Name: simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover
Uploaded: 2016-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

Hayvan çalışmaları yetkili ve Newcastle Üniversitesi Etik inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan prosedürleri bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Yönerge&#39;de 2010 Avrupa Parlamentosu / 63 / EU gelen yönergelere uygun gerçekleştirilir bulundu. 1. Edu İdaresi <ol><li> steril tuzlu su çözeltisi içinde çözülür edu (w /% 0.9 h) 12.5 mg / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda. <ol><li> tamamen çözülmesi için 40 ° C ve vorteks çözelti ısıtılır. 6 günlük enjeksiyonlar için izin çalışmada tüm fareleri enjekte 4 ° C&#39;de yeterli edu / Saline saklayın. Not: Genellikle 6 farelerin her bir deney grubu için gereklidir. Ancak, güç hesapları bağımsız çalışmalar için yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Bireysel fareler tartılır. Her fare edu / tuzlu su çözeltisi içinde 100 ug / g (g başına stok edu solüsyonu 8 ul) yönetmek için gerekli hacmi hesaplayın. </li><li> Uygun volum çizmek25 G iğne ile insülin şırınga içine edu / tuzlu e. </li><li> onaylı Ev Ofis tekniklerini kullanarak fareleri işlerken intraperitoneal (ip) enjeksiyonları gerçekleştirin. <ol><li> kafes kapağındaki bir fare yerleştirin. Yavaşça kuyruk tabanı geri çekin ve sıkıca yapışmak fare kavramak. </li><li> kafa tabanına yakın işaret parmağı ve başparmak ile fare tutan ve yere doğru geriye hayvanın kafasını devrilme enjeksiyon için karın Açığa. </li><li> % 70 alkol solüsyonu ile karın silin. Hayvanın orta hat ve sağ alt kadranda bulun. Sağ alt kadran içine hayvana edu / Tuzlu çözüm enjekte. </li><li> Edu / tuzlu su çözeltisi ile fareler enjekte edilir ve günün saatini kaydeder. </li></ol></li><li> Tekrarlayın 6 gün boyunca, günün aynı anda 1.4 1.2 adımları tekrarlayın. Not: Bir Edu negatif kontrol akım sitometri analizi için yolluk ayarlamak için gerekli olduğundan, ek bir yaş, cinsiyet enjekte ve deneysel maçEdu olmayan tuz denk hacimde Ed fare. Bu, gerekli kontrolü (hiçbir EDU kontrolü) sağlayacaktır. Her çalışma reaktiflerin gruplar halinde varyasyonlara izin için bu kontrol dahil edilmelidir ve sitometresi kurdu. </li></ol> 2. Hasat Kalpler <ol><li> 6. Edu enjeksiyonundan 24 saat sonra, servikal dislokasyon (ya da 1 Home Office onaylı alternatif Çizelgesi yöntemi) kullanılarak fareler kurban. </li><li> Bir yatar pozisyonda kurban hayvan koyun ve cerrahi makas ile diyaframa orta karın cilt kesi yapmak. </li><li> diyaframı kesti ve kalp maruz bilateral kesilmiş vücut boşluğunda uzak sternum tutarak. </li><li> biraz kalbi kaldırın ve göğüs boşluğu dışında kalbini incelemek için çıkış yolunda büyük kan damarları kesilmiş. </li><li> Hemen PBS 4 ° C&#39;ye soğutulmuş 10 ml içeren bağımsız bir 15 ml santrifüj tüpüne her kalp yerleştirin. </li><li> sep kalpleri aktarınarate 10 cm Petri kapları, bir neşter sagital yönde ikiye her kalbi kesilmiş ve yavaşça forseps bir çift ile sıkarak kalbi yıkayın kullanarak. Sonra mümkün olduğunca kan kaldırmak için PBS değiştirin. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Aynı birey 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine her kalbin iki parçayı yerleştirin. </li><li> 3 veya alternatif mağaza örnekleri adıma -80 ° C adımlarla 2.9 ve 2.10 ayrıntılı olarak devam etmektedir. </li><li> 25 G iğne kullanılarak, kalp işlendiğinde Mikrosantrifüj tüpü kapak küçük bir delik dolayı gazların genişlemesine kapağın açılmasını önlemek için kullanılır. </li><li> dondurma için sıvı azotun, bir kap içinde her bir mikrosantrifüj tüpü ve yer etiketi. </li></ol> 3. Çekirdekler Ayrılma ve kardiyomiyosit Çekirdekler Etiketleme . 11 Bu çekirdekler ayrılma kardiyomyosit çekirdekleri etiketleme Bergmann ve ark o uyarlanmıştır enjekte tüm örnekler üzerinde bu yordamı gerçekleştirin: NotEdu ve enjekte tuz (hiçbir EDU kontrolü) negatif kontrol ile. Bu adımları gerçekleştirmek için gerekli çözümlerin tarifi için Tablo 1&#39;e bakınız. <ol><li> Her bir kalp analiz edilmesi için, 30 dakika inkübe edilir, bir ultra santrifüj tüpüne% 1 BSA / PBS çözeltisi 36 mL yer çözeltisi atılır ve daha sonra kurumaya bırakın. Not: Bu tüp adım 3.6 kullanılır. </li><li> kalpleri kıyma işlemi sırasında defrost sağlayan bir neşter kullanılarak buz ve kıyma üzerinde 10 mm çanak üzerine bireysel dondurulmuş kalpleri yerleştirin. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpünde hücre lisis tamponu, 15 ml inceltilmiş kalpleri yerleştirin ve oda sıcaklığında 25.000 rpm&#39;de 15 saniye için bir sonda homojenleştirici ile homojenize edilmiştir. </li><li> Santrifüj tüpüne Celi Lysis Buffer bir başka 15 ml ilave edilir ve geniş bir açıklık havan tokmağı ile 40 ml&#39;lik bir Dounce transfer. havaneli ile 10 kez gerçekleştirmek ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine, bir 100 um ile daha sonra 40 mikron hücre süzgecinden süzülür. </li><li> 10 dk için santrifüjT 700, 4 ° C&#39;de xg ve supernatant çıkarın. </li><li> Sükroz Gradyan çözeltiden 25 ml, nükleer pelet yeniden süspanse edin ve 3.1 hazırlanan bir ultra santrifüj tüpüne taze sukroz gradyanlı çözeltisi 10 ml üzerine çözelti içeren hücre çekirdekleri katman. </li><li> bir salıncak üzerinden boru rotor kullanılarak 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca 13.000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj sonrasında, süpernatant atılır ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve etiket PCM1 çekirdekler saklama tamponu 1.300 ul çekirdekleri pelletini. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süspansiyon 300 ul çıkarın ve taze çekirdekler depolama tamponu 700 ul ekle. ISO kontrolü gibi bu tüp etiketleyin. </li><li> PCM1 etiketli mikrosantrifüj tüpüne mi 8 ug / mL&#39;lik nihai bir konsantrasyonda anti PCM1 ekleyin ve ISO kontrolü etiketli mikrosantrifüj tüpüne 8 ug / ml bir konsantrasyonda Tavşan IgG izotip kontrol antikoru ilave edin. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. aşağıdaki inkubasyonation, 10 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüj 700 x g&#39;de 10 dakika boyunca tekrar taze çekirdek saklama tamponu, tekrar süspansiyon ve santrifüj 1 ml yerine, süpernatant atılır. Süpernatantı atın ve taze çekirdekler depolama tamponu 1 ml ile değiştirin. </li><li> 2 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için F (ab &#39;) Keçi anti-tavşan IgG (H + L) antikoru (FITC veya eşdeğer yeşil floresan boya) 2 Fragment 1 ul ekle. Not: bir F (ab &#39;) kullanımı 2 fragmanı antikorun makrofajlar ve B hücreleri gibi immün hücrelerin spesifik olmayan etiketleme potansiyelini azaltır. </li><li> alüminyum folyo sarma borular ışıktan korumak ve 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübasyona. </li></ol> Edu Kuruluş 4. Algılama <ol><li> Seyreltin 10x deiyonize su ile edu reaksiyon tamponu 01:10 konsantre. </li><li> Santrifüj PCM-1 ve ISO kontrolü etiketli çekirdek süspansiyonları, 10 dakika boyunca 700 x g hızında, süpernatan atılır ve 1 ml çekirdekleri pelet% 1 BSA / PBS solüsyonu. iki çekirdek pelet yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, süpernatantı atmak ve edu fiksatif 100 ul ile değiştirin. </li><li> ışıktan korumak ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin, alüminyum folyo ile tüpler sarın. </li><li> 700 xg% 1 BSA / PBS çözeltisi, santrifüj kez 1 ml örneği yıkama ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x saponin bazlı permeabilizasyon çözeltisi ile inkübe edilir. </li><li> 1x edu etiketleme kokteyl (Tablo 2) hazırlayın. 2 reaksiyonların en az hiçbir EDU kontrolü de gerekecektir. </li><li> şirketinden önce 1x saponin bazlı permeabilizasyon çözeltisi 100 ul çekirdek içeren her bir örnek için 1x edu markalama kokteyl 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca ışıktan korunarak oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> % 1 BSA / PBS 1 ml 700 xg ve tekrar süspansiyon Santrifüj ve bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 700 xg&#39;de santrifüj, supernatant atmak ve 4 ile değiştirinDNA boyama çözeltisi 00 ul (Malzeme Tablo). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td></tr><tr><td> 1. Hücre Liziz Tamponu </td></tr><tr><td> 0.32 M sukroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCI (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl2 </td></tr><tr><td> 5 mM magnezyum asetat </td></tr><tr><td> 2.0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 mM EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 2.Sucrose Gradyan Çözelti </td></tr><tr><td> 2.1 M sukroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCI (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM magnezyum asetat </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 3. Çekirdekler depolama tamponu (NSB) </td></tr><tr><td> 0.44 M sukroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCI (pH = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCI </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 1.5 mM spermin </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Çekirdekler izolasyon tampon maddeler protokol bölüm 3 (Çekirdekler ayrışma kardiyomyosit çekirdekleri etiketleme) kullanılan tüm Tamponlar için Reçete.. 5. Akım Sitometrisi Analizi Not: Daha önce 7,11,15 tarif edildiği gibi izole çekirdekler üzerinde sitometri Akışı gerçekleştirin. <ol><li> İlk olarak, enkaz (Şekil 2A) gelen çekirdeklerin ayrımcılık izin İleri Yayılım (FSC) ve Yana Yayılım (SSC) açıklayan bir arsa oluşturun. </li><li> Yüksekliği karşı 4 çizerek agrega (Şekil 2B) dan tek çekirdekleri ayırmak için bir komplo &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) oluşturun (DAPI) alan (3-405 / 450/50-A) (33-405 / 450 / 50-H). tha sağlamakt 3-405 / 450/50 sinyal DNA içeriğinin doğru belirlenmesini sağlamak için doğrusal bir ölçek üzerinde toplanır. </li><li> SSC vs 488/535/30 A açıklayan bir arsa (PCM-1) oluşturma ve tekli popülasyonda PCM-1 ifadesini değerlendirmek için 5.2 oluşturulan tekli kapısından sadece olayları görüntülemek. </li><li> PCM-1 pozitif kapı (Şekil 2C) oluşturmak üzere İzotip kontrol örneği çalıştırın. PCM1 küçük bir miktar nüfus ve yolluk konumunu ifade PCM1 doğrulamak için örnek etiketli çalıştırın. </li><li> 405/450/50-A (DAPI algılamak için) vs SSC-A açıklayan bir arsa oluşturun. Bu arsa içinde, ekran sadece 5.3 oluşturulan kapıları kullanarak, PCM1 ifade çekirdekleri tekli. Sadece 2N çekirdekleri (Şekil 2B) içeren ek bir hiyerarşik kapısı yaratmak için bu komplo kullanın. </li><li> Kardiyomiyosit nüfusu ifade PCM1 EDU etiketleme tanımlanmasını sağlamak için 1-633 / 660/20-A vs 488/535 / 30 A tanımlayan bir arsa oluşturun. tekli, P sadece çekirdekleri görüntülemek<html> Yukarıdaki ayırıp kullanarak CM1 + ve 2N. </li><li> Hiçbir EDU kontrolü çalıştırın kalp örnek edu pozitif kapısı (Şekil 2E) ayarlamak için. Edu + hücreleri için uygun kapı oluşturun. </li><li> Tutanak ve ölçmek tekli, Edu dahil olması PCM-1 ifade 2N çekirdekler. </li><li> toplam tekli, PCM1 + çekirdek bir yüzdesi olarak bu nüfusu hesaplayın. Bu, toplam kardiyomiyosit çekirdekleri bir yüzdesi olarak, 7 günlük edu darbe süresince neo-kardiyomiyosit çekirdek oluşum oranını sağlayacaktır. Not: DNA bağlanma DAPI stoikiometrik olduğu floresan yoğunluğu DNA miktarı ile orantılıdır. Daha önce tarif edildiği gibi, 7 405/450/50 bir sinyalin yoğunluğuna dayalı olarak ploidi belirler. </li><li> Toplam kardiyomiyosit nüfus içinde ploidi değerlendirmek için 5.5 kurulan arsa ve DNA konsantrasyonu 7 dayalı bir yolluk strateji kullanın. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2:. Kardiyomiyosit Edu katılmasını ve ploidi ölçmek için strateji yolluk (A) Çekirdekler forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) dayalı enkaz ayırt edilir. (B) doğrusal kapı oluşturulur ve tekli çekirdek nüfus DAPI etiketleme ve alan sinyali vs 405/450/50 boyuna göre belirlenir. (C), Floresan yolluk kalp dokusunda kardiyomiyosit çekirdekleri (PCM-pozitif 1) ve non-kardiyomiyosit (PCM-1-negatif) çekirdeklerin ayrılmasını sağlar. DAPI sinyalinin (D) Yoğunluk DNA konsantrasyonu ve PCM1 + kardiyomiyosit nüfusun böylece çekirdek ploidi belirlemek için kullanılır. farede&gt; kardiyomiyosit çekirdeklerinin% 80 diploid (2n) &#39;dir. (E) Floresan yolluk 2N ayrılmasını sağlar 2N Edu (PCM + / EDU + =% 0.9) dahil olması kardiyomiyosit çekirdeklerinin, Edu dahil değil kardiyomiyositlerde (PCM + EDU-). Tüm adımlar protokolde 5.0 detaylandırılmıştır. MDX gösterilmeleri Örnek -. C57 / BL10 arka plan üzerinde / y fareler <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324, 98-102 (2009).</li><li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes.">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493, 433-436 (2013).</li><li>Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+measuring+cardiomyocyte+renewal.">Challenges measuring cardiomyocyte renewal.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).</li><li>Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cell+therapy+stimulates+endogenous+cardiomyocyte+progenitors+and+promotes+cardiac+repair.">Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair.</a> Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).</li><li>Malliaras, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+proliferation+and+progenitor+cell+recruitment+underlie+therapeutic+regeneration+after+myocardial+infarction+in+the+adult+mouse+heart.">Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart.</a> EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).</li><li>Hsieh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+a+genetic+fate-mapping+study+that+stem+cells+refresh+adult+mammalian+cardiomyocytes+after+injury.">Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury.</a> Nat Med. 13, 970-974 (2007).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).</li><li>Carmena, M., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+geography+of+aurora+kinases.">The cellular geography of aurora kinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Cardiomyocyte+Nuclei+from+Post-mortem+Tissue.">Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue.</a> J. Vis. Exp. , e4205 (2012).</li><li>Gilsbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+orchestrates+cardiomyocyte+development,+maturation+and+disease.">Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease.</a> Nat Commun. 5, 5288 (2014).</li><li>Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+regeneration+in+the+mdx+mouse+model+of+non-ischemic+cardiomyopathy.">Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Cardiomyocyte renewal in humans.</a> Circ Res. 110, e17-e18 (2012).</li><li>Prigge, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+double-fluorescent+reporter+for+in+vivo+and+ex+vivo+analyses+of+biological+transitions+in+mouse+nuclei.">Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei.</a> Mamm Genome. , (2013).</li><li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number.">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157, 795-807 (2014).</li><li>Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiomyocyte+polyploidy+and+multinucleation+by+CyclinG1.">Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1.</a> Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).</li><li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+turnover+in+the+aging+human+heart.">Myocyte turnover in the aging human heart.</a> Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenesis+in+the+adult+human+heart.">Cardiomyogenesis in the adult human heart.</a> Circ Res. 107, 305-315 (2010).</li><li>Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation+in+vivo--an+analysis+based+on+cardiomyocyte+nuclei.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei.</a> Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).</li><li>Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).</li><li>Gonzalez-Valdes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+limits+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure+by+inhibiting+cardiac+senescence.">Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence.</a> Nat Commun. 6, 6473 (2015).</li><li>Kimura, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+fate+mapping+identifies+cycling+cardiomyocytes+in+the+adult+heart.">Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart.</a> Nature. 523, 226-230 (2015).</li><li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts.">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

doğru Kardiyomiyosit ciro ölçmek için ve rejenerasyon deneyleri gerçek kardiyomiyosit üretimi ve nonprodüktif DNA bölümü ayırt etmeliyiz. Birçok çalışma, sadece siklin kinesis ve hücre döngüsü belirteçleri ifadesi aracılığıyla kardiyomiyosit çoğalması miktarının, sadece bu nonprodüktif olayları görmezden gelmeye devam. Bu nonprodüktif olaylar için kontrol kinayeli kalırken kardiyomyosit ciro doğru ölçümü sağlar tek bir yöntemi bugüne kadar. Özellikle bu kardiyomiyosit DNA replikasyonu 13 65% ~ kadar katkıda kardiyomiyosit poliploidleşmeyi hesaba güçtür. Bu nedenle Kardiyomiyosit nesil doğru ölçümü biz artan ploidleşmede sonuçlanan DNA replikasyonu hariç ise neo kardiyomiyosit çekirdeklerinin oranlarının güçlü ölçümü sağlar bir protokol geliştirdi yardımcı olmak. Her ne kadar bu protokol can neo-kardiyomiyosit cins arasında değil ayrımcılıkyon kardiyomyosit iki çekirdeklenme, hızla kullanılan ve doğru bir üst limit kardiyomiyosit nesil (ploidleşmede için muhasebe) hesaplamak mümkündür. Bu protokol, bu nedenle hastalık modellerinde kardiyomiyosit üretimi ve poliploidleşmeyi oranlarında potansiyel değişiklikleri değerlendirmek için ya da terapötik potansiyel etkinliğini değerlendirmek için bir tarama aracı sağlar. Neo-kardiyomiyosit çekirdekler üretimi hızındaki değişiklikler bu protokolü kullanılarak tespit edildikten sonra kardiyomiyosit çekirdeklenme sayısının kardiyomiyosit nesil değişiklikler nedeniyle, bu, daha önce tarif edildiği gibi 2,13,17,18, eğer daha sonraki çalışmalarda tespit etmek için kullanılabilir. Bunlar darbe döneminde histolojik miktar kardiyomiyosit çekirdeklenme dinamikleri kullanımını içerir veya mononükleer ve çok çekirdekli kardiyomiyosit popülasyonlarında edu birleşmesini karşılaştırmak için edu darbeli hayvanlardan elde edilen doku kesitlerinde analiz eder. Nedeniyle kardiyomiyosit ciro bu düşük seviyelerdeprotokol 7 günlük bir süre içinde edu birden enjeksiyonları kullanır. Bu aynı zamanda Kardiyomiyosit nesil tüm potansiyel hücresel kaynakların &quot;peşinde&quot; ve bu süre boyunca kümülatif kardiyomiyosit çekirdeklerinin nesil ölçümü izin verir. Çalışmada bağlı olarak, bu zaman aralığı kardiyomiyosit nesil tahmin düzeylerine uygun şekilde ayarlanabilir. kardiyomiyosit çekirdeklerde edu dahil doğru ölçümü için, PCM-1 reaktivitesini tespit etmek için kullanılan ikincil antikor ile çekirdeklerin herhangi spesifik olmayan etiketleme olup zorunludur. Nedenle, bunun dışında, bir ikincil antikor, bu protokol, kullanılacak önerilen, özellikle protokol bu yönünü optimize etmek için ilave ikincil antikor titrasyon deneyleri gerçekleştirmek için mantıklı olacaktır. Burada açıklanan protokol kardiyomiyosit çekirdekleri tanımlamak için PCM-1 ifadesini kullanır. Bu kurulu bir kardiyomiyosit belirtecidir Ancak, alternatif markörler doğrulamak için kullanılabilirveri; Bu, kısmen kardiyomiyosit çekirdekleri 1. lokalize olarak tanımlanmıştır cTnT&#39;nin için spesifik antikorları içerir. Benzer şekilde, alternatif çekirdek lokalize proteinler kardiyomiyositlerin dışındaki çekirdek popülasyonlarda edu birleşmesini belirlemek ve ölçmek için kullanılabilir. DNA sentezinin akıbeti henüz bilinmiyor ve hücre bölünmesi ya da artmış ploidleşmede ya neden olabilir aktif olarak mitoz geçiren tüm kardiyomiyosit çekirdekler, analize dahil edilmesi önemlidir. PCM1 nedenle mitoz geçiren PCM1 ifade tarafından tespit olmayacaktır kardiyomiyositlerinin hücre döngüsünün M fazında demonte edilir. Buna ek olarak, hücre döngüsünün S fazında Tüm çekirdekler daha sonra analize dahil edilmelidir. Bu 2N ve 4N popülasyonlar arasındaki bir DAPI yoğunluğu da dahil olmak üzere 2N nüfus üzerinde bir DAPI yoğunluğu ile tüm çekirdekleri dışarı yolluk elde edilebilir. giderek rağmenKalp normal yaşlanma ve sonrası akut yaralanma sırasında kardiyomiyositlerde yerine kapasitesine sahip olduğunu kabul, bu potansiyelin kaynağı ve derecesi tartışmalıdır. Buna ek olarak, kardiyomiyosit devir farklı oranları 1,7,20-22 bildirilmiştir. Bu, doğru tanımlanması ve neo-kardiyomiyosit Üretimi 19 miktarının zorluklara kısmen olabilir. Çalışmaların büyük çoğunluğu sadece histolojik analizinin kullanımı kardiyomyosit devir ve yenileme 2,4,23,24 miktarının sarkomerinde proteinler de dahil olmak üzere sitoplazmik proteinlerin ekspresyonu ile kardiyomiyositlerin tanımlanması dayanmıştır Bugüne kadar. Bu yöntemlerin kullanılması çoğalması markerlerinin ifadesi tespit etmek için, ya da burada gösterildiği gibi, timidin analogları dahil kolayca kardiyomiyositlerde ve diğer kardiyak hücre tiplerinin hatalı tanımlama neden olabilir. 3D konfokal görüntüleme kullanımı inci bu sorunları hafifletmek için yardımcı olabilirESE yöntemler pahalı ve zaman alıcıdır. İlginç bir şekilde, burada açıklanan protokol, neo-kardiyomiyosit çekirdekler üretimi haftada% 0.17 oranında oluşur göstermektedir. Bu kadar 0.13% 5 haftalık ciro oranlarını gösteren bazlı çalışmalar sitometri diğer akışı ile tutarlıdır. Önceki çalışmalarda 2,5,25,26 gibi bu verilere dayalı yıllık cirosu oranları tahmin etmek cazip olmasına rağmen ciro oranları bir hayvanın 13 yaşam süresi boyunca dinamik olarak, bu uygunsuz. Bu yöntem kardiyomyosit rejenerasyonu artırmak için potansiyel terapötikler değerlendirilmesi veya kardiyomiyosit ciro kalp hastalığı etkilerini kardiyomyosit poliploidleşmeyi oranları araştıran dahil olmak üzere potansiyel uygulamaları bir dizi vardır.

Son yıllarda kalp terminal farklılaşmış, post-mitotik organı 1,2 olduğunu varsayım zorlu delil birikimi olmuştur. Ancak, kardiyomiyosit ciro ve yenilenme ölçümü zor kalır. Doğru, standart immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nadir kardiyomiyosit nesil belirlenmesinde zorluklar iyi 3 bildirilmiştir. Buna ek olarak, kardiyomiyosit nesil hücresel kaynak kardiyomiyosit çoğalması ve kök hücre farklılaşması 4-6 katkıları için kanıt belirsizdir. Bu nedenle, kardiyomiyosit progenitör fenotip bilgisi gerektiren soyu izleme modellerin kullanımı imkansız ve kardiyomiyositlerde dahil olmak üzere tek nüfus, çoğalma ölçümü ise, uygun değildir. Ayrıca, bir kardiyomiyosit karyokinesis olmayan endoreplication potansiyeline sahip (bir poliploid araba sonuçlanandiomyocyte) ya da sitokinez (a binükleer kardiyomiyosit sonuçlanır) 7,8 yokluğunda karyokinesis. Kardiyomiyosit ciro doğru ölçümü bu olaylar ve gerçek neo-kardiyomiyosit nesil arasında ayrım yeteneğine bağlıdır. Kardiyomiyositlerde DNA replikasyonu ve sikline bağımlı kinazlann ekspresyonu sadece gerçek hücre bölünmesini 9,10 göstermektedir, çünkü bu özel sorun çıkarmaktadır. Uzun vadede yeni yöntemlere göre Bergmann ve ark., 7,11 tarif edildiği gibi, neo-kardiyomiyosit nesil miktar yardımcı olmak için, kurulu bir çekirdek izolasyon tekniği ve kardiyomiyosit çekirdekleri tanımlanması için pericentriolar madde 1 (PCM1) immünolojik etiketleme birleştirdik DNA etiketleme ve ploid analizi. PCM-1 farklılaşmış olmayan bisiklet miyositler nükleer yüzeyinde birikir bir sentrozom proteindir. Daha önceki çalışmalar, karşı antikor olduğunu göstermiştirPCM-1, özellikle kardiyomiyosit çekirdekleri 7,11 etiket ve PCM1 bağımsız grupların sayısına göre kullanılır olmuştur olarak kardiyomiyositlerde 1,12,13 tanımlamak için. Buna ek olarak, PCM1 sentezleme TNT-cre transjenik fare modelinde 14 (Ek Şekil 1) genetik olarak etiketlenmiş kardiyomiyosit çekirdekleri eşleştiren olduğunu göstermiştir. Burada açıklanan protokol bağımsız bağlı analizi (Şekil 1C, D) için poliploidleşmeyi hücresel kökenli (Şekil 1 A ve B), aynı zamanda nükleozit etiketleme hariç ise bölgesinin fare kalp neo kardiyomiyosit çekirdeklerinin üretiminin doğru ve hassas bir tanımlanmasını sağlar. Bu yöntem, kardiyomiyosit binucleation için kontrol edemez birlikte, kardiyomiyosit devir doğru ölçümü için gerekli olan yeni-kardiyomiyosit çekirdeklerin hızlı ve sağlam bir ölçümü sağlar. Ayrıca,o Kardiyomiyosit nesil dinamikleri potansiyel değişiklikleri değerlendirmek için hızlı bir tarama aracı sağlar. DNA etiketleme genellikle timidin analoğu gibi, 5-bromo-2&#39;-deoksiüridin (BrdU) içerirken, burada açıklanan protokolü daha hızlı için daha az işlem adımı gerektirir gibi bir 5-etinil-2&#39;-deoksiüridin (edu) bazlı analiz kullanır iş-zaman ve diğer immün protokolleri ve böylece yöntemin potansiyel alt uygulamaları artan ile uyumlu hale immüno saptanması için DNA denatüre gerektirmez. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> Şekil 1: Edu ile sürekli darbe bakılmaksızın atalarıdır neo-kardiyomiyositlerde etiketler. (A) edu hücre bölünmesi esnasında kardiyomiyositlerin DNA&#39;ya dahil edilir. kardiyomiyosit popülasyonda çoğalma Resul olacakkardiyomiyositlerinin bir artış ya da değiştirilmesi t ve dolayısıyla verimli DNA sentezi (doku bakım ve onarımı katkıda) &#39;dir. (B) edu hücre bölünmesi sırasında kalp progenitör hücrelerin DNA içine dahil edilir. Bu kardiyomiyosit soy farklılaşma sırasında hücrede muhafaza edilecektir. Bu kök hücre farklılaşması da kardiyomiyositlerinin sayısında bir artışa neden ve bu nedenle doku bakım ve onarım katkıda olacaktır. (C) Kardiyomiyositler kardiyomiyosit hipertrofisi ve miyokard biçimlenme ile ilişkili artmış kardiyomiyosit ploidi, sonuçlanan &quot;üretken olmayan&quot; DNA replikasyonu geçmesi potansiyeline sahip, ancak kaybedilen kardiyomiyositlerde yerine geçmez. Bu iki homolog kromozomlar (&gt; 2 N), dört veya daha fazla grup ihtiva eden bir tek çekirdek bir kardiyomiyosit sonuçlanan şekilde poliploidleşmeyi bir işlem binucleation farklıdır. Sürekli bir çekirdek p aşağıdakı (D)Ulse, bu protokol kardiyomiyosit ploidinin ve edu dahil hem miktarının izin PCM1 ifade tarafından kardiyomiyosit çekirdeklerinin çekirdekleri izolasyonu ve tanımlanmasını açıklar. PCM1 ifade ve akım sitometri kullanılarak tespit edu kuruluş. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M sucrose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM magnesium acetate</td><td>sigma</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Sigma</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM spermine</td><td>Sigma</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-PCM-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab&#039;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>cell strainers&amp;nbsp; 70 &amp;mu;m and 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11597522, 11517532</td><td></td></tr><tr><td>Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td><td>Sigma</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2&amp;rsquo;-deoxyuridine)</td><td>Life technologies</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Life technologies</td><td>C10634</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for section, EdU reaction buffer,&amp;nbsp; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td></tr><tr><td>CyStain DNA 2 step kit,</td><td>Sysmex Partec</td><td>05 5005</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td></tr><tr><td>Probe homogeniser, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor Disposable Probes</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

kalp, normal yaşlanma sırasında yaralanma aşağıdaki kardiyomiyositlerde kardiyomyosit ciro bu düşük seviyelerde meydana yenilemek için sınırlı bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmekle birlikte, bu olayların ölçümü zor kalır. Bu durum sürecin nadir ve çok sayıda hücresel kaynaklar miyokard korunmasına katkıda gerçeğine bölümünde yer almaktadır. Ayrıca, kardiyomiyositlerinin içinde DNA çoğaltılması genellikle polyploid kardiyomiyosit yol açar ve nadiren hücresel bölümü tarafından yeni kardiyomiyositlere yol açar. doğru bu süreçler arasındaki kardiyomiyosit ciro ayrımcılığı ölçmek için esastır. Burada açıklanan protokol çekirdek izolasyon ve sonraki PCM1 immün kullanılarak belirlenen DNA replikasyonu kardiyomyosit çekirdekleri sonucunda ortaya çıkan tüm çekirdeklerin etiketlemek için uzun vadeli nükleozid etiketleme kullanır. Birlikte bu c nükleozid etiketleme doğru ve hassas bir şekilde tanımlanmasına yardımcı olmaktadırçekirdekler nüfus ardiomyocyte. Ayrıca, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol etiketleme ve çekirdekler ploidinin analizi, poliploidleşmeyi sırasında nükleosit dahil olan çekirdeklerin neo-kardiyomiyosit çekirdeklerin ayrım sağlar. Bu yöntem, kardiyomiyosit binucleation için kontrol olamaz da poliploidleşmeyi için gerekli hesaplamaların, neo-kardiyomiyosit çekirdeklerin hızlı ve sağlam bir ölçümü sağlar. Bu yöntem kardiyomyosit rejenerasyonu artırmak için potansiyel terapötikler değerlendirilmesi veya kardiyomiyosit ciro ve ploidleşmede kardiyak hastalığın etkilerini araştıran dahil mansap uygulamaları bir dizi vardır. Bu teknik, aynı zamanda tüm kardiyak hücre tiplerinde nükleosit esas sayılmasına olanak tanıyan ek bir alt immünohistolojik tekniklerle uyumludur.

artan poliploidleşmeyi için kontrol ederken bu yöntem nedeniyle kardiyomiyosit çekirdeklerinin bölünme arttı edu kuruluş ölçümü sağlar. Bir BrdU bazlı bir deney kullanılarak, daha önce, memeli kalp yeni kardiyomiyositlerde rejenerasyonu ile, Duchenne kas distrofisi MDX fare modelinde kronik kardiyomiyosit kaybına cevap gösterdi. Biz daha da yayınlanan bulgularını doğrulamak ve protokol yarar göstermek için burada açıklanan yöntemleri kullandık. açıklanan protokol gereği; Yetişkin (12 haftalık) mdx ve kontrol bl10 fareler 7 gün boyunca edu bir günlük enjeksiyonu ile pulse edildi, deney grupları 5,13 arasında statik analiz izin önceden bildirmiştir. Darbeli kalplerin immünohistolojik analizi edu (Şekil 3A) dahil olması kardiyomiyositlerde ifade PCM1 varlığını ortaya koymaktadır. Ancak, veri elde istimalEdu dahil diğer hücre tipleri kardiyomiyositlerde olarak misidentified edilebilir g immünohistolojik yöntemler, yanlış yorumlanabilir. Bunun bir örneği, Ek Şekil 1A ve B&#39;de gösterilmiştir. Ayrıca immünohistolojik yöntemler nükleer bölümünden poliploidleşmeyi ayrım yapmıyor. Bu protokol ayrıntılı sitometri analizi akış nedeniyle poliploidleşmeyi için edu dahil olan hücreleri hariç tutarak, mdx ve kontrol farelerde kardiyomyosit nükleer bölünme hızla miktarının sağlar. Daha önce yayımlanmış verilere 13 benzer şekilde, analiz yaş kıyasla mdx fare kalplerinde neo-kardiyomyosit çekirdekler nesil oranlarında bir artış ortaya denetimleri (Şekil 3B ve C% 0.17 karşı% 1.2) eşleşti. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> Şekil 3: </strong&gt; Edu Niceleme yabanitipte ve mdx kalplerinde kardiyomiyositlerde etiketli. Mdx kalplerin 40 mikron kalınlığında kesitler alınan Z-yığın projeksiyonlar (A) Görüntü. PCM-1 ifade kardiyomiyosit çekirdeklerinin Edu (kırmızı) yer vermiş (yeşil). Sarı ok Edu kardiyomiyositlerde etiketli gösterir. I ve II ayrı ayrı edu Z düzleminde gösterildiği kardiyomiyositlerde etiketli gösterir. (- C57 / BL10 arka plan üzerinde / y mdx) Çekirdekler DAPI (mavi) (B ve C) sitometri izole çekirdeklerin Flow 12-13 haftalık vahşi tip (C57 / BL10) ve mdx farelerden alınan temsili arsaları gösteren etiketli. (B) Histogram 2N ve&gt; 2N çekirdekleri arasındaki DAPI yoğunluğu ve ayrımcılık gösteren. Bu protokol ayrıntılı olarak analiz edildiğinde 2N kardiyomiyosit çekirdeklerinin popülasyonunda edu birleşmesini gösteren (C) Arsalar. Tüm fareler edu 1&#39;den 1 hafta uygulandıYaş 2 hafta. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Ek Şekil 1:. PCM-1 kardiyomiyosit çekirdeklerinin için özel bir işaretleyici protokolünü kullanarak çekirdekleri ROSA nT / nG CRE hassas muhabir hattı 16 ile TNT-CRE fareler 14 geçerek üretilen çift transgenik fare izole edildi nitelendirdi. Troponin (TNT) promoterinin kontrolü altında elde edilen, fare cre aktivasyonu çekirdekler lokalize olan GFP geri dönüşümsüz ekspresyonuna yol açar. Çekirdekler GFP ifade kardiyomiyosit çekirdeklerinin nüfusu (488/530/30-A) tanımlamak için yeteneği gösterir İzotip kontrolü (Iso) ile etiketlenmiş. Anti-PCM1 ile çekirdeklerin Etiketleme (tespit ikincil antikor 633-660 / A 20) GFP ifade cardiomyocy ile PCM1 ifade korelasyon göstermektedirte çekirdekler nüfus. TNT promotör aktivitesi ile tanımlanan, PCM1 antikoru ile etiketli kardiyomiyosit çekirdeklerinin bu örnekte 98.8% olarak. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">Ek Şekil 1 indirmek için tıklayınız.</a> Ek Şekil 2:. Immünohistolojik tekniklerle kardiyomiyosit yenilenmesini ölçülmesi için Zorluklar (A) 2D görüntü de edu (kırmızı) için etiketlenmiş gibi görünen iki PCM-1 ifade kardiyomiyosit çekirdekleri (yeşil) gösterir. Sarı oklar Edu dahil olması kardiyomiyositlerde gibi görünen gösterir. Bu durum PCM1 ifade ve Edu etiketleme 2-boyutlu görüntüleme kullanılarak görüntülendi belirgin ortak yerelleştirme etmektir. (B) bu görüntünün bir 3 boyutlu projeksiyon Edu hücreleri kardiyomiyositlerde değil, PC örten olmayan kardiyomiyosit hücrelerdir etiketli tanımlarM1 kardiyomiyosit çekirdekleri ifade. Deneylerde kullanılan yaş 12. haftada C57 / BL10 fareler. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">Ek Şekil 2A indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">Ek Şekil 2B indirmek için buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reaksiyon Bileşenleri </td><td colspan="2"> Reaksiyonların sayısını </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 ul </td><td> 2.19 mi </td></tr><tr><td> bakır koruyucu </td><td> 20 ul </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Floresan boya pikolil azid </td><td> 5 ul </td><td> 12.5 ul </td></tr><tr><td> Seyreltilmiş tepkime4.1 hazırlanan tampon </td><td> 100 ul </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> Toplam reaksiyon hacmi </td><td> 1 mi </td><td> 2.5 mi </td></tr></tbody></table> Tablo 2: edu kokteyl maddeler. Edu etiketleme kokteyl için reçete protokol bölüm 4 (Algılama edu esas) gerekli.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Görüntüleme.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Video: Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Genetik

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Tıp

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Assessing Cardiac Reprogramming using High Content Imaging Analysis

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a reprogramming technique. Cardiac reprogramming provides a strategy to generate new cardiomyocytes. By introducing core cardiogenic transcription factors into fibroblasts; fibroblasts can be converted to iCMs without transition through the pluripotent stem cell state. However, the conversion rate of fibroblasts to iCMs still remains low. Accordingly, there have been numerous additional approaches to enhance cardiac reprogramming efficiency. Most of these studies assessed cardiac reprogramming efficiency using flow cytometry, while at the same time performed immunocytochemistry to visualize iCMs. Thus, at least two separate sets of reprogramming experiments are required to demonstrate the success of iCM reprogramming. In contrast, automated high content imaging analysis will provide both quantification and qualification of iCM reprogramming with a relatively small number of cells. With this method, it is possible to directly assess the quantity and quality of iCMs with a single reprogramming experiment. This approach will be able to facilitate future cardiac reprogramming studies that require large-scale reprogramming experiments such as screening genetic or pharmacological factors for enhancing reprogramming efficiency. In addition, the application of high content imaging analysis protocol is not limited to cardiac reprogramming. It can be applied to reprogramming of other cell lineages as well as any immunostaining experiments which need both quantification and visualization of immunostained cells.

We present a protocol to quantify directly reprogrammed induced cardiomyocyte-like cells (iCMs) in vitro using high content imaging analysis. This method allows us to quantify the efficiency of cardiac reprogramming in an automated manner and to directly visualize iCMs.

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Biyoloji

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

Farelerde Hepatosit Nükleer Ploidi Tahmini için Yerinde Yüksek Throughput Yöntemi

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with small-animal models such as rodents. However, the physiology of the human heart differs significantly from that of the rodent heart, underscoring the need for clinically relevant models to study heart disease. Here, we present a protocol to model ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells (hiPS-CMs) and to quantify the damage and functional impairment of the ischemic cardiomyocytes. Exposure to 2% oxygen without glucose and serum increases the percentage of injured cells, which is indicated by staining of the nucleus with propidium iodide, and decreases cellular viability. These conditions also decrease the contractility of hiPS-CMs as confirmed by displacement vector field analysis of microscopic video images. This protocol may furthermore provide a convenient method for personalized drug screening by facilitating the use of hiPS cells from individual patients. Therefore, this model of ischemic heart disease, based on iPS-CMs of human origin, can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

We present a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells, together with a method for quantitative evaluation of tissue damage caused by ischemia. This model can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

HiPSC Türetilmiş Kardiyomiyosit Kullanarak İskemik Kalp Hastalığı Modeli ve Kardiyomiyosit Kontraksiyonunun Video Tabanlı Karşılaştırılması

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...