Il sostegno finanziario dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la ricerca di formazione Gruppo GRK 2039 (finanziato dalla DFG) e kit ringraziano.

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell&#39;uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate che sono tipicamente richiesti nei laboratori di chimica organica, come ad esempio indossare un camice da laboratorio, occhiali e guanti. 1. Sintesi dei coloranti Nota: Le due coloranti possono essere sintetizzati dagli stessi tipi di reazione Figura 2 mostra una panoramica di queste reazioni.. <ol><li> Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io ioduro (dye 1) <ol><li> Sintesi di 1- (3-iodopropyl) -4-methylpyridin-1-io ioduro (Figura 2A, passaggio a) <ol><li> Sciogliere 466 mg 4-picolina e 5,91 g di 1,3-diiodopropano in 10 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flacone 20 ml e sigillare ermeticamente da un tappo setto. </li><li> Riscaldare a 85 ° C per 16 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Aggiungere 20 ml di etile acetato per l&#39;olio residuo e trattare la miscela in un bagno ad ultrasuoni W 120 per 3 min. </li><li> Raccogliere il precipitato formatosi mediante filtrazione e lavare cinque volte con acetato di etile. Essiccare il prodotto solido sottovuoto O / N. </li></ol></li><li> Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-io (Figura 2A, fase b) <ol><li> Sciogliere 900 mg 1- (3-iodopropyl) -4-methylpyridin-1-io ioduro in 12 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flaconcino 20 ml, aggiungere 376 mg di sodio azide, e sigillare ermeticamente da un tappo setto. </li><li> Riscaldare a 85 ° C per 16 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Aggiungere 15 ml di diclorometano al residuo. </li><li> Filtrare fuori e scartare il precipitato risultante. </li><li> Eliminare il solvente a pressione ridotta utilizzando un rotevaporatore ary per ottenere il prodotto come olio bruno. </li></ol></li><li> Sintesi di 1-metil-1H-indol-3-carbaldeide (Figura 2A, fase c) <ol><li> Sotto gas inerte (argon), sciogliere 1,45 g indolo-3-carbaldeide, carbonato di potassio 1,52 ge 2,70 g dimetil carbonato in 10 ml di dimetilformammide assoluta in 50 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo. </li><li> Mescolare la miscela a 130 ° C per 19 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, poi versate il composto sul ghiaccio. </li><li> Estrarre la fase acquosa tre volte con acetato di etile 150 ml. </li><li> Combinare gli strati organici, lavarli con acqua, asciugarli su solfato di sodio e rimuovere il solvente a 50 ° C sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li></ol></li><li> Accoppiamento di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io ioduro (dye 1) (Figura 2A, fase d) <ol><li> Lavorare sotto argon e con esclusione di umidità. Dissolve 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-io e 48 mg 1-metil-1H-indol-3-carbaldeide in 4 ml di etanolo in 20 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo. </li><li> Aggiungere 0,07 ml piperidina e si riscalda a 80 ° C per 4 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere il precipitato per filtrazione e lavare tre volte con dietiletere. </li><li> Aggiungere dietiletere al surnatante e raccogliere il precipitato per filtrazione. Lavare tre volte con etere etilico. </li><li> Unire i precipitati. </li></ol></li></ol></li><li> Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) idrossi-1-io ioduro (dye 2) <ol><li> Sintesi di 1- (3-iodopropyl) -4-methylquinolin-1-io ioduro (Figura 2B, il passaggio a) <ol><li> Sciogliere 715 mg 4 methylquinoline e 5,91 g di 1,3-diiodopropano in 10 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flacone 20 ml e sigillare ermeticamente da un tappo setto. </li><li> Calorea 85 ° C per 16 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Aggiungere 20 ml di etile acetato per l&#39;olio rimanente e trattare la miscela in un bagno ad ultrasuoni W 120 per 3 min. </li><li> Raccogliere il precipitato formatosi mediante filtrazione e lavare cinque volte con acetato di etile. Essiccare il prodotto solido sottovuoto O / N. </li></ol></li><li> Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-io (Figura 2B, fase b) <ol><li> Sciogliere 900 mg 1- (3-iodopropyl) -4-methylquinolin-1-io ioduro in 12 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flaconcino 20 ml, aggiungere 333 mg di sodio azide, e sigillare ermeticamente da un tappo setto. </li><li> Riscaldare a 85 ° C per 16 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Aggiungere 15 ml di diclorometano al residuo. </li><li> Filtrare fuori e scartare il precipitato risultante. </li><li> Rimuovere la u solventender pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante per ottenere il prodotto come olio bruno. </li></ol></li><li> Sintesi di 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide (Figura 2B, la fase c) <ol><li> Sotto gas inerte (argon), sciogliere 1,45 g di 2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide, carbonato di potassio 0,996 ge 1,77 g dimetil carbonato in 10 ml di dimetilformammide assoluta in 50 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo. </li><li> Mescolare la miscela a 130 ° C per 19 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, poi versate il composto sul ghiaccio. </li><li> Estrarre la fase acquosa tre volte con acetato di etile 150 ml. </li><li> Combinare gli strati organici, lavarli con acqua, asciugarli su solfato di sodio e rimuovere il solvente a pressione ridotta usando evaporatore rotante. </li></ol></li><li> Accoppiamento di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-2-phe NYL-1H-indol-3-il) vinil) idrossi-1-io ioduro (Figura 2B, fase d) <ol><li> Lavorare sotto argsopra e sotto l&#39;esclusione di umidità. Disciogliere 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-io e 59,7 mg 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide in 4 ml di etanolo in 20 ml pallone a fondo tondo dotato di condensatore a riflusso. </li><li> Aggiungere 0,06 ml piperidina e si riscalda a 80 ° C per 4 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere il precipitato per filtrazione e lavare con dietiletere tre volte. </li><li> Aggiungere dietiletere al surnatante e raccogliere il precipitato per filtrazione. Lavare tre volte con etere etilico. </li><li> Unire i precipitati. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sintesi dei filamenti di DNA Nota: La sintesi dei filamenti di DNA viene effettuata con il metodo fosforammidito su una fase solida, come descritto da M. Caruthers 11 su un sintetizzatore di DNA. Il funzionamento del sintetizzatore viene testato prima della procedura di sintesi e reagenti si rinnovano senecessario. <ol><li> predisposizioni <ol><li> Sciogliere il disponibile in commercio 2&#39;-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) in 1,2 ml di diluente amidite (acetonitrile extra dry). Spostare soluzione nel flaconcino di una fiala sintetizzatore e avvitare in sintetizzatore. </li><li> Eseguire un &quot;test di tenuta&quot; (secondo le istruzioni del produttore) per assicurarsi che non esiste alcuna fuga di gas argon. Se la &quot;prova di tenuta&quot; fallisce, avvitare il flacone più strettamente. </li><li> Prime soluzione cU riempiendo il tubo che collega la camera di sintesi in fase solida. </li><li> Lavare tutte le linee con acetonitrile. </li></ol></li><li> Sintesi di filamenti di DNA <ol><li> Usare il computer collegato ad entrare nel metodo di sequenza del DNA e l&#39;accoppiamento, seguendo le istruzioni dal protocollo del produttore. La fase di accoppiamento del blocco di costruzione cU prende 168 secondi con 7 impulsi (ogni impulso sono 16 ml) rispetto a 40 sec con 7 impulsi per una convenzionalePhosphoramidite come blocchi di costruzione. </li><li> Montare la colonna contenente la CPG (vetro pori controllata) come fase solida che viene modificato con 1 mol della prima base (sintesi del DNA viene eseguita da 3 &#39;a 5&#39;) nel sintetizzatore. </li><li> Avviare la sintesi sul sintetizzatore di DNA 11. </li></ol></li><li> Workup di filamenti di DNA sintetizzati <ol><li> Asciugare le colonne con i filamenti di DNA sintetizzati sotto vuoto O / N. </li><li> Utilizzare una pinza per aprire la colonna e rilasciare il CPG in una fiala di reazione. Aggiungere 700 ml di soluzione di ammoniaca acquosa concentrata al deproteggere l&#39;oligonucleotide e rilasciare il filamento di DNA dal CPG. </li><li> Chiudere la fiala e applicare un coperchio di sicurezza sul recipiente di reazione per evitarne la rottura, e si riscalda a 50 ° C per 18 ore. </li><li> Rimuovere ammoniaca mediante centrifugazione a pressione ridotta (100 mbar) a 30 ° C per 30 min. </li><li> Inizia filtrazione da CPG: nave Centrifugare a 11.000 xg for 3 min. Prendere supernatante e trasferirlo in un dispositivo centrifuga con dimensione dei pori di 0,45 micron. Centrifugare a 1000 xg per 4 min. </li><li> Nel frattempo aggiungere 300 ml di acqua distillata al doppio CPG, vortex per 20 secondi e centrifugare a 11.000 xg per 3 min. Trasferire il surnatante nel dispositivo centrifuga e centrifugare a 1000 xg per 4 min. Ripetere questa procedura di lavaggio due volte. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua dalle soluzioni acquose riunite per centrifugazione a 0,1 mbar e 25 ° CO / N. </li></ol></li></ol> 3. Procedura &quot;Cliccando&quot; <ol><li> Aggiungere 50 ml di acqua bidistillata, 25 ml di una soluzione di ascorbato di sodio (0,4 M in acqua), 34 microlitri tris - [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ml di azide (0,01 M in DMSO / tBuOH 3: 1) e 17 ml di un tetrakis (acetonitrile) di rame (I) soluzione esafluorofosfato (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1) al campione di DNA alchino-modificato liofilizzato. </li&gt; <li> Incubare il campione a 60 ° C per 1,5 ore. </li><li> Raffreddare a RT. </li><li> Aggiungere 150 microlitri Na 2 EDTA (0,05 M in acqua) e 450 ml di acetato di sodio (0,3 M in acqua) per il campione di DNA e trasferimento in una provetta da 10 ml. </li><li> Aggiungere 10 ml di etanolo (100%) e mantenerlo a -32 ° C per 16 ore. </li><li> nave Centrifugare per 15 minuti a 1000 xg e rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare DNA pellet con 2 ml di etanolo freddo (80%). </li><li> pellet secco sotto pressione ridotta. </li></ol> 4. HPLC Purificazione Nota: Prima di separare i filamenti di DNA assicurarsi che l&#39;HPLC funziona correttamente, abbastanza solvente è disponibile e la colonna è pulito. Lavare colonna con la concentrazione iniziale di tampone / acetonitrile. <ol><li> Sciogliere il greggio DNA pellet in 250 ml di acqua bidistillata e trasferimento in una fiala HPLC. </li><li> Inizia HPLC run di 45 min con un gradiente di 0% acetonitrile al 15% di acetonitrile per tinture 1 e gradi<html> ento di 0% acetonitrile al 17% di acetonitrile per tintura 2. Monitorare la corsa controllando 260 nm (assorbimento DNA) e 459 nm (dye 1) o 542 nm (dye 2). Raccogliere quelle frazioni che mostrano assorbimento in entrambi i canali di lunghezza d&#39;onda. </li><li> Controllare le frazioni raccolte per la messa destra matrice assistito ionizzazione desorbimento laser (MALDI) spettrometria di massa utilizzando una matrice costituita da 3 hydroxypicolinic acido (3 hPa) e diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Preparare la matrice mescolando 900 ml di una soluzione satura di 3 HPA in 1: 1 miscela di acetonitrile e acqua con 100 ml di una soluzione diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) in acqua. </li><li> Pipetta 1-2 ml di sonda DNA sul bersaglio e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di matrice 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate al campione e mescolare fino cristallizza. </li><li> Eseguire la spettrometria di massa MALDI. </li><li> Unire le frazioni HPLC che presentano la massa a destra. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5. determinazione della concentrazione Nota: La concentrazione viene determinata misurando l&#39;assorbimento a 260 nm usando un UV / Vis spettrofotometro, sulla base dei coefficienti di estinzione (ε 260) delle basi del DNA e il colorante. <ol><li> Sciogliere il DNA in 100 - 200 ml di acqua bidistillata. </li><li> Applicare 1 ml di soluzione di DNA in UV / Vis spettrofotometro. </li><li> Misurare l&#39;assorbimento a 260 nm. Ripetete tre volte. </li><li> Prendere il valore medio per calcolare la concentrazione della soluzione. Per il calcolo dei coefficienti di estinzione, utilizzare ε 260nm delle quattro basi naturali 12 e 260 nm ε della CU blocco acquistato (considerato come uridina naturale) 12 per ottenere l&#39;260nm ε dell&#39;intero filamento di DNA. Per tintura 1, uso ε 260 nm = 10,200 L * mol -1 * cm -1 e tintura 2, l&#39;uso ε 260 nm = 13.100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Calcolare la concentrazione della soluzione seguente legge di Lambert-Beers &#39;sulla base dei coefficienti di estinzione e assorbanze misurate. 13 </li></ol> 6. Preparazione del campione e Spettroscopia <ol><li> Preparazione dei campioni singolo filamento <ol><li> Preparare separatamente 1 ml di 2,5 uM soluzioni di ciascuno degli DNA1 modificato e DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i buffer, pH = 7. </li></ol></li><li> Preparazione dei campioni doppio filamento <ol><li> Preparare 1 ml di una soluzione contenente 2,5 mM di DNA1 e 2,5 mM di DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7 in un recipiente di reazione. </li><li> Fissare il coperchio con un tappo di sicurezza e di calore a 90 ° C per 10 min. Quindi spegnere il riscaldamento e lasciar raffreddare fino a RT O / N. </li></ol></li><li> spettroscopia di assorbimento Nota: per determinare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione per la specifica di fluorescenzaspettri di assorbimento troscopy sono registrati. <ol><li> Misurazioni singole Strand <ol><li> Registrare una misurazione in bianco contenente solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7. </li><li> Trasferire la soluzione preparata di DNA1 in vaschetta da 1 cm vetro di quarzo e registrare l&#39;assorbimento. Correggere la misurazione con i dati vuoti. Determinare il valore massimo di assorbimento colorante. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per DNA2. </li></ol></li></ol></li><li> spettroscopia di fluorescenza <ol><li> Misurazioni singole Strand <ol><li> Registrare una misurazione in bianco contenente solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7; utilizzando la lunghezza d&#39;onda di eccitazione di colorante 1. </li><li> Trasferire la soluzione DNA1 in vaschetta da 1 cm vetro di quarzo. </li><li> Registrare lo spettro di fluorescenza. </li></ol></li><li> Misurazione doppio filamento <ol><li> Trasferire la soluzione a doppio filamento in una provetta di vetro di quarzo. </li&gt; <li> Registrare lo spettro di fluorescenza utilizzando la lunghezza d&#39;onda di eccitazione di colorante 1. </li></ol></li></ol></li><li> esperimenti di visualizzazione Attenzione: la protezione degli occhi adeguata dovrebbe essere indossato per evitare danni UV per gli occhi! <ol><li> Per ottenere una migliore comprensione di ciò che gli spettri registrati stanno mostrando, irradiare le cuvette con palmare lampade UV (Figura 5). Osservare il cambiamento di colore di fluorescenza dal singolo al DNA a doppio filamento. </li></ol></li></ol>

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	<li>Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategies+for+fluorescent+probe+design+in+medical+diagnostic+imaging.">New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging.</a> Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Measurements+and+Biological+Imaging.">Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging.</a> Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity-oriented+optical+imaging+probe+development.">Diversity-oriented optical imaging probe development.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).</li><li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination.">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).</li><li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=#34;DNA+Traffic+Lights&amp;#34;:+Concept+of+Wavelength-Shifting+DNA+Probes+and+Application+in+an+Aptasensor.">#34;DNA Traffic Lights&amp;#34;: Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).</li><li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+&amp;#34;Traffic+Lights&amp;#34;:+Synthetic+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Probes+Based+on+Nucleic+Acid+Base+Substitutes+for+Molecular+Imaging.">DNA and RNA &amp;#34;Traffic Lights&amp;#34;: Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging.</a> J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).</li><li>Berndl, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Color+Readout+of+DNA+Hybridization+with+Thiazole+Orange+as+an+Artificial+DNA+Base.">Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).</li><li>Bohl&#228;nder, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+Photostable+Energy-Transfer+Pair+for+&amp;#34;DNA+Traffic+Lights&amp;#34.">Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for &amp;#34;DNA Traffic Lights&amp;#34.</a> Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).</li><li>Walter, H. K., Bohl&#228;nder, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Module+for+the+Adenosine+Aptamer+Using+Photostable+Cyanine+Dyes.">Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes.</a> ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).</li><li>Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+as+a+reliable+method+for+the+high-density+postsynthetic+functionalization+of+alkyne-modified+DNA.">Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA.</a> Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).</li><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+deoxyoligonucleotides+on+a+polymer+support.">Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support.</a> J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).</li><li>Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorbance+melting+curves+of+RNA.">Absorbance melting curves of RNA.</a> Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).</li><li>Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Dimers:+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes.">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li><li>Barrois, S., W&#246;rner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes:+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+&amp;#34;Traffic+Lights&amp;#34;,+Photochem.">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &amp;#34;Traffic Lights&amp;#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo mostra la procedura completa di etichettare DNA post-sinteticamente tramite CuAAC dai coloranti fluorescenti azide modificati. Questo include la sintesi dei coloranti e il DNA alchino modificato così come la procedura di etichettatura. La sintesi dei coloranti segue quattro fasi. Tutti i prodotti possono essere ottenuti da un piuttosto semplice precipitazione causa della loro carica positiva e non è necessaria tempo cromatografia su colonna. L&#39;introduzione delle funzi...

Imaging molecolare rappresenta una tecnica fondamentale per la comprensione dei processi biologici all&#39;interno delle cellule viventi. 1-3 Lo sviluppo di fluorescenti sonde base di acido nucleico per tali applicazioni chimico-biologico è diventato un campo di ricerca in espansione. Queste sonde fluorescenti devono soddisfare alcuni requisiti per diventare strumenti adatti per l&#39;imaging cellulare. In primo luogo, i coloranti applicati devono mostrare fluorescenza con elevati rendimenti quantici, turni grande Stokes &#39;e, soprattutto, di alta photostabilities per consentire a lungo termine imaging in vivo. E in secondo luogo, essi dovrebbero mostrare una lettura di fluorescenza affidabile. Convenzionale cromoforo-quencher sistemi si basano sulla lettura di un singolo colore di fluorescenza con semplici cambiamenti di intensità di fluorescenza. 4 Questo approccio si assume il rischio di risultati falsi positivi o falsi negativi a causa di autofluorescenza di componenti intracellulari o bassi rapporti segnale-rumore a causa di quenching indesiderato da altri comcomponenti. 4 Recentemente abbiamo riportato sul concetto di &quot;semafori DNA&quot; che mostrano doppio letture colore fluorescenza utilizzando due cromofori differenti. 5-6 Il concetto è basato sul trasferimento di energia (ET) dalla tintura donatore al colorante accettore che cambia la fluorescenza colore (vedi Figura 1). Questo consente una lettura più affidabile e quindi fornisce un potente strumento per sonde di imaging fluorescenti. Etichettatura di oligonucleotidi con coloranti fluorescenti può essere ottenuto mediante due approcci diversi. Coloranti possono essere incorporati durante la sintesi del DNA chimica su una fase solida utilizzando blocchi fosforammidito corrispondentemente modificati. 7 Questo metodo è limitato ai coloranti che sono stabili in condizioni Phosphoramidite e deprotezione standard. In alternativa, le metodologie di modificazione post-sintetici sono stati stabiliti in oligonucleotide chimica. Qui, dimostriamo la sintesi di una delle nostre nuove fotoenergia tabella coppie di trasferimento 8,9 e l&#39;etichettatura di post-sintetico del DNA utilizzando rame-catalizzata 1,3-cicloaddizione tra azidi ed alchini (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Potassium carbonate, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimethylcarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99.5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylquinoline</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DNA synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Amidite Diluent for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammonia (aqueous solution)&amp;nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal devices nanosep 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;workup&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;clicking procedure&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>synthesized according to a literature procedure&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;HPLC&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;determination of concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ND 1000 Spectrophotometer</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;sample preparation and spectroscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, &lt;em&gt;Org Lett&lt;/em&gt; 2004, &lt;strong&gt;6&lt;/strong&gt;, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

In questo protocollo, dimostriamo un metodo per la sintesi di 2&#39;-alchino modificato acido (DNA) trefoli nucleici di sintesi in fase solida utilizzando la chimica automatizzata fosforamidite standard. Oligonucleotidi sono post-sinteticamente etichettate da due nuove tinte cianina fotostabili utilizzando rame-catalizzata click-chimica. La sintesi di dye donatore e accettore è descritto ed avviene in tre fasi consecutive. Con il DNA come l&#39;architettura circostante, questi due coloranti subiscono un trasferimento di energia quando vengono portati in stretta prossimità mediante ibridazione. Pertanto, ricottura di due singoli filamenti di DNA bloccati viene visualizzato da un cambiamento di colore di fluorescenza. Questo cambiamento di colore è caratterizzato mediante spettroscopia di fluorescenza, ma può anche essere osservato direttamente utilizzando una lampada ultravioletta palmare (UV). Il concetto di una doppia lettura di fluorescenza di colore rende questi sonde oligonucleotidiche ottimi strumenti per l&#39;imaging molecolare soprattutto quando il pho descrittocoloranti tostable vengono utilizzati. In tal modo, photobleaching delle sonde di imaging è impedito, e processi biologici può essere osservato in tempo reale per un periodo di tempo più lungo.

Assorbimento e spettri di fluorescenza del DNA a singolo e doppio filamento sono registrati come mostrato in Figura 4. Gli spettri di assorbimento registrata (Figura 4 a destra) mostrano l&#39;assorbimento massimi λ max a 465 nm per DNA1 a singolo filamento (dye 1) e 546 nm per DNA2 a singolo filamento (dye 2). Il DNA1_2 ricotto (dye 1 &amp; dye 2) mostra massimi sia a 469 nm e 567...

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Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

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11.0K Views.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Ricerca

Biochimica

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Biologia

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Bioingegneria

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plasmidi derivati ​​da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA &#39;roadblocks&#39;&#160;&#8212; is critical for ensuring faithful&#160;genome duplication.&#160;G-quadruplexes are higher-order nucleic acid structures that form in guanine-rich regions of DNA and have been shown to act as obstacles, interfering with genomic maintenance pathways. This study introduces a real-time, fluorescence microscopy-based method to observe DNA polymerase interactions with G-quadruplex structures. Short, primed DNA oligonucleotides containing a G-quadruplex were immobilized on functionalized glass coverslips within a microfluidic flow cell. Fluorescently labeled DNA polymerases were introduced, allowing their behavior and stoichiometry to be monitored over time. This approach enabled the observation of polymerase behavior as it was stalled by a G-quadruplex. Specifically, using fluorescently labeled yeast polymerase &#948;, it was found that upon encountering a G-quadruplex, the polymerase undergoes a continuous cycle of binding and unbinding. This single-molecule assay can be adapted to study interactions between various DNA-maintenance proteins and obstacles on the DNA substrate.

This protocol outlines a fluorescence microscopy-based single-molecule DNA replication assay, enabling real-time visualization of interactions between DNA polymerases and obstacles such as G-quadruplex structures.

Sintesi della lunghezza d'onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Plasmidi derivati da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex

Sintesi della lunghezza d'onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

Riepilogo

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Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Plasmidi derivati ​​da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex

Plasmidi derivati da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici