Name: isolation and cryopreservation of neonatal rat cardiomyocytes
Uploaded: 2015-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor&#8217;s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.

Aşağıdaki protokol, yenidoğan sıçan yavrularından (10-14 yavrular) bir çöp den, kardiyomiyositler izolasyonu için tasarlanmıştır. Çöp boyutu önemli ölçüde farklı ise, prosedür telafi etmek ölçekli gerekebilir. yavrular etrafında 48 ± 6 saat eski olmalıdır. Tüm işlemler Burada North Carolina State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Hücre İzolasyonu hazırlanması NOT: izolasyon önce aşağıdaki adımları uygulayın gün. <ol><li> Büyük makas, küçük makas, küçük keskin forseps, büyük forseps: Aşağıdaki otoklavlayın. 121 ° C, en az 30 dakikalık bir kuruma süresi 60 dakika boyunca yerçekimi döngüsü kullanın. </li><li> / N O çözülme buzdolabı içinde% 0.1 tripsin solüsyonu 40 ml yerleştirin. Buzdolabında Hank&#39;in Dengeli Tuzları Çözüm (HBSS) zaten soğuk değilse. % 20 fetal sığır serumu (FBS), hisse senedi ortam çözeltisi hazırlayın. <ol><li> Isc&#39;den 400 ml&#39;likOve&#39;nin Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM) içinde 100 ml FBS, 5 mi, L-glutamin (200 mM), 2.5 mi gentamisin (10 mg ml-1) ve 0.9 ml 2-merkaptoetanol ekleyin. Vakum filtre kullanarak sterilize. Mağaza kadar 3 hafta boyunca 4 ° C&#39;de medya ve bu küçük veya daha büyük hacimler için ölçeklenebilir. % 10 FBS NRCM medya üretmek için IMDM ile 1:% 20 FBS stok Ortamı 1 seyreltin. Sadece tekrarlanan ısıtma ve medya soğumasını önlemek için küçük gruplar halinde olun. </li></ol></li></ol> 2. Hücre İzolasyonu 1. Gün <ol><li> Numunelerin kirlenmesini önlemek için kültür kaputu aşağıdaki çalışmaları yapınız. Bir O / N inkübasyon orada beri en iyi zamanlama için öğleden sonra bu işe başlamak. </li><li> Steril bir kültür kaput içinde çalışma alanını hazırlayın. Kültür kaputu tezgah yastık yerleştirin. % 70 etanol ile iki adet 250 ml&#39;lik beher doldurun ve onları cerrahi aletleri yerleştirin. Kaputu buz küçük kova yerleştirin. Birkaç tüpleri ve 150 mm çanak tutmak için yeterince büyük olduğundan emin olun. Fo kaputu sterilize UVR 10 dk. Buz üzerinde 40 mi% 0.1 tripsin yerleştirin. </li><li> Anneden yenidoğan sıçan yavrular alın. Kullanılıncaya kadar sıcak hayvanları tutmak için, böyle sıcak tutmak için bir tezgah pad sarılmış bir buz kovası olarak yalıtılmış bir kap koyun. </li><li> 25 mi HBSS ile 150 mm kültür çanağı doldurun ve buz üzerine yerleştirin. Unwrap 2-3 gazlı bez ve çalışma alanında yer. Boyun arkasındaki cilt tarafından yavru tutarak, kaputun içinde% 70 etanol ve yer ile sprey. NOT: En iyi sterilite korumak için, bu daha sonra kaputu temizlenmiş yavru yerleştirir başka bir kişi tarafından yapılabilir olduğunu. </li><li> Boyun arkasındaki cilt tarafından yavru tutun. Sonra başları kesilerek euthanize bir hızlı, güçlü kesim, büyük makas kullanarak. Gazlı bez ile kan kurulayın. NOT: IACUC gereksinimleri değişimlerine, bir etanol ile yavru temizlemek için daha uygun olabilir nedeniyle onu püskürtme yerine silin. Bu adım için kendi kurallarına gibi üniversite IACUC ile kontrol ettiğinizden emin olun. </li><li> Ch ön tarafı aşağı kesim Devamgöğüs kafesi üzerinden est. Kalp görünür kadar göğüs kafesi açmak yardımcı olmak için boyun cildi sıkın. Küçük makas kullanarak, buz üzerinde HBSS kültür çanak kalp ve yer çıkarın. Diğer yavrular için tekrarlayın. </li><li> Örneklerden olmayan kalp dokusu çıkarın ve kalpleri yıkamak için hafifçe HBSS girdap. Taze HBSS içeren başka kültür çanak kalp dokusu aktarın ve daha doku yıkayın. Adet 1-3 mm 3 kadar daha doku kesin, ve sonra tripsin solüsyonu transfer. 4 ° C soğutma O / N rocker üzerinde tripsin çözüm yerleştirin. </li></ol> Hücre İzolasyonu 2. Gün Not: Aşağıdaki adımlarda aspire ederken, bir vakum hattı yerine bir pipet kullanın. Doku kolayca hareket, ve bir vakum hattı yapışmasına veya hücreleri içeren hala doku kaldıracaktır. Bunun yerine aspirasyon için bir pipet kullanmak en iyisidir. Doku pipet girerse, pipet çıkarmak için dışarı geri. <ol><li> T yap% 10 NRCM Medya ANTE&#39;lerin alikotları: 15 ml, 25 ml, bir ve iki. 37 ° C su banyosunda medyanın bir 25 ml&#39;lik tüp yerleştirin. 5 farklı 15 ml konik tüplere 4 mi HBSS ekleyin ve buz üzerinde her yerleştirin. Her 15 ml tüp # 1-5 Etiket. </li><li> 50 ml&#39;lik bir konik tüp, 40 ml HBSS ekleyin. HBSS 10 ml askıya, pipet kollajenaz ekle, ve 50 ml 1 mg ml -1 kollajenaz çözüm oluşturmak için çözümler birleştirir. 0.22 mikron vakum filtre kullanılarak sterilize ve oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Kalp dokusu / tripsin tüp alın. Emin olun tripsin açıktır, ve doku kabarık görünür. Doku tüp ve aspirat köşesine kadar sıvı mümkün olduğunca yerleşmek için izin verin. </li><li> Elle tüp ve girdap 25 ml sıcak% 10 FBS NRCM medya ekleyin. Kap ve 2 dakika için 37 ° C su banyosu içinde döner. Yine aspire sıvı. Doku bu aşamada yüzer gerekir; eğer öyleyse, tüpün dibinden aspire. </li><li> 10 mi kolajenaz ekleyin. 2 dakika boyunca ya da çözelti, bulanık olana kadar su banyosunda döndürün. Quickly sıvı aspire. Doku içeren bir tüpe 10 ml taze kolajenaz ilave edin ve 2 dakika boyunca bir su banyosu içinde döner. Pipet, tüp # 1 transfer çözüm karıştırmak ve buz üzerinde yerleştirmek için. Bu sıvının kaldırmak mümkün olmayabilir. Dier üç 15 ml konik tüpler için 3,2-3,6 adımları. Tüp # 5 kalan sıvı aktarın. </li><li> Santrifüj 8 dakika 410 RCF 15 ml tüpler. Santrifüj birlikte, su banyosu içinde, 15 ml% 10 FBS NRCM ortam tüp yerleştirin. 40 mikron hücre 50 ml&#39;lik konik tüp üstünde süzgeç ve 2 ml soğuk HBSS ile ıslak yerleştirin. </li><li> Aşağı bükülmüş hücrelerden aspire süpernatant. Her bir tüp ve tekrar süspansiyon 6 ml soğuk HBSS ekleyin. 50 ml&#39;lik konik içine süzgecinden Pipet hücre süspansiyonları herhangi bir doku kaldırmak için. 3 ml soğuk HBSS her 15 ml tüp kenarlarını durulayın ve süzgeç ekleyin. 10 dakika boyunca 410 RCF Santrifüj hücreleri. Süpernatant aspire. T-75 şişeye 10 mi% 10 FBS NRCM ortam transfer içinde süspanse hücre topağı. 5ml medya ile konik durulayın ve fl eklemeksormak. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin. Su banyosu içine son 15 ml% 10 FBS NRCM medya tüpü yerleştirin. T-75, yeni bir T-175 balonuna içeriğini aktarın 15 mi ortam ile T-75 durulama ve T-175 ilave edin. 1 saat süre ile inkübe edilir. </li></ol> 4. Kriyoprezervasyon <ol><li> Buz medya dondurma yerleştirin. T-175-50 ml konik tüp hücre ortamı aktarın ve hücre Tripan mavisi kullanarak sayılması için hücre süspansiyonu 10 ul toplamak. 5 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Santrifüj sırasında, bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Ml başına 2-4000000 hücre konsantrasyonunda ortam donma aspire kültür ortamı, ve tekrar süspansiyon hücreleri. Kriyojenik şişe içinde hücre süspansiyonu 1 ml yerleştirin ve yer -80 ° C dondurucu O / N kontrollü soğutma kabı donma hızı ve yer şişeler. 1-2 gün sonra, sıvı azot içinde şişeleri aktarın. </li></ol> 5. Çözülme Hücreler <ol><li> 250 ul çözerek fibronektin içinde Coat çanak60; 9.75 ml su (nihai konsantrasyon 0.025 mg ml -1) içine fibronektin (stok konsantrasyonu 1 mg ml -1) olarak. Kültürü plakası kapağı ve en az 30 dakika boyunca 37 C &#39;de inkübe etmek yeterli bir çözüm ekleyin. <ol><li> 20% Medya DMSO ekleyerek aşağıdaki gibi dört 15 ml konik tüplerde, DMSO / medya karışımları yapmak. 500 ul DMSO ile (% 5) 9.5 ml ortam ekleyin. 250 ul DMSO ile (% 2.5), 9.75 mi ortam ekleyin. 10 ml medya (bu iki yapmak) ekleyin. </li></ol></li><li> 37 ° C su banyosu içinde yukarıda belirtilen ortam karışımları ısıtın. Sıvı azot hücreleri çıkarın ve kuru buz üzerinde yerleştirin. Medya karışımlar sıcak olduğunda sadece çözülmüş kadar, 37 ° C su banyosunda hücreleri eritin. Bu hücrelere zarar verebilir gibi çok uzun süre su banyosunda hücreleri bırakmayın. </li><li> % 5 DMSO / ortam tüpüne kriyojenik bir şişenin muhtevasının aktarın. 8 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Hücre pelet bırakarak aspire süpernatant. % 2.5 DMSO / medya tüpünün içeriği pelet ve r hücre ekleesuspend. 8 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Hücre pelet bırakarak aspire süpernatant. </li><li> Pelet ve tekrar süspansiyon hücre, bir 0% DMSO / medya tüpünün içeriğini ekleyin. 8 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Hücre pelet bırakarak aspire süpernatant. </li><li> Hücre pelet ve tekrar süspansiyon ikinci 0% DMSO / medya içeriğini ekleyin. Hücre sayımı için küçük bir örnek alın. 8 dakika boyunca 410 RCF santrifüjleyin. Bir hematositometrede santrifüj sayısı hücreleri Tripan Blue kullanırken ölü hücreleri etiketlemek için. Tutanak hücre miktarı, yanı sıra canlılık. </li><li> Hücre pelet bırakarak aspire süpernatant. % 10 NRCM medyada süspanse (opsiyonel: 100 mcM bromodeoxyuridine (BrdU) ekleyin) fibronektin-kaplı yemekleri ve plaka hücreleri. </li></ol> 6. Hücre Kültürü <ol><li> Cm 2 başına yaklaşık 100k hücre Plaka hücreleri. Kültür kullanım amacına göre kaplama yoğunluğu ayarlayın. 1:10 oranında IMDM içerisinde% 20 Ortamı seyreltilmesi ile% 2 NRCM ortamı hazırlar. Aşağıdaki tipik bir kültürün bir taslaktır. &lt;/ Li&gt; <li> 1 gün, uzak, sıcak IMDM ile ölü hücreleri yıkayın% 10 NRCM (isteğe bağlı 100 mcM BrdU) ekleyin. 2 gün, uzak, sıcak IMDM ile ölü hücreleri yıkayın% 10 NRCM ekleyin. Gün 3-eklemek% 2 NRCM. 4 gün% 2 NRCM ekleyin. 5. günde hücreler belirsiz ve dayak olduğundan emin olun. Yaklaşık bir hafta boyunca kültür içinde hücreleri koruyun. Bu noktada fibroblastlar anlamlı NRCMs büyümek başlayabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+Induce+Ectopic+Activity+in+Cardiac+Tissue.">Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue.</a> Circulation Research. 101, 755-758 (2007).</li><li>Simpson, P., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+myocytes+in+single+cell+cultures+with+and+without+proliferating+nonmyocardial+cells.+Cross-striations,+ultrastructure,+and+chronotropic+response+to+isoproterenol.">Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol.</a> Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).</li><li>Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines.">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li><li>Rohr, S., Fl&#252;ckiger-Labrada, R., Kucera, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographically+defined+deposition+of+attachment+factors+as+a+versatile+method+for+patterning+the+growth+of+different+cell+types+in+culture.">Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture.</a> Pfl&#252;gers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).</li><li>Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+enrichment+of+functional+cardiomyocytes+using+microfluidic+deterministic+lateral+flow+displacement.">Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement.</a> PloS One. 7 (5), e37619 (2012).</li><li>Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+cardiac+myocyte+cultures+by+surface+microtopography.">Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).</li><li>Fu, J. -. D., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+developmental+regulation+of+Ca2++transients+and+contraction+in+cardiomyocytes+derived+from+embryonic+stem+cells.">Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).</li><li>Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Functional+sarcoplasmic+reticulum+for+calcium+handling+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+insights+for+driven+maturation.">a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation.</a> Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+temperature+range+for+low-temperature+preservation+of+dissociated+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes.</a> Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).</li><li>Miyamura, K., Nagayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viability+of+cryopreserved+rat+cardiac+myocytes+and+effects+of+dimethyl+sulfoxide+concentration+on+cryopreservation.">Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation.</a> Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).</li><li>Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+bioenergetics+and+utilization+in+safety+screening.">Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening.</a> Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).</li><li>Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+conditions+for+heart+cell+cryopreservation+for+transplantation.">Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).</li><li>Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines.">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li><li>Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=array+analysis+of+cell+cycle+protein+changes+during+the+hyperplastic+to+hypertrophic+transition+in+heart+development.">array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).</li><li>Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> , 205-214 (2012).</li><li>Zlochiver, S., Mu&#241;oz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotonic+myofibroblast-to-myocyte+coupling+increases+propensity+to+reentrant+arrhythmias+in+two-dimensional+cardiac+monolayers.">Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers.</a> Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).</li><li>Chang, M. G., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiral+waves+and+reentry+dynamics+in+an+in+vitro+model+of+the+healed+infarct+border+zone.">Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone.</a> Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

NRCMs, izole dondurulan ve çözülmüş olması için bu protokol sağlar. Hücrelerin çözülmesi prosedürünün çok önemli bir kısmıdır. DMSO Bir dizi sıvı yavaşça hücreler 14 DMSO&#39;yu çıkarmak için kullanılır. Bu DMSO çıkarma hücreleri çözüldükten sonra hemen ölen özellikle duyarlı hızlı bir şekilde yapılması önemlidir. Daha fazla veya daha az hücre eritme işlemi için gerekli olan, gerektiğinde, DMSO çözeltisi hacimleri ölçeklendirilebilir. <p class="jove_co...

Kardiyomiyositlerin Hücre kültürü, modern kardiyak araştırma kritik bir araçtır. Yenidoğan sıçan kardiyomiyositler (NRCMs) yaygın izolasyon beri kullanılan ve kültür yetişkin sıçan kardiyomiyositlerde 1 daha kolaydır. NRCM yöntemi hala çanak, uzun izolasyon prosedürü ve sınırlı hücre çoğalması dahil olmak üzere, çeşitli sınırlamalar vardır. En genel iş 2-6 4-48 saat gerektiren NRCMs izolasyonu için çok sayıda protokoller vardır. Buna ek olarak, hücreler sıklıkla 2 günlük sıçan yavrularından 2,4-7 1&#39;den izole edilir; Doğum zamanlaması laboratuarında diğer çalışmaları ile öngörülemeyen ve çatışma olabilir. hücrelerin sadece küçük bir miktar deneyler için gerekli olup olmadığını izolasyon israf olduğu olabilir. Izolasyon süresini azaltarak iş akışı odak iyileştirilmesi çoğu çabaları, henüz bu yavruların doğum zamanlama sorunları çözmez. Alternatif olarak, birçok laboratuvar kullanmakEmbriyonik kök hücreler (EKH) ya da uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) türetilen kardiyomiyositlerde. Ancak, yeniden programlama ve / veya farklılaşma süreci çok zaman alıcı ve masraflı de olabilir. In vitro olarak, miyosit model olarak, bu hücreler kullanılarak başka problemler de olabilir. Hem Esc ve iPSC- türetilmiş kardiyomiyositlerde birincil kardiyomiyositlerde 8-10 elektrofizyoloji farklılıkları sergiledikleri gösterilmiştir. Disosiye NRCMs soğutma 11 kullanılarak birkaç gün depolanan yeteneğine sahip, henüz bu uzun süreli depolama için izin vermez. Sıvı azot tipik olarak belli bir süre ile hücreleri korumak için kullanılır, ancak dimetil sülfoksit (DMSO) gibi bir dondurarak saklama koruyucusu gibi gerektirir. Önceki araştırmalar dondurma medyada% 5-10 DMSO arasında ideal konsantrasyon NRCMs iyileştirilmesi için izin verdiğini göstermiştir, ancak o zaman bile canlılığı düşük 12 kalır. DMSO ücretsiz sırasında hücrelerin korunmasına yardımcı olur rağmenkuvvet, 1.5,% 13 üzerindeki konsantrasyonlarda hücreler için toksik olabilir. Daha önce yapılan çalışmalar yavaş hücrelerden DMSO kaldırma hücre canlılığı 14 iyileştirebileceğini göstermektedir. Bu ayrılmasından sonra cryopreserving hücreleri tarafından NRCM hücre bazlı deneylerde verimliliğini artırmak için çalışmıştır. Bu hücreler çözülür ve gerektiğinde, izolasyonları ve hayvan tüketimi sıklığının azaltılması kullanılacak sağlar. Bu yöntemi kullanarak, bu NRCMs dondurularak saklanabilmesi ve daha sonraki bir zamanda kullanılmak üzere çözülme mümkün olduğunu göstermektedir. Çözülme sonra hücreler kabul edilebilir canlılığını korumak ve kendiliğinden α-aktinin sarkomerik (α-SA) ve sözleşme için pozitif NRCM kültürleri üretmek.

<table><tbody><tr><td>IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td>With added 25 mM HEPES and L-glutamine</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca +Mg)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25300-056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td>Freezing media</td></tr><tr><td>Cryogenic Vial</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C1889-50MG</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Cell Strainer</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing Vacuum Filter (0.22&amp;mu;m)</td><td>Corning</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty Freezing Container</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ&amp;nbsp;SLIDES</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0416</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-sarcomeric actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>BD Biosciences</td><td>51-7581KZ</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cryopreservation of neonatal rat cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

Yenidoğan Sıçan kardiyomiyositlerinde izolasyonundan sonra, hücreler sıvı azot kadar dondurulur ve en az birkaç ay boyunca saklanabilir. Tipik haliyle eritme üzerine, Tripan mavisi analizi ile belirlenen canlılık% 40-60 arasında olacaktır. Bu doğru tohumlama ve kültürü ile, diğer hücre türlerine göre daha düşük olmasına rağmen hücreleri (Şekil 1) çoğalacak. Kasılma doğrulamak için, hücreler, bir faz kontrast mikroskobisi kullanılarak görüntülenebilir. Hücreler kendi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

İzolasyon ve Neonatal Rat kardiyomiyositlerde Kryoprezervasyon

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

isolation-and-cryopreservation-of-neonatal-rat-cardiomyocytes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.5K Görüntüleme.  College of Veterinary Medicine, North Carolina State University. The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

Video: Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Nörobilim

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Tıp

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Biyoloji

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Doku hasarını azaltmak için yeni bir minimal invaziv yavaş enjeksiyon yöntemi

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

Yazar Spotlight: Minimum İstila ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Minimum İnvazyon ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...

Biyomühendislik

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

İzolasyon ve Neonatal Rat kardiyomiyositlerde Kryoprezervasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

Minimum İnvazyon ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi

Minimum İnvazyon ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi

Minimum İnvazyon ile Yeni Bir Hücre Enjeksiyon Yöntemi

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem