Name: highly sensitive assay for measurement of arenavirus-cell attachment
Uploaded: 2016-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
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우리는 보조금 T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), 및 P20RR021905을 통해 이러한 연구의 지원에 도움이 토론과 국립 보건원 (JB)에 대한 마르쿠스 Thali, 나단 로이, 크리스토퍼 지글러, 에밀리 브루스, 베냐민 왕 감사합니다 .

주 : 설명 프로토콜 (프리 PCR 실험실 방법 좋은 사전-PCR 기법을 사용하여 실험을 실시하는 설정 방법에 대한 뛰어난 개관 28 참조) 엄격한 사전-PCR 기법을 사용하여 수행하는 것이 중요하다. 모든 시약 및 장비 qPCR의 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA의 자유 및 적절한 제어가 이러한 오염을 검출하는 위치에있는 것이 필수적이다. 프로토콜의 개요는도 1에 도시되어있다. 1. 48 웰 플레이트에서 미디어 및 종자 세포를 준비 <ol><li> 50 ㎖를 첨가하여 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 완전한 둘 베코 변형 이글 보통 500 ㎖ (DMEM), 1 % HEPES (N-2- 히드 록시 에틸-N-2- 에탄 설 폰산) 완충액을 준비 열 불 활성화 소 태아 혈청 DMEM 5 ㎖의 500ml의 병에 100 × 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 100X HEPES 완충액 각. 이 시약은 사에 저장 될 수있다(76); 개월 동안 C. </li><li> 완전 DMEM 500 ㎕의 최종 부피에서 48- 웰 조직 배양 플레이트 내에 웰 당 종자 2.5 × 104 베로 E6 세포. 10~18 시간 동안 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. <ol><li> 평일의 끝 플레이트 종자. 중 중복 또는 세중의 우물에서 각 바이러스 샘플을 테스트합니다. 주 :이 분석 용 48- 웰 기반 플랫폼이 설명되지만, 이는 96 또는 384 웰 플레이트에서 다운 사용 분석을 확장 할 수 있어야한다. </li></ol></li></ol> 2. 바이러스 세포 첨부 파일을 실행 주 :이 프로토콜에서 사용되는 바이러스를 JUNV 균주 솔직 # 1 (C # 1) 성공적 JUNV 병 (29)의 예방을위한 약독 화 생백신으로 사용되어왔다. JUNV C # 1은 생체 내 및 생체 외 모두 직렬 통로를 통해 악성 JUNV 변형 XJ에서 파생 된 12 아미노산 (30)에 의해 부모 XJ 균주와 다른했다. Becaus전자 JUNV C # 1이 바이오 안전성 수준 (BSL) -2 등급 병원체이며,이 섹션에 설명 된 작업은 적절한 BSL-2 방식 (31)를 사용하여 수행해야합니다. 이것은 개인 보호 장비 (예 : 눈 보호, 실험실 코트, 이중 장갑), 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛의 사용을 포함, 모든 직원이 기관의 교육과 안전이 유기체를 처리하는 데 필요한 승인을받은 것을 보장한다. <ol><li> 원하는 PFUs에 테스트 할 JUNV C # 1 샘플 (들)을 희석 또는 얼음처럼 차가운 완전한 DMEM에서 형성 단위를 집중하고 각 웰에 추가 할 준비가 될 때까지 얼음에 저장합니다. 주 : 완전 DMEM에 희석 바이러스 결합 연구를 수행하는 대안 혈청 바이러스 첨부 간섭이 발생할 수 있는지 여부를 설정하는 축소 혈청 농도 (2 %) 및 ​​적합한 완충액 PBS를 함유하는 최소 배지를 사용할있다. 다른 바이러스 유사 첨부 프로토콜은 bicarbo없이 RPMI 1640 배지의 사용을보고0.2 % 소 혈청 알부민, 10mM의 (2- (모르 폴리 노) 에탄 설 폰산)를 포함 네이트, 10 mM의 HEPES, pH가 6.8 32. 이 바인딩 미디어는 미디어가 인큐베이터의 CO 2 - 환경에서 제거 될 때 발생할 수있는 pH 변화를 방지하기 위해 우수 할 수있다. <ol><li> 비생산적인 첨부 이벤트를 제한하기 위해 200에서 2,000까지 PFUs와 우물을 접종한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 상기 분석은 거의 20 PFU (또는 많은 6~10 × 2 PFU 등)를 이용하여 부착을 검출 할 수있다. </li><li> 세포 상에 접종에 대한 바이러스의 마스터 믹스를 만듭니다. 각 바이러스 샘플을 잘 당 50 μL의 볼륨에서 중복 우물에 접종한다. 웰 당 2,000 PFUs 바이러스의 추가를 원하는 경우, 따라서 DMEM 완료 차가운 얼음 120 ㎕의 총 부피로 희석 4800 PFUs. <ol><li> 분석의 특이성에 대한 제어하기 위해, 하나가 TfR1 (TRVb) 또는 특급을 표명하지 아니 중국어 햄스터 난소 세포 라인의 일치 쌍을 사용하여이 세포에 JUNV의 첨부 파일로 RESS hTfR1 (TRVb-1) 감소 여부, 각각 13,33해야 하나. 또한, arenavirus 첨부 파일 34 또는 항목 35을 방지하기 위해 이러한 테의 K 같은 단백질 분해 효소와 세포를 치료. 그들은 세포 13,36에 JUNV의 항목을 차단 알려진대로 hTfR1에 대한 고유 수용성 hTfR1 또는 monocolonal 항체 ch128.1은, 또한 고려 될 수있다. 또한, 무료 만노스 14 JUNV 특정 중화 항체 (37)와 입자의 배양과 세포의 전처리 바이러스 항목을 억제 할 수 있습니다. </li><li> 이 그럴듯한 설명이지만 JUNV 항목을 차단에도 불구하고 이러한 후자의 시약 및 방법은, 첨부 파일을 차단하는 확인되지 않은, 그러나, 유의하시기 바랍니다. 여기에 설명 된 프로토콜 정식 이러한 다양한 접근 충격 비리 부착 여부를 결정하기 위해 사용될 수있다. </li></ol></li></ol></li><li> 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 제거하고배치 중 4 ° C의 냉장고에서 15 분 엔도 시토 시스를 수행하는 도금 세포의 기능을 억제하기위한 얼음. </li><li> 다음으로, 각 웰에서 완전한 DMEM을 대기음 빠르게 얼음 차가운 PBS (인산염 완충 식염수)의 pH 7.4의 100 μl를 사용하여 두 번 아니라 각 씻는다. 그런 다음 적절한 우물 (단계 2.1에서 준비) 사전 희석 바이러스 샘플의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 플라스틱 포장에 접시를 감싸 즉시 다시 얼음이나 바이러스 첨부 파일이 발생할 수 있도록 1 시간 1.5에 대한 4 ° C 냉장고에 하나 배치합니다. 이 단계에 걸쳐 4 ° C에서 감기, 판을 보관 버퍼를 세척 및 바이러스 샘플. </li><li> 39 ° C에서 배양 종료 후, 바이러스 접종 물을 흡인하고 빙냉 PBS 200 ㎕를 각 웰을 3 회 세척 하였다. </li></ol> 3. 바이러스 성 RNA 추출 <ol><li> (예를 분리하고, RNeasy 미니 키트) 코르 상업용 키트를 사용하여 C JUNV 번호 # 단층에 부착 한 입자를 바이러스 RNA를 정제하여제조 업체의 프로토콜 땡. 특히, 아래의 수정을하고, RNeasy 미니 수첩의 페이지 23-28 (제 4 판 2006 년 4 월)의 &quot;스핀 기술 프로토콜을 사용하여 동물 세포에서 총 RNA의 정화&quot;를 따릅니다. <ol><li> 를 Lyse 각 웰에 직접 용해 완충액 RLT 350 μl를 첨가하여 공정 (b)에 지시에 따라 세포. 세포 용해를 위해 상기 버퍼를 여러 번 섞는다. 세포가 쉽게 용균 완충액 완전한 용해가 반전 현미경 웰을보고 확인할 수 있습니다. </li><li> 키트 컬럼 (3a 단계)에 생성 된 세포 용 해물을 전송하고 설명 된대로 프로토콜의 나머지 부분을 따르십시오. 프로토콜의 나머지 단계는 클래스 II 바이오 캐비닛의 외부에서 수행 키트 튜브 감염성 바이러스에 오염되지 않은 제공 될 수 있으므로이 점에서, 바이러스는 용해 완충 용액으로 중화되어있다. </li><li> 되어온는 제조 업체의 프로토콜에서 옵션 9 단계를 포함스핀 열의하는 ional 원심 분리는 버퍼 RPE의 가능한 이월을 제거합니다. </li><li> 최종 단계에서 제조사의 프로토콜 (단계 10) 뉴 클레아 제 무 DDH 2 O. 30 μL를 사용하여 스핀 칼럼으로부터 정제 된 RNA를 용출 상점이 시점에서 -80 ° C에서 RNA 또는 QRT-PCR 분석에 직접 사용합니다. 뉴 클레아 제에 의해 정제하여 바이러스 RNA 시료의 열화를 방지하기 클레아없는 시약 및 장치를 사용하여 얼음 위에서 해동 RNA 샘플을 유지한다. 참고 : 버퍼 RLT 및 RW1은 구아니딘 염을 포함하고 표백제와 혼합 할 수 없습니다. 버퍼 RW1 에탄올이 포함되어 있습니다. </li></ol></li></ol> 바이러스 성 게놈의 4 QRT-PCR 측정 <ol><li> 이후 qPCR에 대한 cDNA를에 JUNV C # 1 S 세그먼트 RNA를 변환하려면, 50 μL의 총 부피에 RT에 (단계 3.1.4에서 생성) 바이러스 성 RNA 대상으로 할 수 없다. <ol><li> 클레아의 6.75 μL : RT 반응을 설정하려면 먼저 반응에 따라 다음과 같은 시약을 각각 포함하는 마스터 믹스를 만들-free DDH 2 O, RT 프라이머 S의 2 μM 스톡 5 μL 2098- 2075-에 S 세그먼트 게놈 RNA의 NP 영역 5 μL의 상보 (5&#39;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 &#39;), 10X PCR 완충액 II, 25 밀리미터의 MgCl 2 용액 11 μL, RT 효소, RNA 분해 효소 억제제 1 μL (0.4 단위) 1.25 μL (62.5 단위)과의 dNTP 500 μM의 재고 10 μL. 참고 arenavirus 복제 과정 동안 4 바이러스 S 세그먼트 RNA 종 생성된다 : 전체 길이 게놈 RNA (vRNA와) 전체 길이 antigenomic RNA (vcRNA) (즉, vRNA와의 역방향 보완) 두 subgenomic의 mRNA를 각각 및 NP 유전자를 코딩 GP. 여기 나열된 RT 프라이머는 S 구간 vRNA와 특정 아니지만 vcRNA, NP의 mRNA 또는 mRNA의 GP. </li><li> 조심스럽게 RT 마스터 믹스를 혼합 한 다음 각각의 0.2 ml의 PCR 튜브에 40 μl를 나누어지는. 각 튜브에 바이러스 성 RNA의 10 μl를 추가합니다. 포함 I)없이 템플릿 제어 튜브 (예 :. 뉴 클레아없는 DDH 2 O (40)에 대한 마스터 믹스 μL)과 ⅱ)없이 RT 효소 제어의 10 μl를 (예를 들면받지 않은 마스터 믹스 40 μL에 알려진 양의 바이러스 성 RNA 샘플의 10 μl를 추가 추가 모든 RT 효소) 바이러스 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA와 함께 RT 시약의 오염을 선별한다. 세포 RN​​A의 존재 분석 특이성에 대해 제어 할 수있는 전체 RT 마스터 믹스 감염되지 않은 세포에서 추출한 RNA를 포함합니다. </li><li> 또한, RT 시약의 품질을 확인하기 위해 전체 마스터 믹스로 알려진 양성 바이러스 성 RNA 샘플을 포함한다. 필요한 경우 RT 반응 부피 25 μL로 감소 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음 사이클 조건 RT 튜브 제목 : 25 ° C를 10 분, 30 분, 48 ° C, 5 분 동안 95 ° C에 대한. 샘플을 4 ° C의 공정을 추가하여이 시점에서 -20 ° C에서 저장 또는 열 순환기에서 밤새 남아있을 수 있습니다. </li><li> 피25 μL의 총 부피에 erform qPCR에. <ol><li> 다음 결합하여 qPCR에 마스터 믹스를 확인 : 각의 S1937 +는 1958+하는 앞으로 PCR 프라이머 (5&#39;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 &#39;) (9 μM 주식) 2.5 μl를 및 역방향 PCR 프라이머 S 2001에 1982 ~ (5 에 qPCR에 프로브 S 1960+의 &#39;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&#39;), 2 μM 주식의 2.5 μL () 1975+ (5&#39;-6FAM - ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 &#39;) 및 2 배 보편적 인 qPCR에 마스터의 12.5 μL 혼합. JUNV C # 1에 특이 여기에보고 앞으로 프라이머, NT 악성 JUNV 변형 로메로을 대상으로 처음보고 된 프라이머 서열 38에서 1로 차이가 있습니다. </li><li> 부드럽게 솔루션을 혼합 한 후 각 웰 qPCR에 20 μl를 추가합니다. 해당 qPCR에 우물 각 RT 반응의 5 μl를 추가합니다. 시험 각 샘플에 대해 중으로 qPCR에를 실시하고 있습니다. 필요한 경우 PCR 반응 부피가 적은 등 12.5 μL로 감소 될 수 있습니다. 참고 :와 관련된 소프트웨어를qPCR에 기계 qPCR에 프라이머 대상 JUNV C # 1 NP 유전자를 코딩하는 플라스미드의 표준 희석 시리즈 각 미지 시료의 값을 비교하여 JUNV C 1 S 세그먼트 게놈 RNA의 절대 복사 번호 생성 프로브 설정합니다. qPCR의 분석에만 표준 곡선의 범위 내에있는 값을 정량 분석​​을 제공 할 수있다. 5, 50, 5 × 103, 5 × 5, 5 × 7 복사 웰당이 때문에, 이하의 (삼중 웰)에서 플라스미드의 양을 포함한다. </li></ol></li><li> 열 순환기에 qPCR에 판을로드하고 다음과 같은 반응 조건을 실행 : 95 ° C를 10 분 15 초와 1 분 60 ° C 95 ° C의 40주기 위해. <ol><li> 수집하고 제조자의 프로토콜에 따라 각 샘플에 바이러스 RNA의 양을 결정하기 위해 데이터를 분석한다. </li></ol></li><li> qPCR의 타르를 함유하는 플라스미드 새로 정제 샘플을 사용하여 검량선을 설정하려면서열을 얻을 제 용액의 플라스미드 카피 수를 결정한다. <ol><li> 플라스미드의 분자량을 계산한다. 전체 플라스미드의 서열이 공지 된 경우, 다음 수식을 이용하여이를 계산 : MW = ([A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13). 이중 가닥 플라스미드의 각 가닥에 발견 된 특정 뉴클레오티드의 총 수를 포함해야합니다. </li><li> 플라스미드의 크기가 알려져 있지만, 그 정확한 시퀀스가​​없는 경우, 각각의 dsDNA의 염기쌍 600의 MW를 갖는다는 가정하에 계산 MW. 참고 : 여기에 사용는 pCAGGS - JUNV C # 1 NP의 플라스미드는 4.2 × 10 (6)의 MW 있습니다. </li><li> 플라스미드의 MW가 결정되면 μL 당 매수 재고 플라스미드 용액에 존재하는 계산 방법. </li><li> 제 용액 플라스미드의 총 μg의 계산 후 플라스미드의 몰이 변환 (69 μg의 플라스미드을 물 300 μL, 6.9 X 1에 포함되어있는 경우, 예를 들어번호를 복사 변환 할 수있는 플라스미드 * 1 몰의 0 -5 g / 플라스미드의 4.2 × 10 6g = 플라스미드의 1.6 × 10 -11 몰), (예를 들어 플라스미드의 1.6 × 10 -11 몰 * 6.022 × 10 (23) 분자 / 몰 = 9.8 × 10 (12) 분자 (또는 사본)). </li><li> μL 당 사본을 얻기 위해 그 용액의 부피 플라스미드 플라스미드 용액의 전체 사본을 나눈다 (예를 들면 9.8 × 10 12 카피 / 300 μL = 3.28 × 10 10 부). </li><li> 5 ㎕의 부피는 표준 곡선을 확립하는 데 필요한 카피 수의 범위를 전달하기 위해 PCR 플레이트 상에 로딩 될 수 있도록 적절하게 용액을 희석. </li></ol></li></ol>

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Virol. 86, 7256-7267 (2012).</li><li>Shannon-Lowe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus-induced+B-cell+transformation:+quantitating+events+from+virus+binding+to+cell+outgrowth.">Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth.</a> J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).</li><li>Mifflin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+up+a+PCR+laboratory.">Setting up a PCR laboratory.</a> CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).</li><li>Maiztegui, J. 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F., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cellular+receptors+for+the+South+American+hemorrhagic+fever+viruses+Junin,+Guanarito,+and+Machupo.">Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo.</a> 346. , 476-491 (2006).</li><li>Helguera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+recognizing+the+apical+domain+of+human+transferrin+receptor+1+efficiently+inhibits+the+entry+of+all+new+world+hemorrhagic+Fever+arenaviruses.">An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses.</a> J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).</li><li>Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+monoclonal+antibodies:+characterization+and+cross-reactivity+with+other+arenaviruses.">Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses.</a> J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Helenius, A., Marsh, M., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Semliki+forest+virus+penetration+by+lysosomotropic+weak+bases.">Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases.</a> J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).</li><li>Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion+and+nucleocapsid+delivery+into+the+cytoplasm+are+distinct+events+in+some+flaviviruses.">Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses.</a> PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

우리가 설명하는 프로토콜은 간단하고 강력한는 다음과 같은 중요한 고려 사항이 관찰된다 제공했다. 첫째, 엄격한 사전-PCR 기술은 (우수한 검토를 위해 28 참조) 고용해야합니다. 모든 시약 및 장비 qPCR의 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA의 자유 및 적절한 제어가 이러한 오염을 검출하는 위치에있는 것이 필수적이다. 둘째, 프로토콜, 바이러스, 세포, 및 미디어 바이러스 세포 부착 부에 ...

Arenaviruses 자연 1-3 설치류에서 주로 유지 포위, 단일 가닥 RNA 바이러스의 가족입니다. 이 바이러스는 일반적으로 설치류 저수지 1,2의 증상, 지속적인 감염을 설정하는 동안, 그들은 인간 3 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 중요 병원성 종은 새로운 세계 후닌 바이러스 (JUNV) 4 아프리카에서 남미, 라사 열에서 아르헨티나 출혈열의 병원체가 각각있는 올드 월드 라사 바이러스 (5)를 포함한다. 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 가정 (6)의 본보기 바이러스는 전 세계적으로 분포가 면역 억제의 면역 개인 6 무균 성 뇌막염, 태아 7 심각한 선천성 또는 높은 치사율을 포함하는 다양한 질환 상태에 대한 책임 고체 장기 이식 8,9 다음 개인. 미국의 부족식품의 약국 (FDA)은 백신 이들 바이러스에 대처하기 위해 효과적인 항 바이러스제는 치료 이들 신흥 / 재 신흥 병원균을 대상으로 새로운 전략을 개발하는 중요한 필요성을 강조 -approved. arenavirus 게놈 두 개의 단일 가닥 RNA 세그먼트, 대형 (L) (~ 7.2 킬로바이트) 작은 (S) (~ 3.6 킬로바이트) 세그먼트 (10)로 구성되어 있습니다. L 세그먼트가 바이러스 폴리머 라제 (L) 및 매트릭스 단백질 (Z)을 인코딩하는 동안 S 세그먼트 바이러스 핵 단백질 (NP)과 외피 당 단백질 (GP)을 인코딩한다. L과 S 게놈 RNA 세그먼트 (vRNA들)은 비리 10-12로 포장됩니다. arenavirus 감염의 초기 단계는 바이러스 입자의 부착 JUNV 들어 인간 트랜스페린 수용체 1 (hTfR1) (13, 14)과, 바이러스 GP 및 해당 숙주 세포 수용체 사이의 상호 작용을 통해 세포를 호스팅한다. 부착 후, JUNV 입자는 클라 트린 매개 엔도 시토 시스 (15)를 통해 세포로 수행한다.입자이 구획의 낮은 pH가 GP 16, 17의 활성화를 유발 후반 엔도 좀에 다음 트래픽. 일단 바이러스와 엔도 솜 막의 융합을 개시 사이, GP 부호화 융합 펩티드 삽입 엔도 솜 막으로 활성화. 그들은 게놈 복제 및 전사에 대한 템플릿 역할을 세포질에 비리 패키지 vRNA들의 릴리스의 성공적인 융합의 결과. 바이러스의 구조 단백질과 vRNA들의 충분한 양이 생성되는 경우, 새로운 입자가 조립하고 감염된 세포에서 새싹 라이프 사이클 (18)를 완료합니다. 치료 병원성 arenaviruses 타겟팅 새로운 전략의 발견을 용이하게하기 위해, 우리 그룹은 호스트에 대한 바이러스 증식에 중요하지만, 폐기 가능하다 호스트 요소의 식별에 초점을 맞추고있다. 이러한 맥락에서, 이러한 숙주 요인에 의해 제어 바이러스 생활주기의 정확한 스테이지 (들)를 형성하는 안내 할 필요가있다항 바이러스 전략의 개발. 여기서, 우리는 선택된 숙주 단백질 및 / 또는 바이러스 분자 바이러스 엔트리 (19)의 초기 단계에 영향 여부를 식별하기위한 목적 arenavirus 세포 부착을 측정 할 수 정량 (Q) RT-PCR 기반 분석법을 설명한다. arenavirus 세포 부착을 측정하는 다른 방법은 비오틴 (20), 형광 염료 (21), 또는 방사성 동위 원소 (22)으로 표시 비리를 추천했다. 이러한 방법에 대한 단점은 입력 바이러스의 대량 방사능의 사용 (감염 (MOI)의 예를 들면 높은 다중도), 및 / 또는 입력 된 바이러스 (예를 들어, 농도 및 / 또는 바이러스의 표시)을 제조하기위한 추가 처리 단계들에 대한 요구 사항을 포함 할 수있다 . 특히, 높은 MOI를 사용하는 것이 곤란 비생산적인 부착 이벤트 15,23 비해 생산성을 구별 할 수있다. 여기에 설명 된 QRT-PCR 기반의 분석은 거의 20 패에 대한을 사용하여 첨부 이벤트를 검색 할 수 있습니다밍 단위 48 웰 플레이트에 대해 0.0004의 MOI로 변환 바이러스 (PFUs). 따라서, 분석의 감도가 강한 높은 MOI 대한 요구뿐만 아니라 바이러스 라벨 또는 농도 단계를 극복한다. 또한, 분석 내가) 비리의 엔도 사이토 시스를 측정 할뿐만 아니라 세포질에 바이러스 게놈의 방출 등의 융합에 따라하도록하고 ⅱ) 예제 바이러스 특정 QRT-PCR 시약의 개발을 통해 다른 바이러스와 함께 사용 (위해 맞춤형 할 수 있습니다 참조 24-27).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>100x</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>100x</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>1x</td></tr><tr><td>Vero E6 cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well plate</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>do not mix buffers RLT or&amp;nbsp; RW1 with bleach</td></tr><tr><td>QIAshredder homogenizer</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/&amp;micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>4311235</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0260</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0010</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor (5000U/100 &amp;micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0119</td><td></td></tr><tr><td>RT primer 5&amp;rsquo;-AAGGGTTTAAAAAT&lt;br/&gt;GGTAGCAGAC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>250 nmol DNA oligo</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>Forward qPCR primer&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>Reverse qPCR primer 5&amp;rsquo;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>TaqMan Probe 5&amp;rsquo;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4316033</td><td>HPLC purified</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL)</td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4376598</td><td>or other qPCR instrument</td></tr></tbody></table>

highly sensitive assay for measurement of arenavirus-cell attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

프로토콜의 섹션 4에 기술 된 바와 같이의 qPCR 분석의 감도와 다이나믹 레인지를 설명하기 JUNV C # 1 (범위 5-5 X 107 부)의 NP 유전자를 코딩하는 플라스미드를 공지 된 양을 qPCR을 행 하였다. 분석은 민감하고 안정적으로 표적 핵산의 5 부 (그림 2) 적은 감지 할 수 있습니다. 템플릿의 적어도 7 로그를 커버 할 수있다,도 2에 도시 된 바와 같이, ?...

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Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

highly-sensitive-assay-for-measurement-of-arenavirus-cell-attachment

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K 조회수.  University of Vermont. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

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Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

연구

면역학 및 감염병학

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

특정 성장 속도로 타 바이러스의 세포 바인딩 기능에 대 한 분석

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

생물학

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

색색세포 기반 분석법을 사용하여 AAV에 대한 항체 중화를 검출하는 단계별 방법

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

Source: Tai, C., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows assessment of the impact of the test compound on viral envelope fusion with endosomes.

Note: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

For the viral attachment assay, plate 1 x 104 cells per well in a 96-well plate, and incubate overnight for cell attachment. The next morning, first, chill the 96-well plate containing the cell monolayer at 4 degrees Celsius for 1 hour.
Prepare the test compounds and virus mixture on ice. For example, HCV-CHLA, HCV - 1% DMSO, or positive control HCV-heparin solutions with 102 FFU virus for each treatment well. Aspirate the medium from the cell culture wells gently. Then, immediately add 100 microliters of virus test compound mixture in triplicate wells, taking care not to raise the temperature. Incubate the plate in a refrigerator maintained at 4 degrees Celsius for three hours.
Virus particles will attach on the cell surface at 4 degrees Celsius but will not be internalized. Next, aspirate the supernatants. Gently wash the cells twice with 200 microliters of ice-cold PBS. Add 100 microliters of basal medium to each well, and then incubate at 37 degrees Celsius for 72 hours. Finally, for quantitating the released luciferase reporter from the infected cells, collect the supernatant from each sample well and perform the Gaussia luciferase assay.