독일 연구 협회 (DFG, 1386 / 17-1 워싱턴)에 의해 재정 지원 연구 교육 그룹 (DFG에 의해 자금) GRK 2039 및 KIT는 기꺼이 인정한다.

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 합성에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 일반적으로, 실험실 코트를 입고 안전 안경, 장갑 등의 유기 화학 실험실에 필요한 모든 적절한 안전 방법을 사용하십시오. 염료의 1. 합성 . 두 염료가 반응 동일한 유형으로 합성 할 수있다 (2) 이러한 반응의 개요를 보여줍니다 :합니다. <ol><li> 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1) <ol><li> 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2a는, 단계 a) <ol><li> 녹여 466 mg의 4- 피 콜린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다. </li><li> 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움의 합성 (도 2a, b) 단계 <ol><li> 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 376 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀​​봉한다. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다. </li><li> 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다. </li><li> 썩어을 사용하여 감압하에 용매를 제거진 증발기 갈색 오일로서 생성물을 얻었다. </li></ol></li><li> 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2a를 참조하면, 단계 c) <ol><li> 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 1.52 g의 탄산 칼륨 및 2.70 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다. </li><li> 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다. </li><li> 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다. </li><li> 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다. </li><li> 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 감압하에 회전 증발기를 사용하여 50 ℃에서 용매를 제거한다. </li></ol></li><li> 커플 링 1- (3- 아지도 프로필) -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1) (도 2a, 단계 d) <ol><li> 아르곤 하에서 수분의 배제에 따라 작업 할 수 있습니다. Dissol환류 응축기를 갖춘 플라스크 둥근 바닥 20 ㎖에 4 ㎖의 에탄올 중의 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움 및 48 mg의 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드를했습니다. </li><li> 4 시간 동안 80 ° C로 0.07 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다. </li><li> RT로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 여과하여 생성 된 침전물을 수집하고, 디 에틸 에테르로 3 회 세척 하였다. </li><li> 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다. </li><li> 침전물을 결합합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 2) <ol><li> 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2b는, 단계 a) <ol><li> 녹여 715 mg의 4- 메틸 퀴놀린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉. </li><li> 열16 시간 동안 85 ° C이다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 남은 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다. </li><li> 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 b) <ol><li> 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 333 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀​​봉한다. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다. </li><li> 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다. </li><li> 용매 유를 제거파인더 갈색 오일로서 생성물을 수득하는 회전 증발기를 사용하여 압력을 감소시켰다. </li></ol></li><li> 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 c) <ol><li> 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 0.996 g의 탄산 칼륨 및 1.77 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다. </li><li> 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다. </li><li> 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다. </li><li> 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다. </li><li> 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거한다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필)에 커플 링 -4- (2- (1- 메틸 -2- 프 피닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (도 2b를 참조하면, 단계 d) <ol><li> 인수에서 작업에 수분의 배제 아래. 플라스크 둥근 바닥 구비 한 20ml에 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움 및 59.7 mg을 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카브 알데하이드 4 ml의 에탄올에 녹여 환류 응축기. </li><li> 4 시간 동안 80 ° C로 0.06 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다. </li><li> RT로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집하고 디 에틸 에테르로 3 회 세척한다. </li><li> 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다. </li><li> 침전물을 결합합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> DNA의 가닥 2. 합성 주 : DNA 합성기에서 M. Caruthers (11)에 의해 설명 된 것처럼 DNA 가닥의 합성은 고체상에서 포스 방법을 사용하여 수행된다. 신디사이저의 기능은 합성 절차 전에 테스트하고, 시약 경우 갱신됩니다필요한. <ol><li> Prearrangements <ol><li> amidite 희석제 (추가 건조 아세토 니트릴) 1.2 ㎖에 시판되는 2&#39;-O-프로 파르 길 - deoxyuridinephosphoramidite (CU)를 녹인다. 신디사이저의 유리 병에 유리 병에 솔루션을 이동 신디사이저로 조입니다. </li><li> 더 아르곤 가스 누출이 없음을 확인 (제조업체의 지침에 따라)는 &quot;누설 테스트&quot;를 수행합니다. 은 &quot;누설 테스트가&quot;실패하면 더 단단히 유리 병에 나사. </li><li> 고상 합성 챔버에 연결 튜브를 작성하여 프라임 구리 용액. </li><li> 아세토 니트릴로 모든 라인을 씻으십시오. </li></ol></li><li> DNA 가닥의 합성 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜의 지시에 따라 DNA 서열과 결합 방법을 입력 연결된 컴퓨터를 사용합니다. CU를 빌딩 블록의 커플 링 공정은 통상 7 펄스를 40 초에 비해 (각 펄스가 16 μL 임) (7) 펄스 168 초 소요빌딩 블록으로서 포스. </li><li> 제 1베이스 1 μmol으로 수정 고상과 CPG (제어 세​​공 유리)를 포함하는 열을 탑재 신디사이저로 (DNA 합성은 &#39;5&#39;3에서 수행된다). </li><li> DNA의 합성 (11)의 합성을 시작합니다. </li></ol></li><li> 합성 된 DNA 가닥의 정밀 검사 <ol><li> 진공 O의 /의 N에서 합성 된 DNA 가닥과 열을 건조시킵니다. </li><li> 열을 열고 반응 유리 병에 CPG를 해제하기 위해 협공을 사용합니다. 올리고 뉴클레오티드를 탈 보호 및 CPG에서 DNA 가닥을 해제 농축 암모니아 수용액의 700 μl를 추가합니다. </li><li> 18 시간 동안 50 ° C까지 바이알을 닫고 붕괴되는 것을 방지하기 위해, 반응 용기에 보안 덮개를 적용하고, 가열. </li><li> 30 분 동안 30 ° C에서 감압 (100 밀리바)에서 원심 분리하여 암모니아를 제거합니다. </li><li> CPG에서 여과를 시작 원심 분리기 용기를 11,000 XG FO에R 3 분. 상등액을 취하여 0.45 ㎛의 세공 크기를 갖는 원심 분리 장치로 옮긴다. 4 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 한편 3 분 동안 11,000 XG에 20 초 원심 분리기의 CPG, 소용돌이에 두 번 증류수 300 μl를 추가합니다. 4 분 동안 1,000 XG에서 원심 장치와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 두 번이 세척 절차를 반복합니다. </li><li> 0.1 밀리바 25 ° CO / N에서 원심 분리하여 결합 된 수용액에서 물을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 3. &quot;클릭&quot;절차 <ol><li> (0.1 [(1- 벤질 -1H- 1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 - 50 μL 이중 증류수, 나트륨 아스 코르 베이트 용액을 25 μL (물 중 0.4 M), 34 ㎕의 트리스 추가 DMSO의 M /을 tBuOH 3 : 아 지드의 1) 114 μL (0.01 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 및 테트라 키스 17 μL (아세토 니트릴), 구리 (I) 헥사 플루오로 포스페이트 용액 (0.1 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 동결 건조 된 알킨 변성 DNA 샘플이다. </l난&gt; <li> 1.5 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 실온으로 냉각. </li><li> 150 μL 나 2 EDTA (물에 0.05 M) 및 10 ML 튜브에 DNA 샘플 및 전송에 450 ㎕의 아세트산 나트륨 (물에 0.3 M)를 추가합니다. </li><li> 10 ml의 에탄올 (100 %)를 추가하고 16 시간 동안 -32 ℃에서 보관하십시오. </li><li> (15) 1000 XG에 분, 상층 액을 제거하기위한 원심 분리기 용기. </li><li> 2 ml의 차가운 에탄올 (80 %)와 DNA-펠렛을 씻으십시오. </li><li> 감압 건조 펠렛. </li></ol> 4. HPLC 정제 참고 : 분리하기 전에 DNA 가닥이 HPLC가 제대로 작동하는지 확인, 충분한 용매를 사용할 수 있으며 열은 깨끗합니다. 버퍼 / 아세토 니트릴의 시작 농도 열을 씻어. <ol><li> HPLC 바이알에 이중 증류수 및 전송의 250 μL의 원유 DNA-펠렛을 녹인다. </li><li> 염료 1 및 GRADI 대한 아세토 니트릴의 15 % 0 % 아세토 니트릴 구배로 45 분 HPLC 실행 시작<html> 염료 2의 아세토 니트릴 17 % 0 % 아세토 니트릴의 엔트는 260 나노 미터 (DNA 흡수) 및 459 nm의 (염료 1) 또는 542 nm의 (염료 2)를 확인하여 실행을 모니터링합니다. 두 파장 채널에서 흡수를 보여 그 분수를 수집합니다. </li><li> 3- 하이드 록시피 콜린 산 (3HPA) 및 diammoniumhydrogencitrate로 구성된 행렬을 이용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분석에 의해 오른쪽 대량의 수집 분수를 확인합니다. <ol><li> 물에 diammoniumhydrogencitrate 용액 (100g / L)를 100 ㎕의 아세토 니트릴과 물의 혼합물을 1 : 1 포화 3-HPA 용액 900 μL를 혼합하여 매트릭스를 준비한다. </li><li> 대상의 DNA 프로브의 1-2 μl를 피펫 공기에 건조 할 수 있습니다. </li><li> 샘플로 3 HPA는 / diammoniumhydrogencitrate 행렬의 0.2 μl를 추가하고 결정화 될 때까지 섞는다. </li><li> MALDI 질량 분석을 수행합니다. </li><li> 오른쪽 질량을 전시하는 HPLC의 분수를 결합합니다. </li></ol></li></ol>농도의 _title &quot;&gt; 5. 결​​정 주 : 농도는 DNA 염기와 염료의 흡광 계수 (ε 260)에 근거하여 UV / 비스 분광하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정된다. <ol><li> 이중 증류수 200 μL - 100의 DNA를 녹여. </li><li> 자외선은 / 마주 분광 광도계에 DNA 용액 1 μL를 적용합니다. </li><li> 260 nm에서 흡광도를 측정한다. 세 번 반복합니다. </li><li> 용액의 농도를 계산하는 평균값을 가지고. 흡광 계수의 계산, 전체 DNA 가닥의 ε의 260 나노 미터를 얻기 위해 네 천연베이스 (12)의 ε 260 나노 미터 및 (천연 딘으로 간주) 구입 빌딩 블록 CU의 ε의 260 나노 미터 (12)를 사용한다. 염료 1, 사용 ε의 260 나노 미터 = 10,200 L를 들어 * 몰 -1 * cm -1 염료 2를 사용 ε의 260 나노 미터 = 13,100 L의 * 몰 &lt;SUP&gt; -1 * cm -1. 흡광 계수 측정 한 흡광도에 기초 램버트 - 맥주의 법칙 다음, 용액의 농도를 계산한다. 13 </li></ol> 6. 샘플 준비 및 분광학 <ol><li> 단일 가닥 샘플의 제조 <ol><li> 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼에서 수정 된 DNA1 및 DNA2 각각 2.5 μm의 솔루션을 개별적으로 1 ml의 pH는 7을 준비합니다. </li></ol></li><li> 이중 가닥 샘플의 제조 <ol><li> 반응 용기에 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 NAP 나 버퍼, pH가 7 DNA2 2.5 DNA1의 μM 2.5 μM을 함유 한 용액 1 ㎖를 준비한다. </li><li> 10 분 동안 90 ° C에 안전 캡과 열로 뚜껑을 고정합니다. 그리고 난방을 끄고 RT O / N로 냉각 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 흡광 주 : 형광 스펙 대 여기 파장을 결정하려면troscopy 흡수​​ 스펙트럼이 기록됩니다. <ol><li> 단일 가닥 측정 <ol><li> 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼, pH는 7이 포함 된 빈 측정을 기록합니다. </li><li> 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 준비된 용액을 전송하고 흡수를 기록한다. 빈 데이터에 대한 측정을 수정합니다. 염료의 흡수 최대 값을 결정한다. </li><li> DNA2에 대해 반복합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 형광 분광법 <ol><li> 단일 가닥 측정 <ol><li> 200 mM의 NaCl을, 내가 버퍼 50 mM의 낮잠을 포함하는 빈 측정을 기록, 산도 = 7; 염료 (1)의 여기 파장을 사용. </li><li> 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 용액을 전송. </li><li> 형광 스펙트럼을 기록합니다. </li></ol></li><li> 두 가닥 측정 <ol><li> 석영 유리 큐벳에 이중 가닥 용액을 전송. </l난&gt; <li> 염료 (1)의 여기 파장을 이용한 형광 스펙트럼을 기록한다. </li></ol></li></ol></li><li> 시각화 실험 주의 : 적절한 눈 보호는 눈에 자외선 손상을 방지하기 위해 착용한다! <ol><li> , 기록 된 스펙트럼이 표시 무엇의 더 나은 이해를 얻을 휴대용 자외선 램프 (그림 5)와 큐벳을 조사합니다. 이중 가닥 DNA에 하나의 형광 색상의 변화를 관찰한다. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Dimers:+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes.">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li><li>Barrois, S., W&#246;rner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes:+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+&amp;#34;Traffic+Lights&amp;#34;,+Photochem.">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &amp;#34;Traffic Lights&amp;#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 아 지드 수정 형광 염료에 의해 CuAAC 통해 DNA 후 합성 레이블의 전체 과정을 보여줍니다. 이 염료 및 알킨 변성 DNA의 합성뿐만 아니라, 표시 순서를 포함한다. 염료의 합성은 네 단계를 따른다. 모든 제품은 그들의 양전하로 비교적 간단 침전에 의해 수득 할 수 있고 시간 소모적 컬럼 크로마토 그래피는 필요하지 않다. 중앙 커플 링 단계 이전에 아 지드 기능의 ...

분자 이미징은 살아있는 세포 내에서 생물학적 과정을 이해하기위한 기본적인 기술을 나타냅니다. 1-3 화학적 생물학적 응용 프로그램에 대한 형광 핵산 ​​기반 프로브의 개발이 확대 연구 분야가되고있다. 이 형광 프로브는 세포 이미징에 적합한 도구가 될 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 첫째, 적용 염료가 높은 양자 수율과 형광을 전시한다, 큰 스톡스 &#39;변화는, 그리고 가장 중요한 것은, 높은 photostabilities는 생체 내 이미징의 장기를 허용합니다. 그리고 둘째로, 그들은 신뢰할 수있는 형광 판독을 표시해야합니다. 종래 발색단 소광-시스템은 형광 농도의 간단한 변경에 의해 하나의 형광 색의 판독에 기초한다. (4)이 접근법으로 인해 세포 내 성분 또는 낮은 신호대 잡음비의 형광도에 위양성 혹은 위음성 결과의 위험을 부담 때문에 다른 COM에 의해 원치 않는 담금질에ponents. 4 최근 개의 상이한 발색단을 사용하여 이중 형광 색 판독을 표시 &quot;DNA 신호등&quot;의 개념을보고 하였다. 5-6 개념은 형광 변화 셉터 염료 도너 염료의 에너지 전달 (ET)에 기초 컬러 (도 1 참조). 이는보다 안정적인 판독이 가능하여 형광 이미징 프로브를위한 강력한 도구를 제공합니다. 형광 염료를 가진 올리고 뉴클레오티드 라벨링 두 가지 방법에 의해 달성 될 수있다. 염료는 상응하는 개질 된 포스 빌딩 블록을 사용하여 고상에서 화학적 DNA 합성 동안 혼입 될 수있다. (7)이 메소드는 표준 포스 탈 보호 조건 하에서 안정한 염료로 제한된다. 대안으로, 사후 합성 수정 방법은 올리고 뉴클레오티드 화학에 설립되었다. 여기, 우리는 우리의 새로운 사진 중 하나의 합성을 보여테이블 에너지 전달 쌍 8,9 및 아 지드와 알킨 (CuAAC) 사이의 구리 촉매 1,3- 사이클로을 사용하여 DNA의 후 합성 라벨. (10)

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Potassium carbonate, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimethylcarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99.5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylquinoline</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DNA synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Amidite Diluent for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammonia (aqueous solution)&amp;nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal devices nanosep 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;workup&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;clicking procedure&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>synthesized according to a literature procedure&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;HPLC&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;determination of concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ND 1000 Spectrophotometer</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;sample preparation and spectroscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, &lt;em&gt;Org Lett&lt;/em&gt; 2004, &lt;strong&gt;6&lt;/strong&gt;, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

이 프로토콜에서는 2&#39;- 알킨의 합성 방법은 포스 표준 화학을 사용하여 자동화 고상 합성에 의해 디옥시리보 핵산 (DNA) 가닥을 변성 보여준다. 올리고 뉴클레오티드 후 합성 구리 촉매 클릭 화학 제를 사용하여 두 개의 새로운 광 안정성 시아닌 염료로 표시되어 있습니다. 모두 도너와 억 셉터 염료의 합성을 설명하고, 세 개의 연속 단계로 수행된다. 이들은 혼성화에 접할 때 주변 구조와 같은 DNA,이 두 염료의 에너지 전달을 겪는다. 따라서, 두 개의 단일 가닥의 DNA 가닥의 어닐링 형광 색의 변화에​​ 의해 가시화된다. 이 색상 변화는 형광 분광 특징뿐만 아니라, 직접적으로 휴대용 자외선 (UV) 램프를 이용하여 관찰 할 수있다. 이중 색상 형광 판독 값의 개념은 이러한 올리고 뉴클레오티드 프로브를 분자 이미징 특히 기재된 포위한 우수한 툴을 만든다tostable 염료가 사용된다. 이에 따라, 이미징 프로브 광표백은 방지되고, 생물학적 과정은 긴 시간주기 동안 실시간으로 관찰 할 수있다.

도 4에 도시 된 바와 같이, 단일 및 이중 가닥 DNA의 흡수 및 형광 스펙트럼을 기록한다. 기록 된 흡수 스펙트럼 (그림 4 오른쪽) 단일 가닥 DNA1 (염료 1) 및 단일 가닥 DNA2 (염료 2)에 대한 546 nm의 465 nm에서 쇼 흡수 최대의 λ 최대. 어닐링 DNA1_2 (염료 1 염료 2) 469 nm 내지 567 nm의 모두에서 최대 값을 ?...

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Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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11.0K 조회수.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

연구

생화학

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

전체 게놈 배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션의 기술의 데모

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

생물학

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

생체공학

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

면역 세포에 의한 일시적인 피코네톤 수용체 힘을 매핑하는 DNA 장력 프로브

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA &#39;roadblocks&#39;&#160;&#8212; is critical for ensuring faithful&#160;genome duplication.&#160;G-quadruplexes are higher-order nucleic acid structures that form in guanine-rich regions of DNA and have been shown to act as obstacles, interfering with genomic maintenance pathways. This study introduces a real-time, fluorescence microscopy-based method to observe DNA polymerase interactions with G-quadruplex structures. Short, primed DNA oligonucleotides containing a G-quadruplex were immobilized on functionalized glass coverslips within a microfluidic flow cell. Fluorescently labeled DNA polymerases were introduced, allowing their behavior and stoichiometry to be monitored over time. This approach enabled the observation of polymerase behavior as it was stalled by a G-quadruplex. Specifically, using fluorescently labeled yeast polymerase &#948;, it was found that upon encountering a G-quadruplex, the polymerase undergoes a continuous cycle of binding and unbinding. This single-molecule assay can be adapted to study interactions between various DNA-maintenance proteins and obstacles on the DNA substrate.

This protocol outlines a fluorescence microscopy-based single-molecule DNA replication assay, enabling real-time visualization of interactions between DNA polymerases and obstacles such as G-quadruplex structures.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

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