Yeh laboratuvar, bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG-97-219-14) Bir Savunma Bakanlığı hibe araştırma fonları tarafından, musc at Hollings Kanser Merkezi&#39;nde verilen (W81XWH-11-2- araştırma fonları tarafından desteklenen 0229) musc at ve endişe (Esy kadar) Vakıf bir ödül ile.

Protokol kurallarına ve South Carolina (MUSC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tıp Üniversitesi (IACUC) hayvan bakım standartlarını izler. 1. Akciğer Diseksiyon <ol><li> Meme tümör diseksiyonu (opsiyonel çalışma hedeflerine ve primer tümör analiz veya kuyruk ven enjeksiyon yapıldı mı bağlı). <ol><li> IACUC ve üniversite yönetmeliğine göre izofluran anestezisi bir öldürücü doz kullanarak fare Euthanize. Cerrahi dislokasyon euthanization onaylayın. </li><li> Köpük tahta, bacaklarda yayılması ile sırtında fare koyarak diseksiyon iğneleri ile pim üzerinde. </li><li> % 70 etanol ile fare püskürtün. </li><li> Forseps kullanarak, merkezde hayvan alt kısmını kavramak. </li><li> Makas kullanarak, fare periton boşluğuna delmek için dikkatli olmak, deri yoluyla boyun doğru yukarı kesti. </li><li> Tümör dokusu ortaya çıkarmak için bacaklarda cildi kesin. </li><li> Tümör dokusu ve pr parçalara ayırDaha fazla analiz için (değil bu protokolde ayrıca tartışılacaktır), bu tür donma veya fiksasyonu gibi, tercih edilen yöntem ile eserve. </li></ol></li><li> Akciğer doku diseksiyonu. <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi tümör dokusu hasat ise, herhangi bir aşırı cilt aşağı pin. </li><li> Forseps kullanarak, hayvanın alt ucunda periton kavramak ve boyun tabanına doğru yukarı kesme başlar. </li><li> Dikkatle göğüs boşluğuna kanama olabilir herhangi bir kan damarlarını kesmekle önlemek için dikkatli olmak kaburga kafesinin sağ ve sol kenarlarında kesilmiş. Sol ve sağ kaburga kafesinin diyafram ve üst kısımları keserek kaburga kemikleri çıkarın. </li><li> Forseps kullanarak fare trakea kavramak ve ileri çekin. </li><li> Diseksiyon makas ile trakea Sever ve fare akciğerleri kaldırmak. Not: Kalp akciğer takılı kalabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, dikkatli beş lobları toplamak için dikkatli olmak akciğerlere uzak kalbini incelemek (bakınız Şekil 1 </strong&gt;). </li><li> Aşırı kan çıkarmak için PBS ile hafifçe yıkayın. </li></ol></li><li> Akciğer dokusunda Brüt değerlendirilmesi. <ol><li> Seçenek 1: In vivo görüntüleme. <ol><li> Lusiferaz görüntüleme için, ~ 10 dakika önce görüntüleme, hayvanlara intraperitonal (ip) enjeksiyonu ile luciferase bir 150 mg / kg doz vermek. Anestezi altındaki hayvanlarda veya diseksiyon (Şekil 2) 5 sonra kaldırılması üzerine in vivo Görüntü akciğerler. </li></ol></li><li> Seçenek 2: Brüt değerlendirme. <ol><li> Tümör nodüller görselleştirmek için stereo mikroskop altında akciğerleri inceleyin. Not: hücreler, etiketli GFP ise, GFP tespit etmek için (470/510 nm civarındaki gibi) uygun bir uyarım / emisyon maksimum ile ışık küp ihtiva eden bir floresan yeteneğine stereomikroskop işleme öncesinde floresan stereoskopik akciğerlere incelemek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Akciğerler derhal analiz edilecek ise, &#39;RNA izolasyonu&#39; bölümüne geçin. Aksi takdirde, Sıvı sabun kullanılarak dondurularak doku ekid azot veya kuru buz. -80 ° C saklayın. </li></ol></li></ol> 2. RNA İzolasyon Not: Örnek analizinde, RNA, bir RNA izolasyon kiti (Malzeme listesi) kullanılarak izole edilmiştir. Geçerli analiz belirli bir üreticinin ürettiği kullanırken, izolasyon kitleri çeşitli birçok saygın satıcılardan temin edilebilir. Ayrıca, sigara kit tabanlı santrifüj yöntemleri de bir seçenek vardır. cDNA, standart eğrisi analizi için bir hücre hattı veya plazmid olarak, bir pozitif kontrol RNA numunesinden hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, primer prob seti için belirli bir pozitif kontrol satın alınabilir (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). <ol><li> Önceden dondurulmuş doku kullanıyorsanız, kuru buz dondurulmuş doku toplamak. </li><li> Örneğin aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılarak doku homojenize: havan ve tokmak doku sıvı nitrojen içerisinde dondurulduktan sonra, kuru buz üzerine el ile yapılan öğütme; Doku homojenizatörü veya mekanik ayrışma cihazıÜreticinin öneri başına; sonikasyon veya diğer tercih edilen yöntem. Not: temsilci analizi için homojenizasyon tercih edilen yöntemdir sonikasyonudur. <ol><li> Şekil 3 sunulan analizi için, bir oranda parçalama (RNA izolasyon kiti sağlanan) tampon ve 2-merkaptoetanol hazırlanması 20 ul 2-merkaptoetanol lisis tamponu, her 1 ml. Süspanse dokusu 300 ul liziz tamponu içinde% 30 genlik ayarlanmış sonikatör 10 sn için doku ve sonikasyon, her 30 g 2-merkaptoetanol ile takviye edilmiştir. </li><li> Öğütme sonrası 300 ul liziz tamponu içinde tekrar süspansiyon temel doku, harç ve havan tokmağı kullanılarak edin. </li></ol></li><li> 590 ul TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 10 ul proteinaz K ilave. Doku (yani her 30 mg) her 300 ul 600 ul proteinaz K çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Not: Sindirim süresi değişebilir. </li><li> ≥1 örnekleri Santrifüj10 dakika boyunca 3000 gr enkaz kaldırmak için. </li><li> Yeni tüplere süpernatant aktarın. </li><li> RNA çöktürmek için süpernatan, her 900 ul için 450 ul etanol (% 96 -100%) ekleyin. </li><li> Kolona lizat / etanol karışımı 700 ul aktarın. </li><li> 1 dakika boyunca ≥13,000 g&#39;de santrifüjleyin örnekleri kolona RNA bağlama. </li><li> Sıvı atık atın ve sütun kalan süpernatant ekleyin ve tekrar döndürün. </li><li> Tüm lisatı kolonu boyunca bükülmüş bir kez, 30 saniye süre ile ≥13,000 g kolonu ve santrifüj örnekleri üst kısmına Yıkama Tamponu 1 350 ul ilave edin. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> Ben 10x DNaz 5 ul ve numune başına DNaz / RNaz ücretsiz su 40 ul (50 ul / numune toplam hacim) ile enzim DNaz 5 birim karıştırılarak DNaz hazırlayın. </li><li> DNase 50 ul, her sütun için karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe ekleyin. </li><li> Kolon ve santrifüj sam ile Yıkama Tamponu 1 350 ul ekleyinples 30 sn için ≥13,000 g. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> Kolonuna Yıkama Tamponu 2 600 ul ilave edin ve ≥13,000 g&#39;de 30 saniye dönerler. </li><li> Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin. </li><li> ≥13,000 g&#39;de 2 dakika süre ile 250 Yıkama Tamponu 2 ul ve santrifüj ekleyin. </li><li> Yeni koleksiyon tüpüne sütunun kısmını koyun ve eski toplama tüpü atın. </li><li> Sütuna RNaz / DNaz serbest su 50-100 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> ≥13,000 g 1 dakika boyunca dönerler. </li><li> Yeniden çalıştırın RNA verimi artırmak için kolon boyunca toplanan eluatın. </li><li> Acil kullanım için, buz üzerinde örnekleri tutmak ve kantitatif geçin. Daha sonra kullanmak için, kuru buz veya sıvı azot üzerinde dondurma ek. -80 ° C derin dondurucuda saklayın de ihtiyaç kadar. </li></ol> 3. içine First Strand Synthesis Not: temsilci analizi için, ters transkriptaz (RT) reaksiyonu, bir F gerçekleştirildi(Malzeme Listesi&#39;ne bakınız) QRT-PCR için tasarlanmış irst Strand cDNA sentez kiti. <ol><li> Numuneler daha önceden toplanmış olsaydı, buz üzerinde tüpler çözülme. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ölçün. </li><li> Toplam RNA&#39;nın 0,5-2 ug kullanılarak cDNA stokunun oluşturulması için ters transkriptaz kullanılarak birinci sarmal sentezi gerçekleştirmek. <ol><li> Steril, RNaz / DNaz içermeyen PCR tüpleri / levha, reaksiyon karışımı (Tablo 1) hazırlanması. Yavaşça ve santrifüj karıştırın. Standart bir PCR makinesi (Tablo 2) programlayın. </li></ol></li><li> Steril nükleaz içermeyen su kullanılarak istenen hacme (genellikle 50-100 ul) bitmiş reaksiyonu sulandırmak. </li></ol> 4. Real-time PCR Not: temsilci analizi için, SYBR yeşil kullanılmıştır. Ancak, herhangi bir tercih edilen yöntem, kullanıcının takdirine bağlı olarak ikame edilebilir. <ol><li> Bir pozitif kontrol cDNA kullanılarak, her bir primer grubu için bir standart eğri ayarlayın. <ol><li> Analiz i gösterilen İçinn Şekil 3, pozitif kontrol cDNA tavsiye üreticisi kullanarak insan HER2 için standart eğri hazırlamak (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). Fare GAPDH için, bir standart eğri oluşturmak için negatif kontrol akciğer cDNA&#39;nın kullanılmasıdır. 5 standartları üretmek için 4: her bir prob için, seri cDNA 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Standart eğri ve deneysel örnekleri içermelidir toplam örnek sayısını, hesaplayın. Not: Analiz burada açıklanan için numune başına 2-3 deneysel çoğaltır analiz edildi. Standart eğri analizi son normalleştirilmiş miktarını hesaplamak için, numune başına göre HER2 miktarı ve GAPDH belirlemek için uygulanabilecek bir basit doğrusal regresyon modeli oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. Bu analiz aynı zamanda astar verimliliği eldeki analiz için yeterli olmasını sağlayacaktır. </li><li> Steril, RNaz / DNaz ücretsiz tüp içinde, ana karışımı (Tablo 3) hazırlar. <ol><li> Ana karışımı Amoun hesaplayınNumune başına t. Birden fazla örnek için büyütmek. Çevrede oluşturduğu her bir deney geni, hem de GAPDH gibi bir iç kontrol için bir ana karışımı kullanın. 200 nM&#39;lik bir nihai konsantrasyonda GAPDH için primerler kullanarak. Not: İnsan ve fare hücre kökenli ayırt çalışırken iç kontrol özellikle yararlıdır. Not: HER2 için primer konsantrasyonu optimize edilmiş ve üretici tarafından belirlenmiştir. </li></ol></li><li> Her standart veya numune deney tekabül eden 1 ul cDNA&#39;lan ihtiva eden test plakası hazırlanır. Her bir primer prob için en az 1 cDNA örnek / ayırın. Her primer prob için kuyu başına ana karışımı 19 ul ekleyin. Not: Şekil 3 temsili veriler için, alınan cDNA, her bir primer prob için iki kopya halinde analiz edilmiştir ve iki numune ortalaması olarak grafik haline. </li><li> QRT-PCR makinesinde çalıştırın reaksiyon tavsiye veya önceden PCR protokolü test kullanarak. Tablo 4 görün </sŞekil 3 ve Şekil 4&#39;te temsili veriler için kullanılan PCR protokolü için trong&gt;. </li></ol>

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

Esy ve MAA FirstString Araştırma A.Ş. tarafından istihdam edilmeyen ve şirketin herhangi bir finansal çıkarı tutmayın. FirstString Research Inc. Bu yazıda sunuldu lusiferaz görüntüleme verileri sağlamıştır. GSG FirstString Araştırma başkanı ve CEO&#39;su. CLG FirstString Araştırma bir çalışanıdır. GSG ve CLG FirstString Research tarafından yayınlanan hisse senedi opsiyonları vardır.

Bu protokol, ksenograft fare modeli kullanarak, akciğer, meme tümör hücresi metastazının değerlendirmek için QRT-PCR kullanımını tarif etmektedir. Bu bioluminescent görüntüleme dahil olmak üzere diğer teknikler mevcuttur ve ayrıca kendi değerlerini ve sınırlamalar olmasına rağmen metastaz saptanması için etkili olduğu kabul edilmektedir. Sunulan veriler QRT-PCR Toplam metastaz ölçülmesi için, akciğer dokusu içindeki tümör kaynaklı mRNA tespit etkili bir ölçüsü temin ettiğine işare...

QRT-PCR analizi, tümör metastazı değerlendirmek için bir yöntem olarak önerilmektedir. Bu yöntem metastazı değerlendirilmesinde ilgilenen ancak in vivo görüntüleme ekipmanı ya da bir floresan yetenekli Stereoskop gibi belirli ekipmana erişimi olmayan kullanıcılar için bir alternatif olarak önerilmiştir. Yaygın olarak kullanılan yöntemlerin bir tartışma QRT-PCR analizi, ayrı olarak ya da metastaz değerlendirmek için eşlik eden bir yöntem olarak da kullanılabilir nasıl bir gösteri ardından sunulmuştur. Bu prosedür metastatik yükünün kantitatif analiz sağlama potansiyeline sahiptir. Bir stereomikroskop altında akciğerlerin görüntülenmesi yanı sıra hematoksilen ve eozin ardından seri kesit olmak üzere brüt analiz standart yöntemler, akciğer dokusunun (H &amp; E) boyama, ölçülebilir ancak 2-5 sayılması için kullanıcı tanımlı parametrelere dayanmaktadır. Stereomikroskopta kullanarak tüm akciğerleri değerlendirirken, sadece geniş yüzey metastazları visi vardırble ve analiz metastatik lezyon neyin belirlemek için akciğer anatomik yapının makul bilgiye sahip araştırmacı gerektirir. GFP ve ilgili uyarım / emisyon maksimumları (GFP örneğin yakınındaki 470/510 nm) ile bir ışık küp içeren bir stereomikroskop kullanımı gibi, bir işaretleyici ile tümör hücrelerinin floresan etiketleme bu işlemde yardımcı ancak yüzey tümör nodülleri saptanabilir . Buna ek olarak, GFP ile aynı parametreleri altında görünür kan kontaminasyonu, floresan, mümkün olan metastatik yanlış tanımlanmasına yol açabilir. Akciğer metastazı görselleştirmek için H &amp; E boyama ile takip akciğerin Kesit mikrometastazları ve bağışıklık hücre infiltrasyonu dahil olmak üzere diğer mikroskobik süreçleri değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir ancak genellikle parafine, kesit ve boyama işlemleri için tüm akciğer dokusunun kullanılmasını gerektirir. Bu nedenle, mansap işlemleri bu metho aşağıdaki ideal değildird. Ölçülebilir, ancak bu işlem analizi akciğer tüm 3D yapısı oluşturan sağlamak için hayvan başına lekeli akciğer bölümlerinin büyük sayısını değerlendirmek için araştırmacı gerektirir. Sonuç olarak, bu tür muayeneler hatasını sayma yol açabilir, zaman tüketen ve analiz araştırmacı takdirine dayanır. (MR, PET, SPECT gibi) şu anda gerçekleştirmek veya deneysel kemirgen modellerinde 8 biyolojik süreçleri test etmek için kullanılan in vivo görüntüleme teknikleri Çeşitli. In vivo bioluminescent görüntüleme metastazı 9 brüt görünüm elde etmek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Bu teknik genellikle nedeniyle tümör hücresi implantasyonundan sonra meme bezi ve spontan metastaz sırasında akciğer gibi belirli organların ikamet bir lusiferaz cevap veren bir eleman ihtiva edecek şekilde tümör hücreleri, birikimine lusiferaz raportör etkinliği varlığını değerlendirmek uygulanır 1Lusiferaz raportör etkinliği 0. Görselleştirme lusiferin substratının (D-lusiferin) mevcudiyetinde tarafından indüklenir. Lusiferaz biyolüminesans üreten oksilusiferin D-luciferase oksidatif dekarboksilasyonunu katalize eder. Bilgilendirici olmakla birlikte, bu yöntem, alt-tabaka stabilite (örneğin, kısa yarı-ömür), deney hayvanlarına verilir bağlıdır alt-tabakanın yeterli bir dağılımı ve algılama 9 düşük hassasiyeti de dahil olmak üzere birçok faktör tarafından sınırlanır. Bu tekniğe Bir ana hak o, non-invaziv bir canlı hayvan üzerinde yapılabilir ve normalde diseksiyon 9,10 hasat edilmemiş olabilir birden organlarda tümör hücre metastazı saptanması yol açabilir olmasıdır. In vivo görüntüleme tekniklerinden biri olumlu yönü akciğer dokusu parafine gibi ikincil işlemler için izin dönülmelidir ya da burada sunulan, QRT-PCR analizi olmasıdır. Bununla birlikte, QRT-PCR Teorik olduğully tespiti daha hassas bir ölçümü, brüt değerlendirme akciğer tümör hücrelerinin mevcut düşük sayıda görülmemelidir. Yararlı ise, yukarıda tarif edilen görüntüleme teknikleri yer değiştirmiş olabilir veya şu anda tarif QRT-PCR yöntemi ile takviye edilmiştir. QRT-PCR akciğer içinde tümör kaynaklı mRNA duyarlı bir ölçüsünü sağlamak için potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Sequence</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

Metastatik hastalık uzak organ primer kanser sitesinden habis tümör hücrelerinin yayılması ve kanserle ilişkili ölüm 1 birincil nedenidir. Metastatik yayılım Ortak siteleri akciğer, lenf nodu, beyin ve kemik 2 sayılabilir. Metastazı sürücü mekanizmalar kanser araştırmaları yoğun alanlardır. Metastaz uzak siteler kanser araştırmaları için enstrümantal şunlardır Sonuç olarak, tahliller metastatik yükünü ölçmek için. Meme tümörü modellerinde akciğer metastazlarının değerlendirilmesi, genel olarak, aşağıdaki akciğer dokusunun diseksiyon brüt niteliksel gözlem ile gerçekleştirilir. Metastazı değerlendirilmesinde nicel yöntemler şu anda ex vivo ve kullanıcı tanımlı parametre gerektiren vivo görüntüleme bazlı teknikler sınırlıdır. Bu tekniklerin çoğu oldukça hücresel düzeyde 3-6 den bütün organizma düzeyinde bulunmaktadır. Çoklu foton mikroskopi kullanılarak yeni görüntüleme yöntemleri metalar değerlendirebilecektir rağmenhücresel düzeyde 7&#39;de tasis, bu son derece zarif prosedürleri yayılma mekanizmaları yerine metastatik yükünün kantitatif değerlendirmesini değerlendirmek için daha uygundur. Burada, kantitatif metastaz değerlendirmek için basit bir in vitro yöntem sunulmaktadır. Kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak (QRT-PCR), tümör hücresi spesifik mRNA fare akciğer dokusu içinde tespit edilebilir.

Zaman ötesinde deneysel hayvana ve gerekirse, tümör hücrelerinin ilk aşılama gerçekleştirmek için gereken performans, in vivo tümör analizi, doku hasat, RNA izolasyonu ve QRT-PCR analizi birincil bir 1-2 günlük bir işlemdir (Şekil 1) . Brüt analizinin bir örneği, akciğer dokusu içindeki tümör hücrelerini değerlendirmek için bir biyoışıldama görüntülemedir. Burad...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K Görüntüleme.  Medical University of South Carolina.  Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır. 

Video: Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Kanser Araştırmaları

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Nicelleştirilmesini Geliştirmek Için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Tıp

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için İn Vivo Görüntüleme

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Nicelleştirilmesini Geliştirmek Için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu