Bu çalışma SST İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_135278) bir hibe ile desteklenmiştir. MOP AXA Araştırma Fonu doktora hibe faydalanıcısı olduğu. Biz Şekil 1 tasarımı ile yardım için Patricia Nigg teşekkür ederiz.

Önce başlangıç ​​Not: Kullanım laminer akış kaput ve uygun biyolojik tecrit canlı virüs ile çalışırken. Burada, kültür, influenza virüs suşu A / WSN / 33 uygun büyüme koşulları açıklar. Enfeksiyon (MOI) ve inkübasyon süreleri, kullanılan virüs suşu bağlı olarak değişebilir. Biyotinilat A / WSN / 33 Virüs 1. Hazırlık <ol><li> Tohum Madin-Darby köpek kindey (MDCK),% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (pen / strep) ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) kullanılarak T175 cm 2 şişe içine hücreleri. Yaklaşık% 70 konflüansa kadar 37 ° C &#39;de kültür hücreleri ulaşılır. </li><li> Enfeksiyon öncesinde, orta çıkarın ve hücre tekli tabakası kapak için yeterince büyük bir hacim ilave edilerek, fosfat tamponlu salin (PBS, pH7.0-7.3) hücreleri yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve 10 -4 bir İçişleri Bakanlığı ile A / WSN / 33 ile hücreleri enfekte. PBS virüs seyreltin 0.02 mg Mg 2+, 0.01 mg Ca 2 + &lt;ile desteklenmiş/ sup&gt;,% 0.3 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve% 1 Pen / Strep (enfeksiyon PBS). Bir T175 cm2 şişe için 4 ml bir inokulum kullanın. </li><li> Hücreler, 37 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. Şişe içine% 0.3 BSA, 20 mM HEPES,% 1 Pen / Strep ile takviye edilmiş aspirasyon ve pipet 10 ml DMEM ile inokulum çıkarın. </li><li> Daha sonra, hasat süpernatan görülebilir ve sitopatik etki (CPE) kadar yaklaşık 3 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. CPE dekolmanı ve hücrelerin 14 ölümü ardından hücrelerin yuvarlama olarak kabul edilebilir. </li><li> Hücre debrisini uzaklaştırmak için 5 dakika süreyle 450 x g&#39;de süpernatan dönerler. Yeni şahin tüp içine süpernatant aktarın ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Pelet atın. </li><li> Ultrasantrifüj tüpleri ve NTE tampon maddesi (10 mM Tris [pH 7.4], 100 mM NaCI, 1 mM EDTA) içinde seyreltildi,% 30 sukroz, 5 ml örtü süpernatantlarma Aktarım süpernatanlar. Ultrasantrifügasyon önce tüpleri Denge ve 30 ml&#39;lik bir son hacmi ulaşmak için PBS ile doldurun. Spin Superna112.398 x g&#39;de tants bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika boyunca (bir SVV28 rotor 25.000 rpm&#39;de karşılık gelir). </li><li> Dikkatle pipetleme tarafından süpernatant kaldırmak ve 250 ul PBS içinde 4 ° C&#39;de gece boyunca virüs pelet ıslatın. Yukarı ve aşağı pipetleme süspanse edin pelet. Bradford tahlili 15 ile arıtılmış, virüs protein içeriğini ölçmek. </li><li> Biyotinlenmiş A / WSN / 33 oluşturmak için bir biyotinilasyon kiti kullanın. Üreticinin talimatları uygulayın. </li><li> Kısaca, saflaştırılmış virüs biyotin uygun miktarda ve buz üzerinde 2 saat boyunca inkübe edilir. Ultrasantrifüj işlemi tüp virüs aktarın ve 30 ml&#39;lik bir son hacme ulaşmak için PBS ile tüp doldurun. Bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika 112.389 xg&#39;de virüsü Spin. Pipetleme süpernatant kaldırmak ve 250 ul PBS ekleyin. 4 ° C&#39;de gece boyunca pelet bekletin. Kısım en az 24 ay süreyle stabil olacak -80 ° C&#39;de saklandı Biyotinile edilmiş virüs depolamak ve. NOT: biyotinlenmiş p titresi belirlemek için yararlı olabilirStandart plak yöntemi ile IAV onarımı. Bununla birlikte, daha sonraki protokolü sadece biyotinlenmiş virüs partikülleri ölçecek dikkat edilmelidir. Nedeniyle eksik biyotinilasyon için biyotinile edilmemiş parçacıklar Kalan plak deneyi ile değil, ek / içselleştirme tahlilinde ölçülen sinyalin bulaşıcı titresi katkıda bulunacaktır. </li></ol> 2. Biyotinile Virüs Gerekli miktarı belirleyin Not: bağlanma / içselleştirme deney gerçekleştirilmeden önce, bir numunenin tüm hücreleri enfekte etmek için gerekli olan biyotinlenmiş virüs miktarını belirlemek için önemlidir. <ol><li> Kültür ve üreticinin talimatlarına göre trypsinize A549 hücreleri. Hücre bölme kullanarak hücreleri sayın. FACS içine Pipet 200.000 A549 hücreleri tüpler derin bölmeli. Spin 450 x g&#39;de 3 dakika. 200 ul PBS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Serin hücreleri, buz üzerinde 10 dakika karıştırıldı. </li><li> Bioti 5-kat seri dilüsyonları hazırlayınEnfeksiyon-PBS içinde nylated virüs stoku. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de hücreleri içeren Spin tüpler. 100 ul virüs içeren enfeksiyon PBS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Biyotinlenmiş virüs olmadan sahte kontrolü kullanımı enfeksiyon PBS gibi. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Tespit için 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj tüpleri. % 3.7 paraformaldehid (PFA) 100 ul süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 2.4 açıklanan yıkama adımı) tekrarlayın. </li><li> Geçirgenliği için, 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj tüpleri. % 0.5 Triton X-100 ihtiva eden 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve süpernatan pelet çıkarın. Oda sıcaklığında 6 dakika süreyle inkübe edilir. Ardından, 2.4 açıklanan yıkama adımı) tekrarlayın. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. Supernatant ve tekrar süspansiyon pell kaldırPBS STV- Cy3 ihtiva eden seyreltilmiş 50 ul% 2 BSA et. (Lütfen dikkat, STV-Cy3 uygun konsantrasyonu deney başlamadan önce belirlenmelidir 1 konsantrasyonunda ile başlayın. Kat 2 dilüsyonları kadar 1 200 ve test. 2400 Bizim ellerde, 1 bir seyreltme: kanıtladı 1000 optimal olduğu). </li><li> Oda sıcaklığında, karanlıkta 1 saat inkübe edin. Daha sonra, tekrar yıkama aşaması 2.4&#39;te açıklandığı gibi, ama PBS içinde seyreltilmiş 200 ul% 2 BSA pelletini. </li><li> 16 flow sitometri örnekleri analiz edin. Cy3-pozitif nüfus Kapısı. A549 popülasyonda Cy3-pozitif hücrelerin maksimum sayıda yol biyotinlenmiş virüsün düşük konsantrasyonu yapın. </li></ol> 3. Streptavidin Gerekli miktarı belirleyin Not: Hücre dışı virüs gelen sinyalin bloke verimi deneyinin bir algılama aralığı belirler. Bu nedenle, mümkün olduğunca STV- Cy3 sinyali ortadan kaldırmak için önemlidir. ThSTV gerekli miktarda gerekli e (bölüm 2 belirlenen) kullanılan biyotinlenmiş virüs stokunun miktarına bağlıdır. <ol><li> Adımları 2,1-2,4 izleyin ancak 2. bölümünde belirlenen virüs konsantrasyonu kullanın. </li><li> PBS,% 2 BSA ve% 0.1 sodyum azit içeren içerisinde seyreltilmiş STV beş kat seri dilüsyonları hazırlayın. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. 50 ul STV seyreltme süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Sahte kontrolü kullanımı gibi PBS STV olmadan% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren. Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. Ardından, tekrar yıkama adımı 2.4 tarif. </li><li> Adımlar 2.5-2.9 izleyin. Içselleştirme tahlil için, (herhangi bir STV da bulunduğu numune ile karşılaştırıldığında), Cy3-sinyali güçlü bir blok elde STV en düşük konsantrasyonunu belirleyin. Bunun için, CY3-pozitif hücreleri veya Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu yüzdesi kullanılabilir. İdeal olarak, STV ile tedavi numunelerin Cy3 sinyali mock-enfekte gelen sinyale kadar yakın olmalıdırmümkün olduğu hücreler. </li></ol> 4. Eklenti / İçselleştirme Deneyi NOT: Deneye başlamadan önce tüm reaktifler hazırlamak için emin olun. Protokole üç kontrol sonuç bölümünde (sahte enfekte edilmiş hücreler, nöraminidaz ön-muamele edilmiş hücreler ve sodyum azit ile muamele edilmiş hücreler) yer alan grupların küçük değişiklikler için gereklidir. <ol><li> Her 200.000 A549 hücreleri içeren 16 derin kuyu tüpleri hazırlayın. Sonraki 4 tüpten oluşan deney seti, 3 kontrol koşulları gerektiren her 4 tüp vardır: sözde-enfekte edilmiş hücreler, nöraminidaz (NA) -pretreated hücreleri ve sodyum azit ile tedavi edilen hücreler. Her grup &#39;0 dk&#39;, &#39;0 dakika + STV&#39;, &#39;30 dakika &#39;&#39;30 dakika + STV&#39; olarak etiketlenmiş 4 borulardan oluşmaktadır. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> 450 x g&#39;de 4 ° C&#39;de Spin tüpler. Supernatant ve tekrar süspansiyon pell kaldır% 0.3 BSA, 20 mM HEPES ve% 1 penisilin-streptomisin (kuluçka ortamı) ihtiva eden 200 ul DMEM içinde ve çal. 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. NOT: bakteriyel nöraminidaz (örneğin siyalidaz Vibrio kolera itibaren) mi hücrelerin yeniden askıya almak için inkübasyon ortamı içinde seyreltilmiş / 200 mU bir konsantrasyonda: nöraminidaz kontrolü için. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. 200 ul PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 10 dakika buz üzerinde aşağı, sonra bu adımı serin tüpleri bir kez daha tekrarlayın. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Spin tüpler. (Enfeksiyon PBS içinde seyreltilmiş 2. bölümünde belirlenen virüs konsantrasyonunu kullanın) virüsü biyotinile 100 ul süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. Buz üzerinde 1 saat inkübe edin. Ardından, tekrar yıkama adımı 2.4 tarif. NOT: enfeksiyon PBS virüsü olmadan: mock-enfekte kontrolü için. Sodyum azid kontrolü için: enfeksiyon PBS içinde seyreltilmiş Kullanım virüsü% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş. </li><li> ProfesyonelBuz üzerinde enfeksiyon sonrası numune cessing: <ol><li> Diğer numuneler sabit kadar &#39;0 dak&#39; numuneler için, 4 ° C&#39;de adım 2.5 ve mağaza örnekleri izleyin. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de&#39; 0 dakika + stv &#39;örnekleri, santrifüj tüpleri için. PBS% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren seyreltilmiş 50 ul STV (bölüm 3&#39;te belirlenen konsantrasyon kullanın) supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın (numuneyi işlerken içselleştirilmesi önlemek için). Buz üzerinde 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C&#39;de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin. </li><li> 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C &#39;de &#39;30 dakika&#39; örnekleri, santrifüj tüpleri için. 200 ul PBS% 2 BSA içeren süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 37 ° C&#39;de 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C&#39;de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin. Not: Sodyum azid kontrolü için: kullanımlar PBS, 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübasyon için 2% BSA ve% 0.1 sodyum azid ile takviye edilmiştir. </li><li> &#39;3 için0 dakika + stv &#39;numuneleri 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tüpler dönerler. 200 ul PBS% 2 BSA içeren süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. 37 ° C&#39;de 30 dakika kuluçkalayın. Daha sonra, 450 x g&#39;de 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj tüpleri. PBS% 2 BSA ve% 0,1 sodyum azit içeren seyreltilmiş 50 ul STV (bölüm 3&#39;te belirlenen konsantrasyon kullanın) supernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın (numuneyi işlerken içselleştirilmesi önlemek için). Buz üzerinde 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C&#39;de adım 2,4-2,5 ve mağaza örnekleri izleyin. Not: Sodyum azid kontrolü için: kullanımlar PBS, 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübasyon için 2% BSA ve% 0.1 sodyum azid ile takviye edilmiştir. </li></ol></li><li> Adımları 2,6-2,8 izleyin ve flow sitometri örnekleri analiz. Her bir numunedeki Cy3-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. </li><li> Yüzde ekli virüs ve içselleştirilmiş virüs nispi miktarını hesaplayın. <ol><li> Ekli virüs miktarını hesaplamak için, Cy3 positi yüzdesini kullanıngeçirilen hücreler ya da Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu ettik. Karşılaştırma için, 100% (Şekil 4B) muamele edilmemiş hücreler ayarlayın. Not: bağlı virüs yüzdesi &quot;0 min&quot; numune tarafından tarif edilmektedir. </li><li> Içselleştirilmiş virüs miktarını hesaplamak için, &quot;30 dakika&quot; örnek (Şekil 5B) ile &quot;30 dakika + STV&quot; örnek oranı alır. Not: Yukarıda sözü edildiği gibi, Cy3 pozitif kapılanmış hücrelerin veya Cy3 sinyali ortalama floresan yoğunluğu yüzdesi kullanılabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+influenza+A+virus:+host+factors+and+antiviral+targets.">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virolog. 2, (2007).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).</li><li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans.">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN.">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li><li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans.">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li><li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry.">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li><li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication.">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li><li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu:+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy.">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li><li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes.">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li><li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death.">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Macey, M. G., Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).</li><li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes.">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bizim protokol akış sitometri virüs eki ve içselleştirilmesi ölçmek için kolay bir yol açıklar. Bu, virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) kullanımı ile karşılaştırıldığında bu daha yakından taklit virüsü enfeksiyonlarının etiketli yabanıl tür virüsün kullanılmasını mümkün kılar. Protokol IAV bağlanmasını ve içselleşmesini ölçmek için optimize edilmiş olsa da kolayca diğer virüsler için adapte edilebilir. Akış sitometri okuma için kullanılan ek olarak, ko-renklendirm...

Influenza A virüsü (IAV) giriş hedef hücrelere 1 plazma membranında reseptörlere virüs bağlayıcı ile başlayan bir çok-aşamalı süreçtir. IAV reseptörü glikoproteinlerin ve glikolipitlerin çok çeşitli üzerinde mevcut olan sialik asit. Viral zarf içinde mevcut olan IAV bir hemaglütinin (HA) proteini sialik aside bağlanır ve böylece hedef hücrelerin 2 plazma zarına viral partiküllerin bağlanmasına aracılık eder. Virüs 3-6 tarif edilmiştir klatrin dolayımlı endositoz yoluyla hücrelerin değil, aynı zamanda, makropinositozlar gibi alternatif giriş yolları, girer. HA ve sialik asit arasındaki etkileşim, her iki aracı bağlanma ve viral parçacıkların 7 içselleşmesini tetiklenmesi için yeterli olduğu görülmektedir. Bununla birlikte, alternatif giriş reseptörleri öne sürülmüştür ve IAV girişi rolleri şu anda 1,8,9 araştırılmaktadır. Sokak köpeğirently çabalar acil olarak ihtiyaç duyulan yeni antiviral tedaviler 10-12 geliştirilmesi amacıyla, virüsün yaşam döngüsünde yer alan ana bilgisayar faktörlerini tanımlamak için yapılır. Virüs girdi onun erken noktada viral enfeksiyon engellemek için IAV büyümeyi hedeflemek için olumlu bir adım olacaktır. Virüsün genellikle büyük miktarlarda gelen virüs tespit etmek gerekli olarak IAV girişi farklı aşamalarını Ölçme deneysel zordur. Buna ek olarak, virüs girişi değişiklikleri için algılama aralığı nedeniyle viral replikasyon eksikliği sadece doğrusal olduğunu. Bu yüksek hassasiyet ile tahliller ihtiyacını vurgulamaktadır. Burada takdim deney hücreye birleşik virüs toplam miktarına bağlı olarak, hücre yüzeyinde bağlanmış virüsünün taranmasında olarak içsel virüs tespit edilmesine olanak sağlar. Biyotinlenmiş yabanıl tür virüsün kullanımı flow sitometri STV-Cy3&#39;e ile boyama ve okuma yoluyla uygun ölçüm sağlar. Biyotinile virüs hücreye soğuk sınırdırs eki izin ancak viral parçacıkların içselleştirilmesi önlemek için. Hücreler, sabit permeabilize ve ekli virüs ölçmek için STV-Cy3 ile boyanmış olabilir. Bir bloke etme adımı olmayan hücreler etiketli streptavidin (STV) ile inkübe edildiği tespitten önce uygulanırsa, hücre dışı, bağlı virionlar sinyal iptal edilebilir. Bir sonraki adımda, biyotinlenmiş IAV bağlanmasını takiben, sıcaklık 37 ° C&#39;ye kaydırılır ve viral parçacıkların içselleştirme gerçekleşmesi sağlanır. Içselleştirilmiş parçacıklar, böylece ekstra ve hücre içi virüsler arasında ayrımcılık sağlayan STV bağlanması korunur. Deneysel koşul başına, dört numune gereklidir: &#39;0 dk&#39;: İlk örnek, etiketlenmiş &#39;0 dakika&#39; hücre yüzeyinde soğuk bağlı virüs ölçmektir. &#39;0 dk + STV&#39;: İkinci örnek, &#39;0 dk + STV&#39; etiketli, deney temel sinyal yoğunluğu verir. Ekli virüs zekâ engellendih STV ve STV-Cy3 ile sinyal aşağıdaki boyama &#39;0 dak&#39; örnek kıyasla çok daha düşük olmalıdır. &#39;30 Dakika &#39;: üçüncü numune, &#39;30 dakika&#39; nedeniyle, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;ye kadar bir sıcaklık geçişi eklenmiş ve virüs içselleştirilir içerir. &#39;30 Dakika + STV &#39;: Dördüncü örnek, &#39;30 dakika + STV&#39; önlemler virüslerin hücre içi fraksiyon. STV bloke etme adımı 30 dakika inkübasyon süresi sonrasında uygulanır. Bunun bir sonucu olarak, hücre yüzeyinde viral partiküller STV- Cy3 ile lekeleme için tek içsel virüsleri uygun ayrılan STV bağlıdırlar. Içsel virüs nispi miktarı &#39;(örnek &#39;30 dakika tarafından anlatıldığı gibi) bir virüs toplam miktarına bölünmesiyle elde edilen (örnek &#39;30 dakika + stv olarak ölçülür)&#39; içsel virüs oranı olarak hesaplanabilir. Kontroller olarak, sözde-enfekte edilmiş hücreler dahil etmektedir. Mock-enfekte olmuş hücrelerde STV-Cy3 boyaması aşağıdaki sinyal arka plan verirboyama protokolünden elde edilir. IAV bağlanması için bir kontrol bakteriyel nöraminidaz (NA) içeren hücrelerin önceden bir tedavi yöntemidir. Hücresel glikoproteinlerin gelen sialik asit kapalı NA böler, böylece hücre yüzeyinden eki reseptörleri çıkarılması. Sodyum azid (SA) etkili bir metabolizma inhibitörüdür ve böylece blok 13, endositoz. Sodyum azid ile muamele hücreler internalizasyonundan bağlanma virüsü için pozitif ancak negatif olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E&quot;&gt;W9971E&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&amp;nbsp;Lucerna chem&amp;nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Dört farklı deneysel koşullar açıklayan bir çizgi, Şekil 1 &#39;de gösterilen bir temsili örneğin sonuçları Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, -. 5. &quot;0 dak&quot; örnek olarak, biyotinile virüsü soğuk bağlanır STV- Cy3 boyama ile görselleştirilebilir hedef hücrelere (Şekil 1 ve 2). (&quot;0 dakika + STV&quot; örnek olarak) bir bloke etme adımı uygulandığında, hücre yüzeyinde virüs artık STV- Cy3 boy...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Görüntüleme.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Video: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biyoloji

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında Influenza Virüsünün Hayatta Kalmasını İzleme

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

Source: Bailey, M. J., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56256">A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and measuring the produced bioluminescence.

FA aracılı efektör fonksiyonlarının aktivasyonunun HA antikorları tarafından ölçülmesi

1. Expression of Influenza Virus Hemagglutinin via Transfection

	Plate Human Embryonic Kidney (HEK 293T) cells at a density of 2 x 104 cells/well in a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Karakterizasyon ve Fonksiyonel Analiz

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Source: Yang, J., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Konak Hücrelere Bakteri Yapışmasının Tespiti

1. Bacterial adherence and host cell staining

	First, wash the seeded A549 cell monolayers three times with warm 1x PBS. For each wash, add 100 &#956;L ...