Name: highly sensitive assay for measurement of arenavirus-cell attachment
Uploaded: 2016-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment at JoVE.com

Biz hibe T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), ve P20RR021905 aracılığıyla bu çalışmaların destek için yararlı tartışmalar ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (JB) için Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce ve Benjamin Kral teşekkür .

Not: açıklanan protokol (pre-PCR laboratuvarı ve ne kadar iyi öncesi PCR tekniği kullanılarak deneyler kurmak için nasıl mükemmel bir bakış için 28 bakınız) sıkı öncesi PCR tekniği kullanılarak yapılmalıdır önemlidir. Tüm reaktifler ve ekipmanlar qPCR hedef sekansı içeren amplifiye DNA içermeyen ve uygun kontrol gibi kirlenmesini tespit etmek için bir yerde olması önemlidir. Protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. 1. 48-iyi Tabaklar Medya ve Tohum Hücreler hazırlayın <ol><li> 50 ml ilave etmek suretiyle,% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin içeren tam Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı içinde 500 ml (DMEM), ve% 1 HEPES (N-2-hidroksi-N-2-etan sülfonik asit) tampon çözeltisi hazırlayın Isı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 5 ml DMEM 500 ml&#39;lik bir şişe için 100x penisilin-streptomisin ve 100X HEPES tampon çözeltisi, her bir. Bu reaktif 4 ° C&#39;de saklanabilir76; ay bekletilmiştir. </li><li> Tam DMEM 500 ul nihai hacimde 48 oyuklu doku kültür plakasına oyuk başına tohum 2.5 x 10 4 Vero E6 hücreleri. 10 ila 18 saat boyunca% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe plakası. <ol><li> gün sonunda plaka Tohum. ya çoğaltmak veya üç kuyularda her virüs örneği test edin. Not: Bu deney için, 48-çukurlu tabanlı bir platform tarif edilmiş olmakla birlikte, 96 veya 384 oyuklu plakalarda aşağı kullanılır tahlili büyütülebilir mümkün olmalıdır. </li></ol></li></ol> 2. Virüs-hücre Ek Yürüten Not: Bu protokolde kullanılan virüs JUNV soyu, makaleler, 1. (Cı # 1), başarılı bir şekilde JUNV hastalığının 29 önlenmesi için bir canlı zayıflatılmış bir aşı olarak kullanılmaktadır. JUNV Cı 1. in vivo ve in vitro olarak, her iki seri geçiş ile virülan JUNV streyn XJ türetilen 12 amino asit 30 ebeveyn XJ suşundan farklı edildi. because JUNV C # 1 biyogüvenlik düzeyi (BSL) -2-puan patojendir, bu bölüm için açıklanan çalışma, uygun BSL-2 uygulamaları 31 kullanılarak yapılmalıdır. Bu kişisel koruyucu ekipman (örneğin, göz koruma, laboratuvar mont, çift eldiven), bir sınıf II biyogüvenlik kabini kullanımını içerir ve tüm personelin kurumsal eğitim ve güvenle bu organizmayı işlemek için gerekli onayları aldık sağlamak. <ol><li> İstenen pfus test edilecek JUNV C # 1 örnek (ler) seyreltin veya buz gibi soğuk komple DMEM oluşturan birimler odak ve her kuyuya eklemek için hazır olana kadar buz üzerinde saklayın. Not: Tüm DMEM içinde seyreltilmiş virüs bağlama çalışmaları yapmak için alternatif bir serum virüsü eki ile girişime neden olup olmadığını belirlemek için, düşük serum konsantrasyonu (% 2) ve uygun bir tampon maddesi ile PBS içeren bir minimal ortamda kullanmak gibi. Alternatif virüsler benzer bağlanma protokolleri bicarbo olmayan RPMI 1640 ortam maddesinin kullanımını bildirmiştir% 0.2 sığır serum albümini, 10 mM (2- (morfolino) etansülfonik asit) ihtiva eden Nate, ve 10 mM HEPES, pH 6.8 32. Bu bağlanma ortamı ortam kuluçka CO2-çevre çıkarıldığında ortaya çıkabilir, pH değişiklikleri önlemek için üstün olabilir. <ol><li> nonprodüktif eki olayları sınırlamak için 200 2,000 arasında değişen pfus ile kuyu inoküle edin. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, bu deney kadar az 20&#39;ye PFU (veya en çok 6 10 x 2 PFU) ile ek saptayabilir. </li><li> hücreleri üzerine aşılama için virüs ana karışımı oluşturun. Her bir virüs örneği göz başına 50 ul hacim içinde suret kuyu üzerine inoküle edilir. oyuk başına virüs 2.000 pfus eklenmesi isteniyorsa, bu nedenle, DMEM tam soğuk buz 120 ul toplam hacmine 4800 pfus seyreltin. <ol><li> testin özelliğini kontrol etmek için, her iki TfR1 (TRVb) veya EXP ifade yoktur Çin hamsteri yumurtalık hücresi hatları eşleşen bir çift kullanımıbu hücrelere JUNV eki olarak Arş hTfR1 (TRVb-1) düşük ya da sırasıyla 13,33 olmalıdır, ya. Alternatif olarak, arenavirüs eki 34 veya girişi 35 engellemek için böyle proteinaz K gibi bir proteaz hücreleri davranın. Hücrelerle 13,36 içine JUNV girişini engellemek için bilindiği gibi hTfR1 için spesifik olan çözünür hTfR1 ya monocolonal antikor ch128.1, aynı zamanda kabul edilebilir. Ayrıca, serbest manoz 14 veya JUNV spesifik nötralize edici antikorlar 37 partikül inkübasyon hücrelerin ön-muamele virüs girişi inhibe edebilir. </li><li> Bu olası bir açıklama olmasına rağmen JUNV girişini engelleme rağmen bu son reaktifler ve yaklaşımlar, eki engellemek için teyit edilmemiş olması, ancak unutmayın. Burada açıklanan protokol resmen bu çeşitli yaklaşımlar darbe virion eki olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. </li></ol></li></ol></li><li> 37 ° C inkübatör plakaları çıkarın veyer ya da 4 ° C buzdolabı ya da 15 dakika endositoz gerçekleştirmek için kaplama hücrelerinin yeteneğini inhibe etmek için buz üzerinde. </li><li> Daha sonra, her bir gözden bitmiş DMEM aspire hızla buz soğukluğunda PBS (fosfat tamponlu tuz), pH 7.4, 100 ul kullanılarak iki kez her bir yıkama. Daha sonra uygun oyuklara (adım 2.1 hazırlanmış) öncesi seyreltilmiş virüs örneklerinin 50 ul ekleyin. </li><li> plastik wrap plaka sarın ve hemen geri buz üzerinde veya virüs eki meydana gelmesine izin için 1 saat 1.5 için bir 4 ° C buzdolabında ya yerleştirin. Bu adımı boyunca, 4 ° C&#39;de soğuk plaka tutun yıkama tamponu ve virüs örnekleri. </li><li> 4 ° C&#39;de inkübasyonun tamamlanmasından sonra, virüs inokulum aspirat ve buz soğukluğunda PBS 200 ul her bir göze 3 kez yıkayın. </li></ol> 3. Viral RNA Ekstraksiyon <ol><li> (Örneğin, RNeasy Mini kiti) Accor ticari kit kullanılarak JUNV C # mono tabakaları bağlı 1 parçacıkların viral RNA arındırmaküreticinin protokolüne ding. Özellikle, aşağıda listelenen değişikliklerle RNeasy Mini El Kitabı&#39;nda sayfa 23-28 (4. Baskı, Nisan 2006) üzerine &quot;spin teknolojisi protokolünü kullanarak hayvan hücrelerinden toplam RNA&#39;nın saflaştırılması&quot; izleyin. <ol><li> Lyse her kuyuya doğrudan lizis tamponu RLT 350 ul ekleyerek adım 1B belirtildiği gibi hücreler. Hücre lizizi sağlamak için bir tampon birkaç kez karıştırılır. hücreleri kolayca bu tamponda parçalanmayabilir ve tam lizis ters mikroskop altında kuyu görüntüleyerek kontrol edilebilir unutmayın. </li><li> Kit kolonu (adım 3a) elde edilen hücre lizatının aktarın ve açıklandığı gibi protokol kalanını izleyin. protokol kalan adımları sınıf II biyo-güvenlik kabininin dışında yapılan kiti borular bulaşıcı bir virüs ile kontamine değil sağlanabilir, böylece, bu noktada, virüs lizis tamponu ile nötralize edilmiştir. </li><li> Bir addit olan üreticinin protokolüne gelen isteğe bağlı adım 9 DahilSpin sütunun ional santrifüj Tampon RPE olası taşınmasını ortadan kaldırmak için. </li><li> Son adımda üreticinin protokolü (adım 10), nükleaz içermeyen GKD 2 O. 30 ul kullanarak spin kolon saflaştırılmış RNA Zehir Mağaza bu noktada 80 ° C&#39;de RNA veya QRT-PCR deneyinde doğrudan kullanımı. nükleazlar tarafından saflaştırılmış viral RNA örnekleri bozulmasını önlemek için, nükleaz içermeyen reaktifler ve ekipman kullanımı ve buz üzerinde eritildi RNA örnekleri tutun. Not: Tamponlar RLT ve RW1 guanidin tuzu içeren ve ağartıcı ile karıştırılmamalıdır. Tampon RW1 etanol içerir. </li></ol></li></ol> Viral genomunun 4. QRT-PCR Ölçümü <ol><li> daha sonra qPCR cDNA&#39;ya JUNV Cı 1. S kademeli bir RNA dönüştürmek için 50 ul bir toplam hacim içinde oda sıcaklığına (adım 3.1.4 üretilen), viral RNA tabi. <ol><li> nuclease 6.75 ul: RT reaksiyonu kurmak için, öncelikle reaksiyon başına aşağıdaki reaktiflerin her içeren bir master karışımı oluşturmakiçermeyen GKD 2, O, RT primer G 2 uM stokunun 5 ul 2098- 2075- S kademeli bir genomik RNA&#39;nın NP bölgesi, 5 ul bir tamamlayıcı olan (5&#39;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 &#39;), 10X PCR tampon II, 25 mM MgCl2 çözeltisi 11 ul RT enziminin, RNaz inhibitörü 1 ul (0.4 ünite), 1.25 ul (62.5 Birimleri) ve dNTP 500 uM stokunun 10 ul. Not: arenavirüs replikasyon esnasında, 4, viral S kademeli bir RNA türlerinin oluşturulur: tam boy bir genomik RNA (vRNA), tam uzunluklu antigenomik RNA (vcRNA) (diğer bir deyişle vRNA ters tamamlayıcı olan) ve iki alt-genomik mRNA sırasıyla PN ve GP genlerini kodlayan. Burada yer alan RT primeri sadece S segmenti vRNA için spesifik olan, ancak vcRNA NP mRNA veya GP mRNA. </li><li> Yavaşça RT ana karışımı karıştırın ve daha sonra tek tek 0.2 ml PCR tüplerine 40 ul bölmeyin. Her tüpe, viral RNA 10 ul ekle. Dahil i) hiçbir şablon kontrol tüpü (örn. Nükleaz içermeyen GKD 2 O 40 ana karışımı uL) ve ii) herhangi bir RT enzim karşılaştırma 10 ul (örneğin almadı ana karışımı 40 ul, bilinen bir pozitif viral RNA numunesinin 10 ul ekle bir RT enzim), viral bir hedef sekansı içeren amplifiye DNA RT reaktiflerin kirlenme taranması için. hücresel RNA mevcudiyetinde deney özgüllük için kontrol tamamına RT ana karışımı ile enfekte olmamış hücrelerden çıkarılan RNA içerir. </li><li> Buna ek olarak, RT reaktiflerin kalitesini doğrulamak için tam ana karışımı bilinen pozitif viral RNA örnek sayılabilir. gerektiğinde RT reaksiyon hacmi 25 ul indirgenebilir unutmayın. </li></ol></li><li> Aşağıdaki bisiklet koşulları RT tüpler Konu: 25 ° C, 10 dakika, 30 dakika boyunca 48 ° C, 5 dakika için 95 ° C. Numuneler 4 ° C&#39;de adım eklenmesi ile bu noktada -20 ° C&#39;de saklandı veya PCR gece boyunca bırakılabilir unutmayın. </li><li> P25 ul bir toplam hacimde erform qPCR. <ol><li> Aşağıdaki birleştirerek bir qPCR ana karışımı yapmak: her S1937 + 1958+ ileri PCR primeri (5&#39;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 &#39;) (9 uM stoklar) 2.5 ul ve ters PCR primeri G 2001 için 1982 (5 için qPCR prob S 1960+ arasında &#39;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&#39;), 2 uM stokunun 2.5 ul () 1975+ (5&#39;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 &#39;) ve 2X genel qPCR ana 12.5 ul karıştırın. JUNV C # 1 için spesifik burada bildirilen ileri primer, nt öldürücü JUNV zorlanma Romero hedef başlangıçta bildirilen primer dizisinin 38 dan 1 ile farklı olduğunu unutmayın. </li><li> Yavaşça çözüm karıştırmak ve sonra her bir qPCR 20 ul ekleyin. Uygun QPCR çukurlara, her bir RT reaksiyonu 5 ul ekle. Test edilen her bir numune için üç kopya halinde qPCR yürütün. Gerekirse PCR reaksiyon hacmi az 12.5 olduğu ul indirgenebilir unutmayın. Not: ile bağlantılı yazılımqPCR makinesi QPCR primer hedef JUNV Cı 1. NP genini kodlayan plasmid standart seyreltilmiş bir dizi her bilinmeyen numune değerinin karşılaştırılmasıyla JUNV Cı 1. S kademeli bir genomik RNA&#39;nın mutlak kopya sayıları üretir ve sonda ayarlayın. qPCR testi sadece standart eğri aralığı içinde değerleri kantitatif sağlayabilir. 5, 50 x 10 3 5, 5 x 10 5, 5 x 10 7 adet çukur başına Bu nedenle, aşağıdaki gibidir (üçlü kuyucuklara) plazmidinin miktarlarını içerir. </li></ol></li><li> ısıl olarak qPCR plaka yükleme ve aşağıdaki reaksiyon koşulları çalıştırın: 95 ° C, 10 dakika, 15 saniye, 1 dakika için 60 ° C, 95 ° C, 40 çevrim için. <ol><li> Toplama ve üreticinin protokolüne uygun olarak, her numune viral RNA mevcut miktarını belirlemek için veri analizi. </li></ol></li><li> qPCR katran ihtiva eden plazmit, bir yeni saflaştınldı numune kullanılarak bir standart eğri oluşturmak içindizisi olsun, öncelikle bu çözelti içinde plazmid kopya sayısını belirlemek. <ol><li> plazmidin moleküler ağırlığı hesaplamak. Tüm plazmidin dizisi biliniyorsa, aşağıdaki formülü kullanarak bu hesaplayın: MW = ([A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61,13). çift ​​sarmallı plazmid her iplikçik üzerinde bulunan belirli bir nükleotid toplam sayısını eklemeyi unutmayın. </li><li> plazmid büyüklüğü bilinen ama onun tam sırası değil ise, her dsDNA baz çifti 600 MW vardır varsayımı altında MW hesaplayın. Not: Burada kullanılan pCAGGS-JUNV C # 1 NP plazmid 4.2 x 10 6 Bir MW vardır. </li><li> plazmidin MW belirlendikten sonra, ul başına çok sayıda kopya plazmid hazır çözelti içinde mevcut olduğunu hesaplayabilir. </li><li> İlk çözelti içinde plazmid toplam ug hesaplamak, daha sonra plazmid mol bu dönüştürmek (plazmid 69 mikrogram daha sonra su 300 ul, 6,9 x 1 içerdiği, örneğin eğerKopya sayısı dönüştürülebilir plazmid * 1 mol 0 5 g / plazmid 4.2 x 10 6 g = plazmid 1.6 x 10 -11 mol), (örneğin, plazmid 1.6 x 10 -11 mol * 6,022 x, 10&#39;dan 23 moleküller / mol = 9.8 x 10 12 molekülleri (veya kopya)). </li><li> Ul başına kopya elde etmek için bu çözeltinin hacimce plazmid çözeltisi plazmidin toplam kopyalarını bölün (örneğin 9.8 x 10 12 kopya / 300 ul = 3.28 x 10 10 kopya). </li><li> 5 ul hacim standart eğri oluşturmak için gerekli kopyalama sayı aralığı sağlamak için PCR plakasına yerleştirilir, böylece uygun bir şekilde, bu solüsyon ile seyreltilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Arenaviridae. , 331-373 (1993).</li><li>Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+reservoirs+of+arenaviruses.">Mammalian reservoirs of arenaviruses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).</li><li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+50.">Ch. 50.</a> Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).</li><li>Parodi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sobre+la+etiologia+del+brote+epidemico+de+Junin+(Nota+previa).">Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa).</a> Dia Medico. 30, (1958).</li><li>Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lassa+fever,+a+new+virus+disease+of+man+from+West+Africa.+I.+Clinical+description+and+pathological+findings.">Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).</li><li>Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).</li><li>Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+emerging+fetal+teratogen.">Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).</li><li>Fischer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation.">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).</li><li>Palacios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases.">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).</li><li>Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenaviruses:+genomic+RNAs,+transcription,+and+replication.">Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).</li><li>Meyer, B. J., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+heterogeneity+in+the+termini+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+genomic+and+antigenomic+RNAs.">Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs.</a> J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10, e0120043 (2015).</li><li>Radoshitzky, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+receptor+1+is+a+cellular+receptor+for+New+World+haemorrhagic+fever+arenaviruses.">Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses.</a> Nature. 446, 92-96 (2007).</li><li>Martinez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+human+DC-SIGN+and+L-SIGN+for+entry+and+infection+of+host+cells+by+the+New+World+arenavirus,+Junin+virus.">Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).</li><li>Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Junin+arenavirus+cell+entry.">Characterization of Junin arenavirus cell entry.</a> J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).</li><li>Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+cellular+proteins+in+Junin+arenavirus+entry.">Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry.</a> Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).</li><li>Nunberg, J. H., York, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Curious+Case+of+Arenavirus+Entry,+and+Its+Inhibition.">The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition.</a> Viruses. 4, 83-101 (2012).</li><li>Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).</li><li>Klaus, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+cargo+receptor+ERGIC-53+is+required+for+the+production+of+infectious+arenavirus,+coronavirus,+and+filovirus+particles.">The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles.</a> Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).</li><li>Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+entry+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus.">Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).</li><li>Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+screen+for+genes+that+affect+Junin+virus+entry+uncovers+voltage-gated+calcium+channels+as+a+therapeutic+target.">siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target.</a> Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).</li><li>Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+superinfection+of+Vero+cells+persistently+infected+with+Junin+virus.">Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus.</a> Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).</li><li>Brandenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+poliovirus+entry+in+live+cells.">Imaging poliovirus entry in live cells.</a> PLoS Biol. 5, e183 (2007).</li><li>Petersen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Major+Cellular+Sterol+Regulatory+Pathway+Is+Required+for+Andes+Virus+Infection.">The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection.</a> PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+studies+of+virus+interaction+at+the+host+cell+surface+using+enteroviruses+and+real-time+PCR.">A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR.</a> Virol J. 6, 217 (2009).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+attachment+mediated+by+apolipoprotein+E+binding+to+cell+surface+heparan+sulfate.">Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate.</a> J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).</li><li>Shannon-Lowe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus-induced+B-cell+transformation:+quantitating+events+from+virus+binding+to+cell+outgrowth.">Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth.</a> J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).</li><li>Mifflin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+up+a+PCR+laboratory.">Setting up a PCR laboratory.</a> CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).</li><li>Maiztegui, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+live+attenuated+vaccine+against+Argentine+hemorrhagic+fever.+AHF+Study+Group.">Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group.</a> J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).</li><li>Goni, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+attenuated+Junin+virus+vaccine+strain+candidate.">Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate.</a> Virus Genes. 32, 37-41 (2006).</li><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).</li><li>White, J., Matlin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fusion+by+Semliki+Forest,+influenza,+and+vesicular+stomatitis+viruses.">Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses.</a> J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).</li><li>McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+human+transferrin+receptor+cDNA+in+Chinese+hamster+ovary+cells+deficient+in+endogenous+transferrin+receptor.">Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor.</a> J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).</li><li>Borrow, P., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-binding+protein(s):+a+candidate+cellular+receptor+for+the+virus.">Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus.</a> J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).</li><li>Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cellular+receptors+for+the+South+American+hemorrhagic+fever+viruses+Junin,+Guanarito,+and+Machupo.">Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo.</a> 346. , 476-491 (2006).</li><li>Helguera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+recognizing+the+apical+domain+of+human+transferrin+receptor+1+efficiently+inhibits+the+entry+of+all+new+world+hemorrhagic+Fever+arenaviruses.">An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses.</a> J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).</li><li>Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+monoclonal+antibodies:+characterization+and+cross-reactivity+with+other+arenaviruses.">Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses.</a> J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Helenius, A., Marsh, M., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Semliki+forest+virus+penetration+by+lysosomotropic+weak+bases.">Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases.</a> J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).</li><li>Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion+and+nucleocapsid+delivery+into+the+cytoplasm+are+distinct+events+in+some+flaviviruses.">Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses.</a> PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

biz tarif protokol basittir ve sağlam aşağıdaki kritik hususlar görülmektedir sağladı. İlk olarak, sıkı öncesi PCR tekniği (mükemmel bir inceleme için 28 bakınız) istihdam edilmelidir. Tüm reaktifler ve ekipmanlar qPCR hedef sekansı içeren amplifiye DNA içermeyen ve uygun kontrol gibi kirlenmesini tespit etmek için bir yerde olması önemlidir. İkinci olarak, iletişim kuralı, virüs, hücreler ve ortamın virüs-hücre bağlanma bölümü için yüzeyine bağlı viryonlann endositoz ?...

Arenaviruses doğada 1-3, kemirgenlerde esas korunur saran, tek iplikçikli RNA virüslerinden oluşan bir ailesidir. Bu virüsler genellikle kemirgen rezervuarların 1,2 asemptomatik, kalıcı enfeksiyon kurmak olsa da, insanlarda 3 şiddetli hastalığa neden olabilir. Önemli patojenik türler Yeni Dünya Junin virüsü (JUNV) 4 ve Afrika&#39;da Güney Amerika ve Lassa ateş Arjantin hemorajik ateş etiyolojik ajanları sırasıyla, Old World Lassa virüsü 5 içerir. Lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV), ailenin 6 prototipik virüs, dünya çapında bir dağılımına sahiptir ve bağışıklık sistemi baskılanmış olarak immün sistemi sağlıklı bireylerde 6 aseptik menenjit, gelişmekte olan fetusta 7 ciddi doğum kusurlarına veya yüksek öldürücülüğü dahil hastalık durumlarında çeşitli sorumludur solid organ transplantasyonu 8,9 aşağıdaki bireyler. Amerika Birleşik Devletleri eksikliğiGıda ve İlaç İdaresi (FDA) aşılar ya da bu virüs ile mücadele için etkili antiviral tedavi, ortaya çıkan bu / yeniden ortaya çıkan patojenleri hedef yeni stratejiler geliştirmek için kritik ihtiyacının altını çizmektedir -onaylı. Arenavirüs genomu iki tek-şeritli RNA segmenti, büyük (L) (~ 7.2 kb) ile küçük (S), (~ 3.6 kb) segmentleri 10 oluşur. L kademeli bir viral polimeraz (L) ve matris protein (Z) kodlar ise S kademeli bir virüs nükleoprotein (NP) ve zarf glikoproteini (GP) kodlar. L ve S genomik RNA segmenti (vRNAs) virionlar 10-12 içinde ambalajlandı. Arenavirüs enfeksiyonun başlangıç ​​aşaması, viral parçacıkların ek JUNV için, insan transferin reseptörü 1 (hTfR1) 13,14 içerir viral GP ve karşılık gelen konakçı hücre reseptörleri arasındaki bir etkileşim yoluyla konakçı hücreler sağlamaktır. Bağlanmasının ardından, JUNV parçacıklar klatrin dolayımlı endositoz 15 ile hücre içine alınır.Parçacıklar bu bölmenin düşük pH GP 16,17 aktivasyonunu tetikler geç Endozom sonra trafik. Bir kez viral ve endozomal membranların arasındaki kaynaşmayı başlatarak, GP-kodlanmış füzyon peptid ekler endozomal zarı içine, aktif. Onlar genomik replikasyon ve transkripsiyon için şablon olarak hizmet sitoplazma içine viryon paketlenmiş vRNAs serbest bırakılması Başarılı füzyon sonuçları. Viral yapısal proteinler ve vRNAs yeterli miktarda üretilir, yeni parçacıkların araya ve enfekte olmuş hücreden tomurcuk ömrü 18 tamamlayın. terapötik patojenik arenaviruses hedeflenecek yeni stratejilerin keşfini kolaylaştırmak için, bizim grup ev sahibi için virüs yayılımı için kritik, ama vazgeçilebilir olan konak faktörlerinin belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Bu bağlamda, bu gibi konakçı faktör ile kontrol virüs ömrü çevrimi kesin aşama (lar) tanımlayan kılavuz için gerekli olanAntiviral stratejilerin geliştirilmesi. Burada, seçilen konakçı proteinleri ve / veya antiviral moleküller viral giriş 19, bu ilk aşamasına etkileyen olmadığının belirlenmesi amacıyla, arenavirüs hücre eki ölçmek için kullanılabilecek bir miktar (Q), RT-PCR bazlı analiz tarif eder. Arenavirüs hücre eki ölçmek için alternatif yaklaşımlar biyotin 20, floresan boyalar 21 veya radyoaktif izotoplar 22 ile etiketlenmiş virionlar özellikli var. Bu yöntemlere dezavantajları, giriş virüsünün büyük miktarlarda radyoaktivite kullanımı (enfeksiyon (MOI) arasında örneğin yüksek çokluklar), ve / veya girdi virüs (örneğin, konsantrasyon ve / veya virüs etiketleme) hazırlanması için ek işleme adımları için gereksinimi içerebilir . Özellikle, yüksek İçişleri kullanımı zor nonprodüktif eki olayları 15,23 karşı üretken ayırt etmek yapar. Burada anlatılan QRT-PCR tabanlı tahlil kadar az 20 olarak plaket kullanılarak eki olaylarını algılayabilirMing birimleri, 48-delikli plaka için 0.0004 MOI anlamına virüs (pfus). Bu nedenle, tahlil güçlü duyarlılığı yüksek İçişleri Bakanlığı için gereksinimi yanı sıra herhangi bir virüs etiketleme ya da konsantrasyon adımları üstesinden gelir. Bundan başka, deney I) viryon endositozu ölçmek hem de sitoplazmaya virüs genomunun serbest bırakılması gibi füzyon şu şekilde uyarlanmış ii) örnekleri için virüs özel QRT-PCR geliştirilmesi yoluyla diğer virüsler ile kullanım için (özel olabilir, bkz 24-27).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>100x</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>100x</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>1x</td></tr><tr><td>Vero E6 cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well plate</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>do not mix buffers RLT or&amp;nbsp; RW1 with bleach</td></tr><tr><td>QIAshredder homogenizer</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/&amp;micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>4311235</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0260</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0010</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor (5000U/100 &amp;micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0119</td><td></td></tr><tr><td>RT primer 5&amp;rsquo;-AAGGGTTTAAAAAT&lt;br/&gt;GGTAGCAGAC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>250 nmol DNA oligo</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>Forward qPCR primer&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>Reverse qPCR primer 5&amp;rsquo;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>TaqMan Probe 5&amp;rsquo;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4316033</td><td>HPLC purified</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL)</td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4376598</td><td>or other qPCR instrument</td></tr></tbody></table>

highly sensitive assay for measurement of arenavirus-cell attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

Protokol bölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi qPCR tahlilin hassasiyetini ve dinamik aralığını göstermek için, JUNV Cı 1. (aralık 5-5 x 10 7 kopya) NP genini kodlayan bir plazmid bilinen miktarlarda qPCR tabi tutuldu. Deney hassastır ve güvenilir bir şekilde, hedef nükleik asidin 5 kopya (Şekil 2) gibi birkaç algılayabilir. Şablonun en az 7 günlükleri kapsayabilir, Şekil 2&#39;de de gösterildiği gibi, tahlilin dinamik ara...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment at JoVE.com

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

highly-sensitive-assay-for-measurement-of-arenavirus-cell-attachment

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Görüntüleme.  University of Vermont. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Video: Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Biyoloji

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

Source: Tai, C., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows assessment of the impact of the test compound on viral envelope fusion with endosomes.

Test Bileşiklerinin Konakçı Hücrelerde Viral Giriş ve Füzyon Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir Test

Note: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Özelleşmiş Analizleri

Cell-Based AAV Neutralizing Antibody Assay: A Colorimetric Technique to Detect Neutralizing Antibodies Against Specific Adeno-Associated Viruses in Serum

Start plating HT1080 cells on day one by diluting the cells to a concentration of 1 x 105 cells/mL in pre-warmed complete DMEM media.
Then, seed 100 microliters of cells, per well, into clear 96-well flat-bottomed plates to the concentration of 1 x 104 cells per well. Incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide overnight for 16 to 22 hours.
On day two, generate serial dilutions of the serum samples of interest in 1.5-milliliter microcentrifuge tubes using pre-warmed complete DMEM.
To each tube with diluted serum samples, add 66 microliters of the 7.5 x 106 viral genome per microliter virus working solution. Mix the virus/serum dilutions by pipetting, and then, place the tubes containing the virus/serum mixtures in an incubator at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide for 30 minutes, to allow potential neutralization to occur.
After 30 minutes, pipette 100 microliters of the virus/serum mixture to each well on the 96-well plate containing 1 x 104 cells per well, then, wrap the plate in a foil to place in an incubator at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide overnight for 16 to 24 hours.
On day three, aspirate the media from the wells of the 96-well plate using a fume hood vacuum without disrupting the adhered cells, and add 50 microliters of 4% paraformaldehyde to each well. After wrapping the plate in foil, leave it for 10 minutes at room temperature.
Later, wash and aspirate the cells twice with 200 microliters of PBS at room temperature. After the second wash, pipette 200 microliters of pre-warmed PBS into each well, and wrap the plate in foil followed by incubation at 65 degrees Celsius for 90 minutes to denature endogenous alkaline phosphatase activity.
Following incubation, add 50 microliters of the freshly prepared, dissolved BCIP/NBT into each well, and incubate the wrapped plates at room temperature for 2 to 24 hours. Later, take photos of each well using a 4x objective lens in a light microscope camera, ensuring the consistent use of the same exposure, white balancing, and light settings for all assays.

Hücre Bazlı AAV Nötralize Edici Antikor Testi: Serumda Spesifik Adeno İlişkili Virüslere Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Kolorimetrik Bir Teknik