Die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), das Graduiertenkolleg GRK 2039 (gefördert von der DFG) und KIT gedankt.

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesen Synthesen verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken, die typischerweise in der organischen Chemie Laboratorien erforderlich sind, wie zum Beispiel ein Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe zu tragen. 1. Synthese der Farbstoffe Anmerkung: Beide Farbstoffe können durch die gleichen Reaktionstypen synthetisiert werden , Figur 2 einen Überblick über diese Reaktionen zeigt.. <ol><li> Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium - iodid (Farbstoff 1) <ol><li> Synthese von 1- (3-Iodpropyl) -4-methylpyridin-1-ium - iodid (2A, Schritt a) <ol><li> Man löst 466 mg 4-Picolin und 5,91 g 1,3-Diiodpropan in 10 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle und Dichtung dicht mit einer Septumkappe. </li><li> Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck, um einen Rotationsverdampfer. </li><li> 20 ml Ethylacetat zu dem Restöl und behandeln der Mischung in einem 120 W Ultraschallbad für 3 min. </li><li> Sammeln des gebildeten Niederschlag durch Filtration und wäscht fünfmal mit Essigester. Trocknen Sie das feste Produkt unter Vakuum O / N. </li></ol></li><li> Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium (2A, Schritt b) <ol><li> Man löst 900 mg 1- (3-Iodpropyl) -4-methylpyridin-1-ium-iodid in 12 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle, fügen 376 mg Natriumazid, und abdichten dicht durch eine Septumkappe. </li><li> Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. </li><li> 15 ml Dichlormethan zu dem Rückstand. </li><li> Filter aus und entsorgen Sie die resultierende Niederschlag. </li><li> Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck unter Verwendung eines rotary Verdampfer um das Produkt als braunes Öl zu erhalten. </li></ol></li><li> Synthese von 1-Methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (2A, Schritt c) <ol><li> Unter Schutzgas (Argon), lösen sich 1,45 g Indol-3-carbaldehyd, 1,52 g Kaliumcarbonat und 2,70 g Dimethylcarbonat in 10 ml absolutem Dimethylformamid in einem 50 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet. </li><li> Rühren Sie die Mischung bei 130 ° C für 19 Std. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, dann gießen Sie die Mischung auf Eis. </li><li> Die wässrige Phase dreimal mit je 150 ml Ethylacetat. </li><li> Die organischen Schichten, sie mit Wasser waschen, trocknen Sie sie über Natriumsulfat und Entfernen des Lösungsmittels bei 50 ° C unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. </li></ol></li><li> Ankoppeln an 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium - iodid (Farbstoff 1) (2A, Schritt d) <ol><li> Arbeiten unter Argon und unter Ausschluss von Feuchtigkeit. DISSOLve 90 mg 1- (3-Azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium und 48 mg 1-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd in 4 ml Ethanol in einem 20 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet. </li><li> Hinzufügen, 0,07 ml Piperidin und Wärme auf 80 ° C für 4 Stunden. </li><li> Erlauben auf RT abkühlen. </li><li> Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration und wäscht dreimal mit Diethylether. </li><li> Hinzufügen Diäthyläther zu dem Überstand und Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration. Waschen dreimal mit Diethylether. </li><li> Kombinieren Sie die Niederschläge. </li></ol></li></ol></li><li> Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phenyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinolin-1-ium - iodid (Farbstoff 2) <ol><li> Synthese von 1- (3-Iodpropyl) -4-methylchinolin-1-ium - iodid (2B, Schritt a) <ol><li> Man löst 715 mg 4-methylchinolin und 5,91 g 1,3-Diiodpropan in 10 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle und Dichtung dicht mit einer Septumkappe. </li><li> Hitzebis 85 ° C für 16 Stunden. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. </li><li> 20 ml Ethylacetat zu dem restlichen Öl und behandeln der Mischung in einem 120 W Ultraschallbad für 3 min. </li><li> Sammeln des gebildeten Niederschlag durch Filtration und wäscht fünfmal mit Essigester. Trocknen Sie das feste Produkt unter Vakuum O / N. </li></ol></li><li> Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4-methylchinolin-1-ium (2B, Schritt b) <ol><li> Man löst 900 mg 1- (3-Iodpropyl) -4-methylchinolin-1-ium-iodid in 12 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle, fügen 333 mg Natriumazid, und abdichten dicht durch eine Septumkappe. </li><li> Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. </li><li> 15 ml Dichlormethan zu dem Rückstand. </li><li> Filter aus und entsorgen Sie die resultierende Niederschlag. </li><li> Entfernen Sie das Lösungsmittel under vermindertem Druck am Rotationsverdampfer das Produkt als braunes Öl zu erhalten. </li></ol></li><li> Synthese von 1-Methyl-2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd (2B, Schritt c) <ol><li> Unter Schutzgas (Argon), lösen sich 1,45 g 2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd, 0,996 g Kaliumcarbonat und 1,77 g Dimethylcarbonat in 10 ml absolutem Dimethylformamid in einem 50 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet. </li><li> Rühren Sie die Mischung bei 130 ° C für 19 Std. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, dann gießen Sie die Mischung auf Eis. </li><li> Die wässrige Phase dreimal mit je 150 ml Ethylacetat. </li><li> Die organischen Schichten, sie mit Wasser waschen, trocknen Sie sie über Natriumsulfat und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer. </li></ol></li><li> Ankoppeln an 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phe nyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinolin-1-ium - iodid (2B, Schritt d) <ol><li> Die Arbeiten im Rahmen argauf und unter Ausschluss von Feuchtigkeit. Man löst 90 mg 1- (3-Azidopropyl) -4-methylchinolin-1-ium und 59,7 mg 1-Methyl-2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd in 4 ml Ethanol in einem 20 ml-Rundkolben, ausgestattet mit Rückflußkühler. </li><li> 0.06 ml Piperidin und Wärme auf 80 ° C für 4 Stunden. </li><li> Erlauben auf RT abkühlen. </li><li> Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration und wäscht mit Diäthyläther dreimal. </li><li> Hinzufügen Diäthyläther zu dem Überstand und Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration. Waschen dreimal mit Diethylether. </li><li> Kombinieren Sie die Niederschläge. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Synthese der DNA-Stränge Anmerkung: Die Synthese der DNA - Stränge erfolgt auf einer Festphase , die Phosphoramidit - Methode, wie von M. Caruthers 11 auf einem DNA - Synthesizer beschrieben. Die Funktionsweise des Synthesizers wird vor dem Syntheseverfahren getestet, und die Reagenzien werden erneuert, wennnotwendig. <ol><li> Vorplanung <ol><li> Man löst den im Handel erhältlichen 2&#39;-O-Propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) in 1,2 ml Amiditchemie Verdünnungsmittel (extra trockenem Acetonitril). Bewegen Lösung in dem Fläschchen mit einem Synthesizer Fläschchen und verschrauben Synthesizer. </li><li> Führen Sie eine &quot;Dichtigkeitsprüfung&quot; (nach Herstellerangaben), um sicherzustellen, dass kein Argongas Leck vorhanden ist. Wenn der &quot;Dichtigkeitsprüfung&quot; versagt, Schraube noch fester in das Fläschchen. </li><li> Prime die cU Lösung durch das Rohr füllt, die auf der Festphasensynthese Kammer verbindet. </li><li> Waschen Sie alle Linien mit Acetonitril. </li></ol></li><li> Synthese von DNA - Strängen <ol><li> Die angeschlossenen Computer die DNA-Sequenz und Kopplungsverfahren einzugeben, nach den Anweisungen aus dem Protokoll des Herstellers. Der Kupplungsschritt des cU Baustein nimmt 168 sec mit 7 Impulsen (jeder Impuls sind 16 &amp; mgr; l) im Vergleich zu 40 Sekunden mit 7 Impulsen für ein herkömmlichesPhosphoramidit als Bausteine. </li><li> Montieren der Säule die CPG (controlled pore glass) als feste Phase enthält, die mit 1 &amp; mgr; Mol der ersten Base modifiziert ist, in den Synthesizer (DNA-Synthese von 3 &#39;bis 5&#39;) durchgeführt. </li><li> Startet die Synthese auf der DNA - Synthesizers 11. </li></ol></li><li> Die Aufarbeitung der synthetisierten DNA - Stränge <ol><li> Trocknen Sie die Spalten mit den synthetisierten DNA-Stränge unter Vakuum O / N. </li><li> Verwenden Sie eine Zange um die Säule zu öffnen und das CPG in ein Reaktionsgefäß lösen. Hinzufügen, 700 &amp; mgr; l konzentrierter wässriger Ammoniaklösung das Oligonucleotid zu entschützen und geben den DNA-Strang aus der CPG. </li><li> Küvette und wenden sie platzen und Hitze ein Sicherheitsdeckel auf das Reaktionsgefäß 18 Stunden auf 50 ° C zu verhindern. </li><li> Entfernen Ammoniak durch Zentrifugation unter vermindertem Druck (100 mbar) bei 30 ° C für 30 min. </li><li> Starten Filtration von CPG: Zentrifugenbehälter bei 11.000 xg for 3 min. Nehmen Überstand und gibt sie in eine Zentrifugenvorrichtung mit einer Porengröße von 0,45 um. Zentrifuge bei 1000 × g für 4 min. </li><li> hinzufügen Inzwischen wurden 300 ul doppelt destilliertem Wasser auf die CPG, Vortex für 20 Sekunden und Zentrifuge bei 11.000 g für 3 min. Den Überstand in die Fliehkraftvorrichtung und Zentrifuge bei 1000 × g für 4 min. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. </li><li> Entfernen des Wassers aus den vereinigten wässrigen Lösungen bei 0,1 mbar und 25 ° CO / N Zentrifugieren. </li></ol></li></ol> 3. &quot;Ein Klick&quot; Verfahren <ol><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l doppelt destilliertem Wasser, 25 ul einer Natriumascorbat-Lösung (0,4 M in Wasser), 34 &amp; mgr; l Tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1), 114 &amp; mgr; l des Azids (0,01 M in DMSO / tBuOH 3: 1) und 17 ul eines Tetrakis (acetonitril) kupfer (I) hexafluorophosphat-Lösung (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1) mit dem lyophilisierten Alkin-modifizierte DNA-Probe. </li&gt; <li> Inkubieren der Probe bei 60 ° C für 1,5 Std. </li><li> Abkühlen auf RT. </li><li> Zugabe von 150 &amp; mgr; l Na 2 EDTA (0,05 M in Wasser) und 450 &amp; mgr; l Natriumacetat (0,3 M in Wasser) zu der DNA - Probe und in ein 10 ml Röhrchen. </li><li> In 10 ml Ethanol (100%) und halten bei -32 ° C für 16 Stunden. </li><li> Zentrifugengefäß für 15 min bei 1000 xg Überstand und zu entfernen. </li><li> Waschen DNA-Pellet mit 2 ml kaltem Ethanol (80%). </li><li> Trocknen des Pellets unter vermindertem Druck. </li></ol> 4. HPLC-Reinigung Hinweis: Vor dem Trennen der DNA-Stränge sicher, dass die HPLC ordnungsgemäß funktioniert, ist genügend Lösungsmittel vorhanden, und die Säule ist sauber. Spülen Sie Spalte mit der Ausgangskonzentration des Puffers / Acetonitril. <ol><li> Man löst das rohe DNA-Pellet in 250 &amp; mgr; l zweifach destilliertem Wasser aufgelöst und in eine HPLC-Fläschchen. </li><li> Starten HPLC-Lauf von 45 min mit einem Gradienten von 0% Acetonitril bis 15% Acetonitril für Farbstoff 1 und einem gradi<html> ent von 0% Acetonitril bis 17% Acetonitril für Farbstoff 2. Lauf durch Prüfen 260 nm (DNA-Absorption) und 459 nm (Farbstoff 1) oder 542 nm (Farbstoff 2) Monitor. Sammeln Sie diese Fraktionen, die Absorption in den beiden Wellenlängenkanälen zeigen. </li><li> Überprüfen Sie die gesammelten Fraktionen für die rechte Masse durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie eine Matrix, bestehend aus 3-Hydroxypicolinsäure (3HPA) und diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Bereiten Sie die Matrix durch Mischen von 900 ul einer gesättigten 3-HPA-Lösung in 1: 1-Gemisch aus Acetonitril und Wasser mit 100 ul einer diammoniumhydrogencitrate Lösung (100 g / l) in Wasser. </li><li> Pipettieren 1-2 ul der DNA-Sonde auf dem Ziel und lassen Sie es trocken auf Luft. </li><li> In 0,2 ul der 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate Matrix auf die Probe und mischen, bis es kristallisiert. </li><li> Führen Sie MALDI-Massenspektrometrie. </li><li> Kombinieren Sie diese HPLC-Fraktionen, die die richtige Masse aufweisen. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5. Bestimmung der Konzentration Anmerkung: Unter Verwendung eines UV / Vis - Spektrophotometer, basierend auf den Extinktionskoeffizienten (ε 260) der DNA - Basen und den Farbstoff Die Konzentration wird bestimmt , indem die Absorption bei 260 nm gemessen wird . <ol><li> Lösen Sie die DNA in 100 bis 200 &amp; mgr; l doppelt destilliertem Wasser. </li><li> Anwenden 1 ul der DNA-Lösung auf dem UV / Vis-Spektrophotometers. </li><li> Messen der Absorption bei 260 nm. Dreimal wiederholen. </li><li> Nehmen den Mittelwert der Konzentration der Lösung zu berechnen. Für die Berechnung der Extinktionskoeffizienten, verwenden &amp; egr 260nm der vier natürlichen Basen 12 und die ε 260nm des gekauften Baustein cU (als natürliche Uridin betrachtet) 12 , um die ε 260nm des gesamten DNA - Strang erhalten. Für Farbstoff 1, Verwendung ε 260nm = 10.200 L * mol -1 * cm -1 und Farbstoff 2, Verwendung ε 260nm = 13.100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Berechnen Sie die Konzentration der Lösung nach Lambert-Beers Gesetz basiert auf den Extinktionskoeffizienten und gemessenen Extinktionen. 13 </li></ol> 6. Probenvorbereitung und Spektroskopie <ol><li> Herstellung von Einzelstrang - Proben <ol><li> Bereiten getrennt 1 ml von 2,5 &amp; mgr; M Lösungen von jedem der modifizierten DNA1 und DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i, pH = 7. </li></ol></li><li> Herstellung von Doppelstrang - Proben <ol><li> Vorbereitung 1 ml einer Lösung , die 2,5 uM und 2,5 uM DNA1 von DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i, pH = 7 in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Befestigen Sie den Deckel mit einer Schutzkappe und Hitze bis 90 ° C für 10 min. Dann Heizung ausschalten und lassen RT O / N abzukühlen. </li></ol></li><li> Absorptionsspektroskopie Hinweis: Um die Anregungswellenlänge für die Fluoreszenz-Spezifikation bestimmentroskopisch Absorptionsspektren aufgezeichnet. <ol><li> Einzelstrang - Messungen <ol><li> Nehmen Sie eine leere Messung mit nur 200 mM NaCl, 50 mM NaP i - Puffer, pH = 7. </li><li> Übertragen Sie die vorbereitete Lösung von DNA1 in eine 1 cm Quarzglaskuvette und notieren Sie die Absorption. Korrigieren Sie die Messung gegen die leeren Daten. Bestimmen Sie den maximalen Wert der Farbstoffabsorption. </li><li> Wiederholen Sie dies für DNA2. </li></ol></li></ol></li><li> Fluoreszenzspektroskopie <ol><li> Einzelstrang - Messungen <ol><li> Nehmen Sie eine leere Messung mit nur 200 mM NaCl, 50 mM NaP i - Puffer, pH = 7; mit der Anregungswellenlänge des Farbstoffes 1. </li><li> Übertragen Sie die DNA1 Lösung in eine 1 cm Quarzglaskuvette. </li><li> Nehmen Sie das Fluoreszenzspektrum. </li></ol></li><li> Doppelstrang - Messung <ol><li> Übertragen Sie die Doppelstrang-Lösung in eine Quarzglaskuvette. </li&gt; <li> Nehmen Sie das Fluoreszenzspektrum mit der Anregungswellenlänge von Farbstoff 1. </li></ol></li></ol></li><li> Visualisierung Experimente Achtung: Geeignete Schutzbrille getragen werden UV-Schäden an den Augen zu vermeiden! <ol><li> Um ein besseres Verständnis dessen , was die aufgenommenen Spektren zeigen, bestrahlen die Küvetten mit Hand UV-Lampen (Abbildung 5). Beachten Sie die Veränderung der Fluoreszenzfarbe von der einzigen zur doppelsträngigen DNA. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll zeigt die komplette Prozedur DNA post-synthetisch über CuAAC durch Azid-modifizierte fluoreszierende Farbstoffe zu kennzeichnen. Dies schließt die Synthese der Farbstoffe und Alkin-modifizierte DNA als auch die Markierungsverfahren. Die Synthese der Farbstoffe folgende vier Schritte. Alle Produkte können durch eine recht einfache Fällung erhalten werden aufgrund ihrer positiven Ladung und nicht zeitaufwendig Säulenchromatographie benötigt. Die Einführung der Azid-Funk...

Die molekulare Bildgebung stellt eine grundlegende Technik für die in lebenden Zellen biologischen Prozesse verstehen. 1-3 Die Entwicklung von fluoreszierenden Nukleinsäure-basierte Sonden für solche chemisch-biologische Anwendungen ein expandierendes Forschungsgebiet geworden ist. Diese Fluoreszenzsonden müssen einige Anforderungen erfüllen die geeigneten Werkzeuge für Cell Imaging zu werden. Erstens sollten die eingesetzten Farbstoffe Fluoreszenz mit hoher Quantenausbeute aufweisen, große Stokes-Verschiebungen und, was am wichtigsten ist , hohe Photostabilitäten Langzeit - in vivo - Bildgebung zu ermöglichen. Und zweitens sollten sie eine zuverlässige Fluoreszenzanzeige zeigen. Herkömmliche Chromophor-Löscher-Systeme auf der Anzeige eines einzelnen Fluoreszenzfarbe durch einfache Veränderungen in der Fluoreszenzintensitäten basieren. 4 Dieser Ansatz das Risiko von falsch - positiven oder falsch - negative Ergebnisse trägt wegen Autofluoreszenz von intrazellulären Komponenten oder Low - Signal-zu-Rausch - Verhältnis aufgrund unerwünschter Löschung durch andere componenten. 4 Vor kurzem berichteten wir über das Konzept der &quot;DNA - Ampel&quot; , die zwei unterschiedliche Chromophore durch Verwendung von Dual - Fluoreszenzfarbe Ablesungen zeigen. 5-6 Das Konzept basiert auf dem Energietransfer (ET) aus dem Donor - Farbstoff an den Akzeptor - Farbstoff, der die Fluoreszenz ändert Farbe (siehe Abbildung 1). Dies ermöglicht eine zuverlässigere Anzeige und stellt damit ein leistungsfähiges Werkzeug für Fluoreszenz-Imaging-Sonden. Markierung von Oligonucleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen kann durch zwei verschiedene Ansätze erreicht werden. Farbstoffe können während der chemischen DNA - Synthese an einer festen Phase unter Verwendung von entsprechend modifizierten Phosphoramidit - Bausteinen. 7 Diese Methode ist beschränkt auf Farbstoffe eingearbeitet werden , die unter Bedingungen Standard - Phosphoramidit und Entschützung stabil sind. Als Alternative wurden post-synthetische Modifikation Methoden in Oligonukleotidchemie etabliert. Hier zeigen wir die Synthese eines unserer neuen FotosTabelle Energietransferpaare 8,9 und die post-synthetischen Markierung von DNA durch Kupfer-katalysierte 1,3-Cyclo zwischen Aziden und Alkinen (CuAAC) verwendet wird . 10

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Potassium carbonate, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimethylcarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 99.5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>technical grade</td></tr><tr><td>2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylquinoline</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DNA synthesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td><td>Applied Biosystems</td><td>&amp;nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Amidite Diluent for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Column 1.0&amp;nbsp;&amp;micro;mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammonia (aqueous solution)&amp;nbsp;</td><td>Fluka Analytical</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal devices nanosep 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;workup&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;clicking procedure&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>synthesized according to a literature procedure&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;HPLC&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 column</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;determination of concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ND 1000 Spectrophotometer</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;sample preparation and spectroscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorimeter</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, &lt;em&gt;Org Lett&lt;/em&gt; 2004, &lt;strong&gt;6&lt;/strong&gt;, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

In diesem Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Synthese von 2&#39;-Alkin-Desoxyribonukleinsäure (DNA) Stränge durch automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie modifiziert. Oligonukleotide werden nach der Synthese durch zwei neue photo Cyaninfarbstoffen markiert unter Verwendung von Kupfer-katalysierte Klick-Chemie. Die Synthese von Spender und Akzeptor-Farbstoff ist, beschrieben und wird in drei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt. Mit der DNA wie die umgebende Architektur, diese beiden Farbstoffe laufen einen Energietransfer, wenn sie in die Nähe von Hybridisierung gebracht werden. Daher Annealing von zwei einzelsträngigen DNA-Stränge wird durch eine Veränderung der Fluoreszenzfarbe visualisiert. Diese Farbänderung wird durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert, sondern auch durch die Verwendung eines Hand ultraviolette (UV) Lampe direkt beobachtet werden kann. Das Konzept einer Doppelfluoreszenzfarbe Auslese macht diese Oligonukleotidsonden hervorragende Werkzeuge für die molekulare Bildgebung vor allem, wenn die beschriebene photostable Farbstoffe verwendet. Dadurch Photobleaching der Abbildungssonden verhindert und biologische Prozesse in Echtzeit für einen längeren Zeitraum beobachtet werden.

Absorptions- und Fluoreszenzspektren des Einzel- und Doppelstrang - DNA, wie in Figur 4 gezeigt aufgezeichnet. Die aufgezeichneten Absorptionsspektren (Abbildung 4 rechts) zeigen Absorptionsmaxima λ max bei 465 nm für einsträngige DNA1 (Farbstoff 1) und 546 nm für einsträngige DNA2 (Farbstoff 2). Das angelagerte DNA1_2 (Farbstoff 1 Farbstoff 2) zeigt Maxima bei sowohl 469 nm un...

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Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

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11.0K Aufrufe.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Serie: Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Forschung

Biochemie

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Biologie

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

DNA-Tethered RNA Polymerase für programmierbare In-vitro-Transkription und molekulare Berechnung

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Biotechnik

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli mit Zwei-Farben-Einmolekülfluoreszenz in Situ-Hybridisierung

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA &#39;roadblocks&#39;&#160;&#8212; is critical for ensuring faithful&#160;genome duplication.&#160;G-quadruplexes are higher-order nucleic acid structures that form in guanine-rich regions of DNA and have been shown to act as obstacles, interfering with genomic maintenance pathways. This study introduces a real-time, fluorescence microscopy-based method to observe DNA polymerase interactions with G-quadruplex structures. Short, primed DNA oligonucleotides containing a G-quadruplex were immobilized on functionalized glass coverslips within a microfluidic flow cell. Fluorescently labeled DNA polymerases were introduced, allowing their behavior and stoichiometry to be monitored over time. This approach enabled the observation of polymerase behavior as it was stalled by a G-quadruplex. Specifically, using fluorescently labeled yeast polymerase &#948;, it was found that upon encountering a G-quadruplex, the polymerase undergoes a continuous cycle of binding and unbinding. This single-molecule assay can be adapted to study interactions between various DNA-maintenance proteins and obstacles on the DNA substrate.

This protocol outlines a fluorescence microscopy-based single-molecule DNA replication assay, enabling real-time visualization of interactions between DNA polymerases and obstacles such as G-quadruplex structures.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

Zusammenfassung

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