The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Not: Bu protokol Araştırma Sorumlu Davranış Arizona Ofisi Üniversitesi kuralları takip ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır 1. Zebra balığı Islahı ve Embriyo Bakım <ol><li> E3 embriyo orta 8 hazırlayın. 60x stok solüsyon To Make, 1.95 L ddiH 2 O. içinde 34.8 g NaCl, 1.6 gr KCI, 5.8 g CaCl2 ● 2H 2 O ve 9.78 g MgCl2 ● 6H 2 O çözülür DdiH 2 O. kullanarak 2 L ses seviyesini ayarlama NaOH ve HCI kullanılarak 7.2 pH ayarlayın </li><li> 1 L ddiH20 16,5 ml 60x stok sulandırmak, 1x E3 embriyo orta hazırlamak. 100 ul% 1 metilen mavisi ekleyin. </li><li> Yetiştirme <ol><li> Ev Erkek ve Dişi anaç (7 - yaş 18 ay) ayrı ayrı doğurganlığı artırmak için. </li><li> Yumurtalar istenen gün önce önce 2 saat - 1 ışıklarını kapatın. C - Set up çiftleşme (2 kadın 1 erkek ve 1)Rossing kafesleri, daha önce 9 nitelendirdi. Onlar yetişkin balıklar tutuldukları tank ucun delikli tabanı üzerinden geçerken yumurta predationu kaçmak için kapısı kafesleri izin verir. </li><li> İsteğe bağlı. Zamanlı ıslahı için, (morfolino enjeksiyonunu içeren çalışmalar için gerekli olacak gibi), şeffaf bir plastik bölücü erkek ve kadın balık ayırmak, yumurta ve gübreleme zamanlı döşenmesi sonucu sabah bu çıkartın. Morfolino çalışmalar için, tedavi başına gereken embriyonik balık sayısını değerlendirmek için güç hesaplamaları gerçekleştirmek. Etki ya da varyasyon büyüklükte bir tahmin olmaksızın, bir ön deneme, bir n = 8 ile çalıştırılabilir. </li></ol></li><li> (- 150 embriyolar / 10 cm petri 100) bir petri kabına geçiş kafesten yumurta dökün. Yumurta çanak dibe ve su kapalı dökmek için izin verin. Ince uçlu atılabilir transfer pipet kullanarak kalan suyu çıkarın. Adım 1.1 yapılan E3 embriyo orta geri ekleyin. </li><li> Af olunGelecekteki yumurta ve balık transferi için topal cilalı tek kullanımlık pipet. Makas kullanarak, 0.25 ml mezuniyet dereceli atılabilir bir transfer pipet kesti. Pürüzlü kenarları, alev lehçe Bunsen beki üzerinde kesik ucu kaldırın. </li><li> Zebra balığı E3 embriyo orta petri 28.5 ○ C&#39;de post-fertilizasyon 10 cm (dpf) 4 gün embriyonik balık koruyun Twice her gün, bir alev herhangi gübresiz yumurta veya ölü embriyolar (opak beyaz görünümü) kaldırmak için atılan transfer pipet mezun cilalı kullanın. Her gün bir kez, E3 embriyo orta yerine. Ince uçlu atılabilir transfer pipet kullanarak, kalan sıvıyı çıkarmak, E3 embriyo orta kapalı dökün ve önceden ısıtılmış (28.5 ○ C) E3 embriyo orta geri ekleyin. </li></ol> 2. Deney çözeltisi hazırlayın <ol><li> 0.22 uM filtre kullanılarak Tablo 1. Steril filtre deney solüsyonuna göre olan bir deney çözeltisi hazırlayın. Bir 28.5 ○ C steril tahlil çözümü, inisiyasyonu tahlil sıcak öncesindesu banyosu. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Toplam% </td><td> Cilt (ul / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embriyo Orta </td><td> 1,667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Çift deiyonize (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9623,3 </td></tr><tr><td> Alamar Mavisi </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 mM NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Analiz Ortamı 3. Testi gerçekleştirmek <ol><li> Zebra balığı embriyolar steril süzülmüş E3 embriyo orta ile 3 kez durulayın. Bir behere debriyaj tüm canlı zebrafish embriyolar birleştirin. Steril filtre 75 ml E3 embriyo orta. Ince bir ucu tek kullanımlık transfer pipet kullanarak yenidenmümkün olduğunca Zebra balığı embriyolarının gelen E3 embriyo orta kadar hareket ettirin. 20 ml steril süzülmüş E3 embriyo orta geri ekleyin. Çıkarın ve E3 embriyo orta 3 kez değiştirin. </li><li> 96-iyi siyah 93 kuyuların her birine Levha 1 balık net alt plaka taraflı. Alev plastik tek kullanımlık transfer pipet mezun cilalı içinde ayrı ayrı (1.5 adım) bir embriyo yakalama ve yavaşça kuyunun içine püskürtülmesiyle plakaya embriyonik balık aktarın. 3 boş kuyulara durulanır balık içeren beher alınan E3 embriyo orta aktarın. Bu boş kuyular balıklar içerdikleri kuyuların tam olarak aynı suya maruz kalmış olmasını sağlar. Balık ve boş kuyular içerirler Her iki kuyu, bu aşamada bitiminde (200 ul), en az ½ dolu olmalıdır. </li><li> Boş kuyular da dahil olmak üzere 96 kuyu, içinde tahlil çözeltisi ile E3 embriyo orta değiştirin. Bu kademe, bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde 12 her sütun için bir seferde 1 sütun yapılmalıdır. Ince ucunu kullanarak atılabilir transfer pipet, plakanın (8 kuyu) bir sütunda her kuyudan E3 embriyo orta kaldırmak. Zebra balığı embriyo dokunmayın özen gösterin. Su çıkarıldı kuyuya her deney çözeltisi 300 ul ekle. Plaka 12 sütunlar için tahlil çözümü ile E3 embriyo orta ve değiştirme kaldırılmasını tekrarlayın. </li><li> İsteğe bağlı: Bir bileşik cevaben metabolizma hızı değişikliği sınamak için, 100 kez (100X) istenen tedavi konsantrasyonu bir çözüm yapmak. Dikkat çekici bir şekilde, 100x çözeltisi,% 0.1 daha fazla nihai DMSO konsantrasyonunu sınırlandırmak için% 10 DMSO aşmamasını sağlamak. Tedavi bölümlerinin her birine 100x çözeltisi 3 ul ekleyin. NOT: Tedavi kuyu sayısını değerlendirmek için güç hesaplamaları gerçekleştirin. Bununla birlikte, yanıt veya varyasyonun büyüklükte bir tahmini olmadan, bir ön deneme tedavi 8 bileşiği ve balık içeren 8, araçla tedavi edilen kontrol oyuklarında çalıştırılabilir. <ol><li> (Kontrol hiçbir dru araç kontrolünün 3 ul ekleying tedavisi) balıklar içerdikleri kuyular. Bileşiğe fluoresan yanıt balıkta eylemlerinin bir sonucu olduğundan emin olmak için, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 3 Boş oyuklara ilaç ve araç tedavileri uygulanır. </li></ol></li><li> 590 nM&#39;de 530 nM uyarma dalga boyunda ve emisyon dalga boyu ile floresan plaka okuyucusu üzerinde balık dolu plaka okuyun. </li><li> Nemlendirilmiş inkübatör içine yerleştirin plakası 28.5 ○ C (tahlil çözeltinin photobleaching önlemek için tahlil boyunca karanlıkta plaka korumak) olarak ayarlanır. Deney 1 saat ila 24 saat arasında değişir zaman süreleri için çalıştırılabilir. Deneyin süresi çalışmanın amacı bağlıdır. Bir kısa süreli en uygun olabilecek bir kısa etkili olmayan kararlı bir bileşik yanıtı test için. Yine, stabil bir bileşik testleri veya genetik etkileri testleri için, deney süresi maksimize kümülatif sinyali ile ilgili avantajlar yararlanmak için tercih edilir. </li><li> Önceden belirlenmiş bir zaman noktasında (zamanlama belirlemenize yardımcı olması için 3.6 adıma bakınız)adım 3.5 ile aynı ayarlarla tekrar balık dolu plaka floresan okuyun. </li></ol> 4. Tedavi ile Floresans İlişkili Bağıl Değişim değerlendirin <ol><li> De çalışma sonucunda floresan zaman 0 floresan çıkarılarak her floresan değişimi hesaplanır. Balık (boşluklar) olmadan Wells balıklar içerdikleri kuyulardan uzak değerlerinin altında, 0&#39;a yakın değerlere sahip olmalıdır. Sonuca Floresans = Floresan değişim - Floresan 0 zamanında </li><li> Kontrol Kaynaklar akabinde kontrol kuyularının floresan ortalama değişiklik ile her çukurun fluoresans değişikliği bölmek için floresans nispi değişikliği tespit etmek için, floresans ortalama değişimi hesaplamak. Unutmayın ki, kontroller, araç kontrolleri veya genetik kontrolleri ya olabilir. <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li><li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter/driver+genes+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+engineering.">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545 (2014).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile.">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li><li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish.">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li><li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals.">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li><li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish.">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish, A practical approach. , (2002).</li><li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature.">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li><li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity.">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li><li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost.">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li><li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner.">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li><li>Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549 (2012).</li><li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+obesogenic+test:+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity.">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Bakteri veya mantar ile kontaminasyon büyük ölçüde bu testin uygulanmasını sınırlayacaktır. E3 embriyo orta metilen mavisi fungal bulaşma olasılığını sınırlandırır. Embriyo boyunca bu bakım iki kez her gün ölü embriyolar kaldırmak için alınması çok önemlidir yetiştirme. Buna ek olarak, iyice deney başlatma gün steril E3 embriyo ortamı ile embriyolar durulanması gereklidir. Bu 2 adım embriyoların bakteriyel kontaminasyon potansiyelini sınırlar. Aşama 3.2 &#39;de tarif edilen Boş o...

Fare şu anda obezite araştırmaları için baskın modeldir. Kısa nesil aralığı ve fare kullanılabilir genetik araçları bugüne kadar eşsiz olmuştur. Ancak, Zebra balığı da kısa bir nesil aralığı vardır (3-4 ay) ve genetik manipülasyon 1,2 kolaylığı hatta fare geçti. Kadar genetik ve ilaç ekranlar 3 kullanım için yavruları ve potansiyeli sayıda fare üzerinde gerçekleşmiştir zebra balığı memeli genlerinin yaklaşık% 90 tutar. Obezitede çalışmalar için zebrabalıkları modelinin potansiyelini, tahliller enerji harcaması da dahil olmak üzere vücut ağırlığı regülasyonu, etkileyen faktörleri araştırmak amacıyla geliştirilmesi gerekmektedir. Metabolitler β-oksidasyon ve trikarboksilik asit döngüsü oksijenle işlenir zamanda tüketilir ve NADH 2 üretilir. Bu nedenle, NADH 2 metabolik yolların (metabolit oksidasyonu) ile metabolitlerin akış doğrudan bir göstergesidir. Poikil olarakhomotermlere 4 5&#39;ten kat daha düşük - otherms, H +, ATP sentezi gelen NADH 2 oksitlenmeyi koparan 4&#39;tür iç mitokondrial membran aracılığıyla kaçak. Bu duruma göre, zebra balığı NADH 2 çok sıkı bir şekilde, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimi ile bağlantılıdır. Bu yazıda, enerji harcaması 5 için bir proxy olarak larva Zebra balığı NADH 2 üretimini ölçen bir tahlil açıklar. Oksijen tüketimi enerji tüketimini ölçmek için altın standarttır. Ancak, en iyi zebrafish yüksek verimlilik potansiyelinin yararlanmak, enerji harcama tahliller yüksek verimlilik için uygun olmalıdır. Sirkülasyon sistemi, kapalı bir bölme bağlıdır Oksijen tüketimi sistemleri 6 mevcuttur bölmelerin sayısına göre hacmi sınırlıdır. Açık hava O 2 tüketimi / CO2 üretim deneyleri de zebrabalıkları 5,7 uygulanmıştır. Bu açık hava 96 oyuklu levha temeld sistemleri, yüksek verim için uygun. Ne yazık ki, çevre ile gaz değişimi Bu tahlillerin duyarlılığını sınırlar. Biz son zamanlarda redoks göstergesi AlamarBIue 5 ile NADH 2 izler bir testin uygulanmasını yayınladı. Bu deney hacmi ve zebrabalıkları oksijen tüketimi analizler için ortak hassasiyetindeki sınırlamaların üstesinden gelmektedir. Zebra balığı tüm vücut enerji homeostazı çalışmaları için giderek önemli bir model haline geliyor. Bölümünde, Zebra balığı nedeniyle ileri genetik ekranlar ve ilaç ekranlarında kullanmak için uygun. Ayrıca, demonte ve knock-in, hızlı bir şekilde uygulanabilir dahil genetik manipülasyon hedef aldı. Daha önce bu deney bileşikleri ve metabolik oranı 5 değiştiren genleri tanımlamak için banyo ilaç uygulaması ve genetik devirme veya nakavt ile kombine edilebilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bu deney zebrabalıkları doğasında yüksek kapasiteli avantajları yararlanmak için tasarlanmıştır. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Black sided clear bottom 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Manufactured by E&amp;amp;K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput danio rerio energy expenditure assay

Zebra balığı Zebra balığı, enerji homeostazı ve obezite çalışma için yaygın olarak uygulanan bir model yapmak potansiyeline sahip doğal avantajları ile önemli bir model organizma vardır. Embriyolardaki deneyler, 96 veya 384 oyuklu plaka formatmda gerçekleştirilir edilmesi için zebrabalıkları küçük boyutu sağlar Morfolino ve CRISPR tabanlı teknolojiler banyo uygulaması tarafından genetik manipülasyon kolaylığı ve ilaç tedavisi iyileştiren yaşayabilir olduğunu. Ayrıca, Zebra balığı roman gen keşfi için izin ileri genetik ekranlar için idealdir. Obezite için bir model olarak zebrafish göreceli yenilik göz önüne alındığında, tam bu faydaları istismar araçları geliştirmek için gereklidir. Burada, aynı zamanda embriyonik zebrafish binlerce enerji harcanmasını ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz, bireysel balık izole etmek için, 96 gözlü levhalar kullanan bir bütün hayvan mikroplaka platformu geliştirdik ve ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü canlılığı yeniden hesaplanan toplam NADH 2 üretimini değerlendirmekAjan AlamarBIue. Poikilotherms NADH 2 üretim ve enerji tüketimi arasındaki ilişki sıkıca bağlanır. Bu enerji harcaması tahlil hızla doğrudan enerji tüketimini değiştirmek veya uygulamalı ilaç (örn insülin duyarlılığını) yanıtı değiştirebilir farmakolojik veya genetik manipülasyonlar taramak için potansiyel oluşturur.

Deney çözeltisi embriyonik balık (Şekil 1) yokluğunda floresansında bir artış meydana gelmez. Ancak, tahlil kuyunun içinde metabolizma hızı küçük değişikliklere karşı çok duyarlıdır. Bir kuyunun içinde bir tek balık 1 saat (p &lt;0.0001) içinde boş kuyulardan önemli ölçüde farklı bir sinyal oluşturur. 2 kuluçkadan 24 saat sonra embriyonik balıklar tarafından üretilen sinyallerin görsel temsilini sağlar Şekil. Bu resmin amacı için ...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay at JoVE.com

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Yüksek Verimli<em&gt; Danio rerio</em&gt; Enerji Harcaması Deneyi

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

12.6K Görüntüleme.  Vanderbilt University Medical Center. Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery. 

Video: High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Genetik

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Davranış

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Nörobilim

<meta charset="utf8"></head><body>Fırça Kertenkele Karaciğer Mitokondrisinde Mitokondriyal Fonksiyonel Değerlendirme

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of metabolic pathways. Therefore, experimentally assessing mitochondrial functionality can provide insight into variations among different populations or disease states. Additionally, it is valuable to assess whether isolated mitochondria are healthy enough to proceed with experiments. One characteristic often used to compare mitochondrial function in different samples is the rate of oxygen consumption. Oxygen consumption and subsequent calculation of the respiratory control ratio in either intact cells or mitochondria isolated from tissue can serve all three purposes. Using mitochondria isolated from the livers of brush lizards in conjunction with a phosphorescent probe that is sensitive to the fluctuations in oxygen concentration of a solution, we measured oxygen consumption using a fluorescent plate reader. This method is not only quick and efficient but also can be conducted with a small amount of mitochondria and without the need for specialized equipment. The step-by-step protocol described here increases the accessibility of mitochondrial functional assessment to researchers.

<meta charset="utf8"></head><body>Mitokondriyal Oksijen Tüketiminin Plaka Okuyucu Tabanlı Floresan Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Assessment of oxygen consumption provides integral information about mitochondrial function. Using a phosphorescent probe with a fluorescent plate reader, accurate and reproducible data can be obtained easily without specialized equipment. This assay enables any lab to measure the oxygen consumption of isolated mitochondria and calculate respiratory control ratios.

Mitokondriyal Oksijen Tüketiminin Plaka Okuyucu Tabanlı Floresan Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of ...

Biyokimya

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Yüksek Verimli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için

Mitokondriyal Oksijen Tüketiminin Plaka Okuyucu Tabanlı Floresan Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Mitokondriyal Oksijen Tüketiminin Plaka Okuyucu Tabanlı Floresan Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Mitokondriyal Oksijen Tüketiminin Plaka Okuyucu Tabanlı Floresan Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi