The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Nota: Este protocolo segue as diretrizes da Universidade do Arizona Gabinete de Conduta Responsável em Pesquisa e foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional 1. Criação de peixe-zebra e Embryo Manutenção <ol><li> Prepare meio embrião E3 8. Fazer 60x solução estoque, dissolver 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl2 ● 2H 2 O, e 9,78 g de MgCl2 ● 6H 2 O em 1,95 L ddiH 2 O. Ajustar o pH para 7,2 usando NaOH e HCl Ajustar o volume para 2 L, utilizando ddiH 2 O. </li><li> Para preparar o meio embrião E3 1x, diluir 16,5 ml 60x estoque em 1 L ddiH20. Adicionar 100 mL de 1% de azul de metileno. </li><li> Reprodução <ol><li> Casa Masculino e Feminino reprodutores (7 - 18 meses de idade) separadamente para maximizar a fecundidade. </li><li> Desligue as luzes 1 - 2 horas antes, no dia anterior ovos são desejados. Configure o acasalamento (1 macho e 1 - 2 fêmeas) em cgaiolas Rossing 9 como previamente descrito. Cruzando gaiolas para permitir que os ovos a predação escapar à medida que passam através da base perfurada da peça inserta na qual o tanque de peixes adultos são realizadas. </li><li> Opcional:. Para reprodução programada, (como seria necessário para estudos envolvendo morfolino injeção), separe a peixes machos e fêmeas por um divisor de plástico transparente, Remover esta manhã para resultar na colocação cronometrado dos ovos e fertilização. Para morfolino estudos, realizar cálculos de energia para avaliar o número de peixes embrionário exigido por tratamento. Sem uma estimativa da magnitude do efeito, ou variação, um ensaio preliminar pode ser executado com uma N = 8. </li></ol></li><li> Despeje os ovos a partir do cruzamento de gaiola em uma placa de Petri (100 - 150 embriões / 10 centímetros placa de Petri). Permita que os ovos se depositam no fundo do prato e despeje a água. Retire toda a água restante usando uma ponta fina transferência descartável da pipeta. Adicionar costas meio E3 embrião feita na etapa 1.1. </li><li> Faça afpipeta descartável polido lame para o ovo futuro e transferência de peixes. Com uma tesoura, corte uma pipeta de transferência descartável formado pela graduação de 0,25 ml. Para remover arestas, polonês chama a ponta corte sobre um bico de Bunsen. </li><li> Manter peixes embrionárias para 4 dias após a fertilização (DPF) em 10 cm placas de Petri em meio E3 embrião de peixe-zebra a 28,5 ○ C. Duas vezes por dia, use uma chama polido formou pipeta de transferência descartável para remover quaisquer ovos não fertilizados ou embriões mortos (aparência branca opaca). Uma vez por dia, substitua meio embrião E3. Deitar fora meio embrião E3, remover o líquido restante usando uma ponta fina transferência descartável da pipeta, e adicionar novamente pré-aquecido (28,5 ○ C) meio embrião E3. </li></ol> 2. Preparar a Solução de Ensaio <ol><li> Preparar a solução de ensaio de acordo com a Tabela 1. Solução de ensaio de filtração estéril utilizando um filtro de 0,22 um. Antes do ensaio de iniciação, aquecer a solução de ensaio estéril numa 28,5 ○ Cbanho d&#39;água. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> % Do Total </td><td> Volume (mL / 10 mL) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embryo Médio </td><td> 1.667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Duplo deionizada (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9623,3 </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 mM de NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0,1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Ensaio Médio 3. Execute Assay <ol><li> Enxágüe embriões de peixe-zebra 3 vezes com meio embrião E3 filtrada estéril. Misture todos os embriões de peixe-zebra viáveis ​​do embreagem para um copo. Filtro estéril 75 ml meio embrião E3. Usando uma ponta fina transferência descartável pipeta, remover-se tanto a forma de embrião E3 a partir dos embriões de peixe-zebra quanto possível. Adicionar 20 ml de volta médio embrião estéril filtrada E3. Remover e substituir meio embrião E3 3 vezes. </li><li> Placa 1 peixe para cada um dos 93 poços de uma de 96 poços preto sided placa clara de fundo. Transferir o peixe embrionária para a placa de captura individualmente por um embrião dentro de uma chama de plástico graduado lustrado pipeta descartável (passo 1.5) e ejectar suavemente para dentro do poço. Transferir meio embrião E3 retirado da proveta contendo os peixes enxaguado em 3 poços em branco. Isto assegura que os poços em branco foram expostas a água da mesma exacta como os poços que contêm peixes. Ambos os poços que contêm peixes e poços de branco deve ser de, pelo menos, ½ completo (200 ul) à conclusão deste passo. </li><li> Substituir meio embrião E3 com solução de ensaio em todos os 96 poços, incluindo poços em branco. Esta etapa deve ser realizada uma coluna de cada vez para cada uma das 12 colunas de uma placa de 96 poços. Usando uma ponta fina descartável transfer pipeta, remover o meio embrião E3 de cada poço numa coluna de a placa (8 poços). Tome cuidado para não tocar o embrião de peixe-zebra. Adicionar 300 ul de solução de ensaio a cada poço a partir do qual a água foi removida. Repetir a remoção do meio de embrião E3 e substituição com a solução de ensaio para todas as 12 colunas da placa. </li><li> Opcional: Para testar a alteração da taxa metabólica em resposta a um composto, fazer uma solução que é 100 vezes (100X) a concentração de tratamento desejado. De nota, assegurar que a solução 100x não exceda 10% DMSO para limitar a concentração de DMSO final a não mais do que 0,1%. Adicionar 3 mL da solução de 100x a cada um dos poços de tratamento. NOTA: Executar cálculos de potência para avaliar o número de poços de tratamento. No entanto, sem uma estimativa da grandeza da resposta ou variação, um ensaio preliminar pode ser executado em 8 tratado com composto e 8 tratados com veículo poços de controlo que contêm peixes. <ol><li> Adicionar 3 mL de controlo do veículo para o controlo (sem Drutratamento g) poços que contêm peixes. Para assegurar que a resposta ao composto fluorescente é um resultado das acções dentro do peixe, aplicam-se tratamentos com drogas e 3 do veículo para poços em branco em placa de 96 poços. </li></ol></li><li> Leia peixes cheio placa fluorescente leitor de placas com comprimento de onda de excitação a 530 nm e comprimento de onda de emissão a 590 nm. </li><li> Colocar a placa na incubadora umidificado definida para 28,5 ○ C (placa de manter na escuridão durante todo ensaio para evitar a fotodegradação de solução de ensaio). O ensaio pode ser executado por períodos de tempo que variam desde 1 h a 24 h. A duração do ensaio depende do objectivo do estudo. Para testar a resposta de um composto não-estável de curta duração de curta duração pode ser mais adequado. No entanto, para os testes composto estável ou testes de efeitos genéticos, maximizando a duração do ensaio é preferível explorar as vantagens associadas com o sinal cumulativo. </li><li> Em um ponto de tempo pré-determinado (veja o passo 3.6 para ajudar a determinar sincronismo)leia fluorescência de placa cheio de peixe novamente com as mesmas configurações do passo 3.5. </li></ol> 4. Avaliar a mudança relativa na fluorescência associada ao tratamento <ol><li> Calcular alteração na fluorescência de cada cavidade subtraindo a fluorescência no tempo 0 da fluorescência após a conclusão do estudo. Wells sem peixe (espaços em branco) deverá ter valores próximos de 0, muito abaixo dos valores dos poços que contêm peixe. Alteração na fluorescência = Fluorescência na conclusão - fluorescência no tempo 0 </li><li> Para determinar a alteração relativa da fluorescência, calcular a variação média da fluorescência para os poços de controlo, em seguida, dividir a alteração na fluorescência de cada poço pela variação média da fluorescência dos poços de controlo. De nota, controles poderia ser ou comandos do veículo ou controles genéticos. <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

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	<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li><li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter/driver+genes+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+engineering.">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545 (2014).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish.">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li><li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals.">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li><li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish.">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish, A practical approach. , (2002).</li><li>Fry, F. E. J., Hart, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost.">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li><li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner.">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li><li>Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549 (2012).</li><li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+obesogenic+test:+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity.">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

A contaminação com bactérias ou fungos limita grandemente a aplicação deste ensaio. O azul de metileno no meio embrião E3 limita a possibilidade de contaminação por fungos. Ao longo embrião criação é fundamental que o cuidado é tomado para remover embriões mortos duas vezes por dia. Além disso, é essencial para lavar cuidadosamente os embriões com meio embrião E3 estéril no dia do início do ensaio. Estes passos 2 limitar o potencial para a contaminação bacteriana dos embriões. A inclusão de poço...

O mouse é atualmente o modelo predominante para a investigação de obesidade. O curto intervalo de geração e ferramentas genéticas disponíveis no rato têm sido inigualável até à data. No entanto, o peixe-zebra também tem um intervalo de geração curto (3 - 4 meses) e supera até mesmo o mouse na facilidade de manipulação genética 1,2. O peixe-zebra mantém quase 90% de genes de mamíferos, enquanto ultrapassando o mouse no número de descendentes e potencial para uso em telas genéticos e medicamentos 3. Para explorar o potencial do modelo peixe-zebra para estudos em obesidade, os ensaios devem ser desenvolvidos para investigar os fatores que influenciam a regulação do peso corporal, incluindo as despesas de energia. Como metabolitos são processados ​​através β-oxidação e o ácido tricarboxílico ciclo oxigénio é consumido NADH e 2 é produzido. Assim, NADH 2 é um indicador directo do fluxo de metabolitos através de vias metabólicas (oxidação metabolito). Em poikilotherms, H + vazar através da membrana mitocondrial interna, que desacopla o NADH 2 de oxidação a partir da síntese de ATP, é de 4 - 5 vezes menor do que em homeotérmicos 4. Assim, em NADH 2 peixe-zebra é muito bem ligados à produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Aqui, descrevemos um ensaio que mede a produção de NADH 2 em zebrafish larval como um proxy para o gasto energético 5. O consumo de oxigênio é o padrão ouro para medir o gasto de energia. No entanto, para melhor aproveitar o potencial de alto rendimento do peixe-zebra, ensaios de gasto de energia devem ser passíveis de high-throughput. Sistemas de consumo de oxigênio que dependem de uma câmara fechada, sistema de circulação são limitados em taxa de transferência pelo número de câmaras disponíveis 6. Open air consumo de O 2 / CO 2 ensaios de produção também foram aplicadas no peixe-zebra 5,7. Estes ar livre de 96 poços placa de baseD Systems são passíveis de alto rendimento. Infelizmente, as trocas gasosas com o ambiente de limites de sensibilidade destes ensaios. Nós publicada recentemente a aplicação de um ensaio que monitora NADH 2, utilizando o indicador redox alamarBlue 5. Este ensaio supera as limitações na taxa de transferência e sensibilidade comum às análises de consumo de oxigênio no peixe-zebra. O peixe-zebra está se tornando um modelo cada vez mais importante para estudos da homeostase energética do corpo inteiro. Em parte, por causa do peixe-zebra são passíveis de uso em telas genéticos para a frente e telas de drogas. Além disso, orientada manipulação genética, incluindo knockdown e knock-in, pode ser aplicada rapidamente. Nós mostramos anteriormente que este ensaio pode ser combinado com a aplicação de drogas e banho de knockdown ou nocaute genético para identificar compostos e genes que alteram a taxa metabólica 5. Além disso, este ensaio foi concebido para explorar as vantagens de elevada capacidade inerentes ao peixe-zebra. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Black sided clear bottom 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Manufactured by E&amp;amp;K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput danio rerio energy expenditure assay

Peixe-zebra são um modelo importante organismo com vantagens inerentes que têm o potencial para fazer zebrafish um modelo amplamente aplicado para o estudo da homeostase da energia e da obesidade. O pequeno tamanho do peixe-zebra permite ensaios sobre os embriões para ser conduzido num formato de placa de 96 ou 384 poços, morfolino e tecnologias baseadas CRISPR promover a facilidade de manipulação genética, e no tratamento de droga por aplicação de banho é viável. Além disso, peixe-zebra são ideais para telas genéticos para a frente, permitindo a descoberta do gene para a novela. Dada a relativa novidade do peixe-zebra como um modelo para a obesidade, é necessário desenvolver ferramentas que exploram plenamente esses benefícios. Aqui, nós descrevemos um método para medir o gasto de energia em milhares de peixes-zebra embrionária simultaneamente. Nós desenvolvemos uma plataforma de microplacas animal completo no qual usamos placas de 96 poços para isolar cada peixe e avaliar cumulativa de produção de NADH usando a 2 disponível comercialmente cultura celular viabilidade reagente alamarBlue. Em poiquilotérmicos a relação entre NADH 2 produção e gasto de energia está intimamente ligado. Este ensaio gasto energético cria o potencial para a tela rapidamente manipulações farmacológicas ou genéticas que alteram diretamente o gasto de energia ou alteram a resposta a um fármaco aplicada (por exemplo, sensibilizadores de insulina).

Solução de ensaio não aumenta de fluorescência na ausência de peixe embrionário (Figura 1). No entanto, o ensaio é altamente sensível a pequenas alterações na taxa metabólica dentro do poço. Um peixe dentro de um único poço cria um sinal significativamente diferente de poços em branco dentro de 1 h (P &lt;0,0001). A Figura 2 proporciona uma representação visual de sinais gerados pelo peixe embrionário após 24 h de incubação. Para a finalidade da imagem foram usadas ...

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High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

12.6K visualizações.  Vanderbilt University Medical Center. Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery. 

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Genética

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval</

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurociência

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação Funcional Mitocondrial em Mitocôndrias de Fígado de Lagarto

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of metabolic pathways. Therefore, experimentally assessing mitochondrial functionality can provide insight into variations among different populations or disease states. Additionally, it is valuable to assess whether isolated mitochondria are healthy enough to proceed with experiments. One characteristic often used to compare mitochondrial function in different samples is the rate of oxygen consumption. Oxygen consumption and subsequent calculation of the respiratory control ratio in either intact cells or mitochondria isolated from tissue can serve all three purposes. Using mitochondria isolated from the livers of brush lizards in conjunction with a phosphorescent probe that is sensitive to the fluctuations in oxygen concentration of a solution, we measured oxygen consumption using a fluorescent plate reader. This method is not only quick and efficient but also can be conducted with a small amount of mitochondria and without the need for specialized equipment. The step-by-step protocol described here increases the accessibility of mitochondrial functional assessment to researchers.

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial usando um ensaio fluorescente baseado em leitor de placas

Assessment of oxygen consumption provides integral information about mitochondrial function. Using a phosphorescent probe with a fluorescent plate reader, accurate and reproducible data can be obtained easily without specialized equipment. This assay enables any lab to measure the oxygen consumption of isolated mitochondria and calculate respiratory control ratios.

Avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial usando um ensaio fluorescente baseado em leitor de placas

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of ...

Bioquímica

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

High Throughput

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