Şekil 2A, Aşama B) <ol><li> 900 mg 1- (3-iyodopropil) 20 ml bir tepe boşluğu şişede asetonitril 12 ml -4-metilpiridin-1-yum iyodür eritin sodyum azid 376 mg ekleyin ve bir septum kapak ile sıkıca kapatın. </li><li> 16 saat boyunca 85 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir. </li><li> Kalıntıya 15 ml diklorometan ekleyin. </li><li> süzerek çıkarın ve elde edilen çökelti atın. </li><li> Bir çürümeyi kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarınli evaporatör kahverengi bir yağ olarak ürün elde edildi. </li></ol></li><li> 1-metil-1 H-indol-3-karbaldehid sentezi (Şekil 2A, Aşama c) &#39; <ol><li> atıl gaz (argon) altında, bir geri akış kondansatörü ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 50 ml 10 mi saf dimetilformamit içinde 1.45 g indol-3-karbaldehid, 1.52 g potasyum karbonat ve 2.70 g dimetil karbonat çözülür. </li><li> 19 saat boyunca 130 ° C de karıştırdıktan. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya buz karışımı dökmek için izin verir. </li><li> Sulu tabaka, 150 ml etil asetat ile üç kez ekstrakte edin. </li><li> Organik tabakaları birleştirin, su ile yıkama, sodyum sülfat üzerinde kurutun ve bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında 50 ° C&#39;de çözücüyü çıkarın. </li></ol></li><li> Kavrama 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1 H-indol-3-il) vinil) piridin-1-yum iyodür (boya 1) (Şekil 2A, Aşama D) <ol><li> argon altında ve nem dahil edilmeden çalışır. DissolBir geri akış yoğunlaştırıcısı ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 20 ml 4 mi etanol içinde 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-yum ve 48 mg 1-metil-1 H-indol-3-karbaldehid ve. </li><li> 4 saat 80 ° C&#39;de 0.07 ml piperidin ve ısıtılır. </li><li> Oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak ve dietileter ile üç kez yıkayın. </li><li> Süpernatana dietileter ekleyin ve süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak. dietileter ile üç kez yıkayın. </li><li> çökeltiler birleştirin. </li></ol></li></ol></li><li> 1- (3-azidopropil) sentezi -4- (2- (1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-il) vinil) kinolin-1-yum iyodür (boya 2) <ol><li> 1- (3-iyodopropil) -4-metilkuinolin-1-yum iyodür sentezi (Şekil 2B, aşama a) <ol><li> Eritin 715 mg kadar 4-metilkinolin ve 5.91 g 20 mi tepe boşluğu cam şişede, 10 ml asetonitril 1,3-Diiyodopropan ve bölmeli kapak ile sıkıca kapatın. </li><li> Sıcaklık16 saat boyunca 85 ° C arasındadır. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir. </li><li> Geri kalan yağ, etil asetat ile 20 ml ilave edilir ve 3 dakika için bir 120 W ultrasonik banyoda karışımı tedavi. </li><li> süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak ve etil asetat ile beş kere yıkayın. Vakum O / N altında katı ürün kurutun. </li></ol></li><li> 1- (3-azidopropil) -4-metilkuinolin-1-yum sentezi (Şekil 2B, adım b) <ol><li> 900 mg 1- (3-iyodopropil) 20 ml bir tepe boşluğu şişede asetonitril 12 ml -4-metılkuınolın-1-yum iyodür eritin sodyum azid 333 mg ekleyin ve bir septum kapak ile sıkıca kapatın. </li><li> 16 saat boyunca 85 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir. </li><li> Kalıntıya 15 ml diklorometan ekleyin. </li><li> süzerek çıkarın ve elde edilen çökelti atın. </li><li> Solvent u kaldırnder kahverengi bir yağ olarak ürünü elde etmek üzere bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç. </li></ol></li><li> 1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid sentezi (Şekil 2B, Aşama C) <ol><li> atıl gaz (argon) altında, bir geri akış kondansatörü ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 50 ml 10 mi saf dimetilformamit içinde 1.45 g 2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid, 0.996 g potasyum karbonat ve 1.77 g dimetil karbonat çözülür. </li><li> 19 saat boyunca 130 ° C de karıştırdıktan. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya buz karışımı dökmek için izin verir. </li><li> Sulu tabaka, 150 ml etil asetat ile üç kez ekstrakte edin. </li><li> Organik tabakaları birleştirin, su ile yıkama, sodyum sülfat üzerinde kurutun ve döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın. </li></ol></li><li> 1- (3-azidopropil) bağlanmak -4- (2- (1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-il) vinil) kinolin-1-yum iyodür (Şekil 2B, adım d) &#39; <ol><li> arg altında çalışmave nem dahil edilmeden. yuvarlak dipli şişe ile donatılmış bir 20 ml, 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilkuinolin-1-yum ve 59.7 mg 1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid 4 mi etanol içinde çözülür geri akış kondansatörü. </li><li> 4 saat 80 ° C&#39;de 0.06 ml piperidin ve ısıtılır. </li><li> Oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak ve dietileter ile üç kez yıkayın. </li><li> Süpernatana dietileter ekleyin ve süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak. dietileter ile üç kez yıkayın. </li><li> çökeltiler birleştirin. </li></ol></li></ol></li></ol> DNA Strands 2. Sentezi Not: bir DNA sentezleyicisi üzerinde M. Caruthers 11 tarafından tarif edildiği gibi, DNA şerit sentezi, bir katı faz üzerinde fosforamidit yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. synthesizer işleyişi sentetik işlem öncesi test edilir ve reaktif ise yenilenengerekli. <ol><li> Prearrangements <ol><li> amidite seyreltici (ekstra kuru asetonitril) 1.2 ml ticari olarak temin 2&#39;-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) içinde çözülür. Bir sentezleyici flakon şişe içinde çözüm getirin ve synthesizer içine vida. </li><li> Hiçbir argon gazı sızıntısı var olduğundan emin olmak için (üreticinin talimatlarına göre) bir &quot;sızıntı testi&quot; gerçekleştirin. &quot;Sızıntı testi&quot; başarısız olursa, daha sıkı şişede sıkın. </li><li> Katı Faz Sentez odasına bağlayan tüp doldurarak Başbakan Cu çözüm. </li><li> asetonitril ile tüm satırları yıkayın. </li></ol></li><li> DNA iplikçikleri sentezi <ol><li> Üreticinin protokolden istemleri takip DNA dizisi ve bağlantı yöntemi girmek bağlı bilgisayar kullanın. cu yapı bloğunun birleştirme aşaması geleneksel 7 darbeleri ile 40 sn ile karşılaştırıldığında (her darbe 16 ul olan) 7 darbeleri ile 168 saniye süreryapı taşları olarak fosforamidit. </li><li> İlk taban 1 umol değiştirilmiş katı faz olarak CPG (kontrollü gözenekli cam) ihtiva eden bir sütun monte synthesizer (DNA sentezi 5 &#39;&#39; 3 ila gerçekleştirilir). </li><li> DNA sentezleyici 11 sentezi başlar. </li></ol></li><li> Sentezlenen DNA iplikçiklerinin Çalıştırma <ol><li> Vakum O / N altında sentezlenen DNA ipliklerini içeren sütunlar kurutun. </li><li> sütun açıp bir reaksiyon şişenin içine CPG serbest bırakmak için bir pense kullanın. oligonükleotid korumasını kaldırmak ve CpG DNA teli serbest bırakmak için konsantre edilmiş sulu amonyak çözeltisi 700 ul ekle. </li><li> 18 saat 50 ° C&#39;ye kadar şişeyi kapatın ve patlama önlemek için, reaksiyon kabı üzerinde bir güvenlik kapağı uygulanır ve ısı. </li><li> 30 dakika boyunca 30 ° C&#39;de indirgenmiş basınç altında (100 mbar) altında santrifüjleme ile amonyağın ayrılması. </li><li> CPG gelen filtrasyon başlatın: Santrifüj gemi 11.000 xg fo atR3 Min. üstteki sıvı kısmı alınır ve 0.45 um&#39;lik bir gözenek büyüklüğüne sahip bir santrifüj cihazının içine aktarın. 4 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Bu sırada 3 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de 20 saniye ve santrifüj CpG, girdaba iki kez damıtılmış suyun 300 ul ekle. 4 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de santrifüj cihazı ve santrifüj içine süpernatant aktarın. iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> 0,1 mbar ve 25 ° CO / H santrifüj Birleştirilen sulu çözeltilerden su çıkarın. </li></ol></li></ol> 3. &quot;tıklamak&quot; Prosedür <ol><li> (0.1 [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin - 50 ul iki kez damıtılmış su, sodyum askorbat çözeltisi 25 ul (su içinde 0.4 M), 34 | il Tris ekleme DMSO içinde M / tBuOH 3: azid 1), 114 ul (0.01 DMSO içinde M / tBuOH 3: 1) ve bir tetrakis 17 ul (asetonitril) bakır (I) heksaflorofosfat çözeltisi (0.1 DMSO içinde M / tBuOH 3: 1) liyofilize alkin ile modifiye edilmiş DNA örneğine. </li&gt; <li> 1.5 saat boyunca 60 ° C &#39;de örnek inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığına soğutun. </li><li> 150 ul Na2EDTA (su içinde 0.05 M) ve 10 ml&#39;lik bir tüp DNA numunesi ve transfer 450 ul sodyum asetat (su içinde 0.3 M) eklenir. </li><li> 10 mi etanol (% 100) ilave edin ve 16 saat boyunca -32 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 15 1000 xg&#39;de dk ve süpernatant kaldırmak için santrifüj gemi. </li><li> 2 ml soğuk etanol (% 80) ile DNA pelletini yıkayın. </li><li> indirgenmiş basınç altında kuru pelet. </li></ol> 4. HPLC saflaştırma Not: ayrılmadan önce DNA ipliklerini HPLC düzgün çalıştığından emin olun, yeterli çözücü mevcuttur ve sütun temiz. tampon / asetonitril başlangıç ​​konsantrasyonu ile sütun durulayın. <ol><li> HPLC şişeye iki defa damıtılmış su ve transfer 250 ul Ham DNA pelet çözülür. </li><li> boya 1 ve Gradi asetonitril% 15% 0 asetonitril gradyanı ile 45 dakika HPLC çalıştırmak Başlangıç<html> boya 2. asetonitril 17% 0 ile% asetonitril ent 260 nm (DNA emme) ve 459 nm (boya 1) veya 542 nm (boya 2) kontrol ederek koşmak izleyin. Her iki dalga boyu kanalları emilmesini gösteren fraksiyonların toplayın. </li><li> 3-Hidroksipikolinik asit (3HPA) ve diammoniumhydrogencitrate oluşan bir matris kullanılarak matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi ile şu kütlesi toplanan fraksiyonları edin. <ol><li> su içinde diammoniumhydrogencitrate çözeltisi (100 g / L), 100 ul asetonitril ve su 1: 1 kanşımı olarak doymuş 3-HPA solüsyonu 900 ul karıştırılarak matrisi hazırlayın. </li><li> hedef DNA prob 1-2 ul pipet ve hava kurumaya bırakın. </li><li> örnek 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matris 0.2 ul ekleyin ve kristalleşir kadar karıştırın. </li><li> MALDI kütle spektrometresi gerçekleştirin. </li><li> Doğru kitle sergileyen HPLC kesirler birleştirin. </li></ol></li></ol>Konsantrasyon _title &quot;&gt; 5. Belirlenmesi Not: konsantrasyonu DNA bazları ve boya yok olma katsayıları (260 ε) göre, bir UV / Vis spektrofotometre kullanılarak 260 nm&#39;de emilimin ölçülmesiyle belirlenir. <ol><li> çift ​​damıtılmış su, 200 ul - 100 DNA çözülür. </li><li> UV / Vis spektrofotometre DNA solüsyonu 1 ul uygulayın. </li><li> 260 nm&#39;de emme ölçün. üç kez tekrarlayın. </li><li> çözeltinin konsantrasyonunu hesaplamak için, ortalama değer alır. Yok olma katsayılarının hesaplanmasında, bütün DNA ipliğinin ε 260nm elde etmek için dört doğal bazlar 12 ε 260nm ve (doğal üridin olarak kabul edilir) satın alınan yapı bloğu CU ε 260nm 12 kullanın. Boya 1, kullanım ε 260nm = 10200 L * mol -1 * cm-1 ve boya 2, kullanım ε 260nm = 13100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Yok olma katsayıları ve ölçülen absorbans dayalı Lambert-Beers &#39;hukuk aşağıdaki çözeltisinin konsantrasyonu hesaplayın. 13 </li></ol> 6. Numune Hazırlama ve Spektroskopi <ol><li> Tek iplikli örneklerinin hazırlanması <ol><li> 200 mM NaCl, 50 mM NADP tampon içinde tadil edilmiş DNA1 ve DNA2 her 2.5 uM çözeltilerinin ayrı ayrı 1 mi, pH = 7 hazırlayın. </li></ol></li><li> Çift iplikli örneklerinin hazırlanması <ol><li> Bir reaksiyon kabı içinde, 200 mM NaCI, 50 mM NADP i tampon maddesi, pH = 7 DNA2 2,5 DNA1 uM ve 2.5 uM ihtiva eden bir çözelti, 1 ml hazırlayın. </li><li> 10 dakika boyunca 90 ° C&#39;ye kadar güvenli bir kap ve ısı ile kapağı elde edin. Sonra ısıtma kapatın ve RT O / N soğumaya bırakın. </li></ol></li><li> absorpsiyon spektroskopisi Not: floresan spec için dalgaboyu belirlemek içinSpektroskopisi absorpsiyon spektrumları kaydedilir. <ol><li> Tek iplikli ölçümleri <ol><li> 200 mM NaCI, 50 mM NADP i tampon maddesi, pH = 7 ihtiva eden boş bir ölçüm kaydedilir. </li><li> 1 cm kuvars cam küvet içinde DNA1 hazırlanmış çözeltisini ve emilimi kaydedin. Boş veri karşı ölçümü düzeltin. boya emilimi maksimum değerini belirler. </li><li> DNA2 için tekrarlayın. </li></ol></li></ol></li><li> floresans spektroskopisi <ol><li> Tek iplikli ölçümleri <ol><li> 200 mM NaCI, I tampon, 50 mM NADP ihtiva eden boş bir ölçüm kaydedin, pH = 7; boya 1 eksitasyon dalga boyu kullanılarak. </li><li> 1 cm kuvars cam küvet içinde DNA1 çözeltisini. </li><li> floresan spektrumu kaydedin. </li></ol></li><li> Çift iplikli ölçümü <ol><li> Bir kuvars cam küvet içinde çift iplikli çözüm aktarın. </li&gt; <li> boya 1 dalgaboyu kullanılarak floresan spektrumu kaydedin. </li></ol></li></ol></li><li> görselleştirme deneyleri Dikkat: Uygun göz koruması Gözleri UV hasarını önlemek için giyilmelidir! <ol><li> Kaydedilen spektrumları gösteriyor ne daha iyi bir anlayışa el UV lambaları (Şekil 5) ile küvetler ışın tedavisi için. çift ​​sarmallı DNA&#39;ya tek floresan renk değişikliği dikkat edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+for+fluorescent+probe+design+in+medical+diagnostic+imaging.">New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging.</a> Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Measurements+and+Biological+Imaging.">Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging.</a> Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity-oriented+optical+imaging+probe+development.">Diversity-oriented optical imaging probe development.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).</li><li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=#34;DNA+Traffic+Lights&amp;#34;:+Concept+of+Wavelength-Shifting+DNA+Probes+and+Application+in+an+Aptasensor.">#34;DNA Traffic Lights&amp;#34;: Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).</li><li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+&amp;#34;Traffic+Lights&amp;#34;:+Synthetic+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Probes+Based+on+Nucleic+Acid+Base+Substitutes+for+Molecular+Imaging.">DNA and RNA &amp;#34;Traffic Lights&amp;#34;: Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging.</a> J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).</li><li>Berndl, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Color+Readout+of+DNA+Hybridization+with+Thiazole+Orange+as+an+Artificial+DNA+Base.">Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).</li><li>Bohl&#228;nder, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+Photostable+Energy-Transfer+Pair+for+&amp;#34;DNA+Traffic+Lights&amp;#34.">Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for &amp;#34;DNA Traffic Lights&amp;#34.</a> Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).</li><li>Walter, H. K., Bohl&#228;nder, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Module+for+the+Adenosine+Aptamer+Using+Photostable+Cyanine+Dyes.">Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes.</a> ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).</li><li>Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+as+a+reliable+method+for+the+high-density+postsynthetic+functionalization+of+alkyne-modified+DNA.">Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA.</a> Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).</li><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+deoxyoligonucleotides+on+a+polymer+support.">Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support.</a> J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).</li><li>Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorbance+melting+curves+of+RNA.">Absorbance melting curves of RNA.</a> Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).</li><li>Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Dimers:+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes.">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li><li>Barrois, S., W&#246;rner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes:+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+&amp;#34;Traffic+Lights&amp;#34;,+Photochem.">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &amp;#34;Traffic Lights&amp;#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol azid modifiye floresan boyalar ile CuAAC aracılığıyla DNA sonrası sentetik etiketlemek için tam bir işlemi göstermektedir. Bu boyalar ve alkin ile modifiye edilmiş DNA sentezini ve etiketleme işlemi içermektedir. Boyaların sentezi dört adımları izler. Tüm ürünler nedeniyle pozitif yük için oldukça basit bir çökeltme ile elde edilebilir ve zaman alıcı kolon kromatografisi gereklidir. merkezi bağlantı adımlar önce azid işlevleri tanıtımı dört yerin...

Moleküler görüntüleme canlı hücrelerin içinde biyolojik süreçleri anlamak için temel bir tekniktir. 1-3 gibi kimyasal-biyolojik uygulamalar için floresan nükleik asit bazlı prob geliştirilmesi genişleyen bir araştırma alanı haline gelmiştir. Bu floresan sondalar hücre görüntüleme için uygun araçlar haline birkaç gereksinimlerini karşılamak gerekir. İlk olarak, uygulanan boya yüksek kuantum verimleri ile floresan sergilemelidir büyük Stokes kaymalar ve en önemlisi, yüksek photostabilities in vivo görüntüleme uzun süreli izin vermek. Ve ikincisi, onlar güvenilir bir floresan okuma göstermelidir. Konvansiyonel kromofor-söndürücü sistemler floresan yoğunlukları basit değişikliklerle tek bir floresan renk okuma dayanmaktadır. 4 Bu yaklaşım nedeniyle hücre içi bileşenleri veya düşük sinyal-gürültü oranları otofloresansı yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçların riskini taşımaktadır nedeniyle diğer com tarafından istenmeyen soğutulması içinTüm unsurların. 4 Biz son zamanlarda iki farklı kromoforlar kullanarak ikili floresan renk okumalarını gösteriyor &quot;DNA trafik ışıkları&quot; kavramına bildirildi. 5-6 kavramı floresan değiştirir alıcı boyasına donör boya enerji transferi (ET) dayanmaktadır renk (Şekil 1). Bu daha güvenli bir okuma sağlar ve bu şekilde flüoresan görüntüleme sondaları için güçlü bir araç sunar. floresan boyalar ile oligonükleotid Etiketleme iki farklı yaklaşım ile elde edilebilir. Boyalar mukabil değiştirilmiş fosforamidit yapı taşları kullanılarak bir katı faz üzerinde, kimyasal DNA sentezi sırasında dahil edilebilir. 7, bu yöntem, standart fosforamidit ve koruma kaldırma koşulları altında stabil olan boyalar ile sınırlıdır. Bir alternatif olarak, sentez sonrasında modifikasyon yöntemleri oligonükleotid kimyasında kurulmuştur. Burada, bizim yeni Fotoğrafların birinde sentezini göstermekmasa enerji transferi çiftleri 8,9 ve azidler ve alkinlere (CuAAC) arasındaki bakır katalize 1,3-sikloadisyon kullanılarak DNA&#39;nın sonrası sentetik etiketleme. 10

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Potassium carbonate, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimethylcarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99.5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylquinoline</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DNA synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Amidite Diluent for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammonia (aqueous solution)&amp;nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal devices nanosep 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;workup&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;clicking procedure&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>synthesized according to a literature procedure&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;HPLC&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;determination of concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ND 1000 Spectrophotometer</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;sample preparation and spectroscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, &lt;em&gt;Org Lett&lt;/em&gt; 2004, &lt;strong&gt;6&lt;/strong&gt;, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

Bu protokol, 2&#39;-alkin sentezi için bir yöntem olup, standart fosforamidit kimyası kullanılarak otomatik katı faz sentezi ile deoksiribonükleik asit (DNA) ipliklerini modifiye göstermektedir. Oligonükleotidler sonrası sentetik bakır katalize tıklama kimyası kullanılarak iki yeni ışığa siyanin boyalar ile etiketlenir. Her iki verici ve alıcı boya sentezi tarif edilir ve art arda üç aşamada gerçekleştirilir. Onlar melezleme yoluyla yakın getirildiğinde çevreleyen mimari DNA ile, bu iki boyalar bir enerji transferi uğrar. Bu nedenle, iki tek zincirli DNA şeritlerin tavlama flüoresan renk değişikliği ile görüntülenir. Bu renk değişimi, flüoresan spektroskopisi ile karakterize değil, aynı zamanda, doğrudan bir el ultraviyole (UV) lambası kullanılarak gözlemlenebilir. Çift floresan renk okuma kavramı bu oligonükleotid probları moleküler görüntüleme, özellikle açıklanan pho için mükemmel araçlar yapartostable boyalar kullanılır. Böylece, görüntüleme sondaları ışıkla ağartma önlenir ve biyolojik işlemler daha uzun bir zaman süresi için, gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, tek ve çift sarmallı DNA emme ve floresan spektrumu kaydedilir. Kaydedilen absorpsiyon spektrumları (Şekil 4, sağ) tek şeritli DNA1 (boya 1) ve tek şeritli DNA2 (boya 2) için 546 nm 465 nm dalga boyunda göster emme maksimumları λ maks. Tavlanmış DNA1_2 (boya 1 ve boya 2) 469 nm ve 567 nm hem de maksimumu gösterir. Her iki absorpsiyo...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes at JoVE.com

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alkynes

SCIENTISTS IN ACTION

11.1K Görüntüleme.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Video: Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Biyokimya

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Biyoloji

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Bağışıklık Hücreleri Tarafından Geçici Piconewton Reseptör Kuvvetlerini Haritalamak için DNA Gerilim Probları

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Biyomühendislik

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plazmid kökenli Uygulama Kimyasal Reaksiyon Ağları için DNA Strand Deplasman kapıları

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA &#39;roadblocks&#39;&#160;&#8212; is critical for ensuring faithful&#160;genome duplication.&#160;G-quadruplexes are higher-order nucleic acid structures that form in guanine-rich regions of DNA and have been shown to act as obstacles, interfering with genomic maintenance pathways. This study introduces a real-time, fluorescence microscopy-based method to observe DNA polymerase interactions with G-quadruplex structures. Short, primed DNA oligonucleotides containing a G-quadruplex were immobilized on functionalized glass coverslips within a microfluidic flow cell. Fluorescently labeled DNA polymerases were introduced, allowing their behavior and stoichiometry to be monitored over time. This approach enabled the observation of polymerase behavior as it was stalled by a G-quadruplex. Specifically, using fluorescently labeled yeast polymerase &#948;, it was found that upon encountering a G-quadruplex, the polymerase undergoes a continuous cycle of binding and unbinding. This single-molecule assay can be adapted to study interactions between various DNA-maintenance proteins and obstacles on the DNA substrate.

This protocol outlines a fluorescence microscopy-based single-molecule DNA replication assay, enabling real-time visualization of interactions between DNA polymerases and obstacles such as G-quadruplex structures.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler