We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells.">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li><li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+coregulation+of+5'TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR.">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication.">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li><li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+(eIF3)+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast.">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li><li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E.">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li><li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate.">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li><li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery.">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li><li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2.">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li><li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype.">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li><li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon.">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li><li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+translation+state:+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening.">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5'+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress.">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li><li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation.">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity.">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li><li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+polyribosome+fractionation.">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Polysomal profil farklı tedavi koşulları altında belirli transkript çeviri devletin ölçümü için olanak sağlayan güçlü bir tekniktir. Prensip çok basit bir tekniktir ama iyi Polizom profilleri üretmek için kritik bazıları yürütme birkaç adımları gerektirir. 1) RNazsız kimyasallar ve plastik malzeme kullanılarak, 2) (iyi sakaroz geçişlerini hazırlamak bizim deneyim% 10-50 sakaroz geçişlerini verimli bağlı ribozomlarla 40 / 60S alt birimleri ve mRNA&#39;lan) çözümlemek için en iyi iş, ve 3: Bu tuş adımlar ) en yüksek çeviri oranlarını yakalamak için katlanarak büyüyen hücreleri ve fazla% 80 konfluent kullanarak. Bu tür gen demonte veya aşırı ekspresyonuna sürece hücre tedavileri, yaparken plaka hücre miktarı hücreler son ucunda birleştirilebilmeli ne kadar bir fonksiyonu olacaktır, böylece bu ikinci aşaması dikkate alınmalıdır. Sonuçlarda Konusuted burada, Polizom profili analizi IRES&#39;e-barındıran mRNAlar XIAP ve Bcl-xL 12 çeviri düzenlenmesinde PDCD4 rol değerlendirmek için önemli bir araç oldu. Biz PDCD4 knock-down (Şekil 1B) üzerine genel Polizom profillerinde herhangi bir değişiklik dikkat etmedi aslında bize PDCD4 deney koşullarında küresel hücresel çeviri zarar vermedi sonucuna izin verdi. Önümüzdeki PDCD4 veya kontrol siRNA&#39;lara ile tedavi hücrelerde XIAP ve Bcl-xL mRNA&#39;ların dağılımını belirlemek için RT-qPCR analizi kullanılmıştır. Bu mRNA&#39;nın dağılımının niceliksel yerine Yarı-nicel analiz için ve tedaviler arasında çeviri verimliliği ince değişimlerin saptanması için sağlar, çünkü QPCR, standart RT-PCR veya Northern Blot karşıt olarak, polisom profilleri analiz için tercih edilen bir yöntemdir. Bu tekniği kullanarak, XIAP ve Bcl-xL mRNA&#39;ların dağılımı (gr edilen toplam hedef mRNA&#39;nın bir yüzdesi olarak ifade edilen bu gösterebilmişlerdiradient) belirgin ve böylece, bu mRNA çevirisinde bir artışla, PDCD4 knock-down (Şekil 1D, e) bunlarla ilişkili ribozom çok sayıda) ağır poliribozomların (mRNA içine kaydırılmıştır. Bu da XIAP ve Bcl-xL protein düzeyinde değil, bunların kararlı durum RNA düzeyi (Şekil 1F, G), bir artış ile teyit edilmiştir. Önemli bir şekilde, XIAP olmayan IRES varyantının polisom dağılımı tedavi edilen ve edilmeyen hücreleri (Şekil 1C) arasında aynı idi. Seçenek olarak ise, dönüşüm etkinliğini 14 (genellikle 2-4 fraksiyonlar) monosomes karşı polizom mRNA içeriği olan bir oranda (genellikle 5-10 fraksiyon) olarak sunulabilir. 254 nm absorbans okuma gözlenen zirveleri kendi ribozomal RNA (deterjan isnat edilemez olarak protokol boyunca kontrolleri kullanımı sonucu profilleme herhangi Polizom doğrulayarak önemlidirörneğin Triton X-100 gibi ler, kuvvetli) spektrumun bu bölgede absorbe ve gradyan üstündeki 40 / 60S tepe gizleyebilir. Lisatı olmayan ve / veya lisat tamponu ile Boş gradyanı, 254 nm&#39;de abzorbans, tamponlar nispi katkısının belirlenmesi için çalıştırılması gerekir. Artefactual yüksek mertebeden yapılar da aslında hiçbiri (örneğin &quot;sözde Polisomlar&quot; 20) vardır polizom hatalı yorumlara yol açabilir. Magnezyum Ayrılan iki değerlikli katyon kenetleme maddesi EDTA (80S ribozomlar stabilize etmek için işlem boyunca kullanılan) büyük (60S bileşen küçük (40S) içine ribozom ayrılmasına neden olacaktır lizatlarına ve gradyan tamponu (15 dakika için 20 mM) eklendi ) alt birimi. 260 nm&#39;de kaydedilen absorbans pikleri polisomlann gerçekten de Dolayısıyla, eğer EDTA muamelesiyle tek bir maksimum mRNA ve ribozomal birimleri serbest tekabül gradyanının üst kısmında görülen edilecek şekilde profili çökecek (veriler gösterilmemiştir). RastlayanProfilin EDTA kaynaklı çökmesiyle birlikte, qPCR analiz belirli hedeflerin hepsi şimdi degrade üstünde bulunmalıdır. Bir mRNA ile ilişkili ribozomların sayısı her zaman belirli bir mRNA tercüme ediliyor nasıl verimli bir göstergesi değildir. Nitekim, polisomlar aktif çeviri okuyucu farkında olmalıdır 21,22 durdu hale geldiği özel bağlamları vardır. Transkript aktif EDTA aksine, &#39;run-off&#39; aktif bir mRNA boyunca translocating olan ribozomların neden Puromycin ile örnek, tedavi) bir tarafından yapılabilir çeviri makine ile meşgul, veya b) örnek tedavisi olsun ya da olmasın belirlenmesi Yine herhangi bir aşağı translokasyon Ribozomların &#39;run-off&#39; neden başlangıç ​​kodonu sadece ilk ribozomun translokasyonu inhibe homoharringtonin&#39;le. QPCR analizi için kontrol transkriptleri kullanılması da önemlidir. SelecBu tür XIAP IRES olmayan IRES varyant bazı temizlik genin (GAPDH, aktin, tubulin, Nucleolin), ribozomal mRNA (18S, RPL13A) halinde ya da bu durumda, farklı tedavi koşullarında etkilenmez transkript tion, önemlidir doğrulama çeviri üzerinde tedavinin etkisinin spesifik ya da genel olup olmadığını. Bu kontrol transkriptleri burada yapılan gibi analiz mRNA&#39;ların dağılımını normalize etmek için kullanılabilir (XIAP ve Bcl-xL mRNA&#39;lar, GAPDH mRNA için normalize edildi ve her fraksiyon mRNA içeriğinin toplamı ile temsil edilen toplam mRNA&#39;nın içeriğinin yüzdesi olarak ifade edildi ) ya da seçenek olarak, hedef ve kontrol mRNA&#39;lar, mutlak değerler olarak ifade edilen ve ayrı olarak gösterilebilir. giriş lizatlan (toplam hacmi genellikle,% 10) olarak QPCR analizi belirli mRNA&#39;ların dağıtımı için kontrol edecek bir adımdır. İdeal olarak, giriş lizat belirli transkriptin mRNA içeriği analiz 10 fraksiyonları mRNA muhtevası toplamının ile karşılaştırılabilir nitelikte olmalıdır. NihayetBir isteğe bağlı aşama fenol kontrol etmek için: kloroform ile ekstre etme aşaması (kedi, kloramfenikol asetil transferaz gibi) ardından qPCR sayısal olarak ve hatta kullanılabilir normalleştirmek için bir in vitro transkribe raportör mRNA ile her polisom fraksiyonu başak etmektir Veriler 14. Herhangi bir teknik olduğu gibi, polisom profil bazı sınırlamalar sunulur. Genellikle 10 kesirler bir asgari güzel Polizom dağılımları olması için toplanması gerekmektedir (çeviri verimliliğinde daha ince kaymalar 20 veya daha fazla gerekebilir) olması bu adımı 4 örneklerinin sadece maksimum olabilir anlamda, sınırlayıcı yapar Bir anda analiz rahat bir kerede RNA ekstraksiyon ve 40 örnekleri ve 4 giriş kontrolleri QPCR analizini idare edebilmek için. Örneklem büyüklüğü kolayca QPCR yapmak çoğaltır kaç transkript analiz edilecek ve kaç ile ekleyebilirsiniz, ve bu pahalıya mal olabilir. QPCR tabanlı polysomal profil a diğer kısıtlılığınalysis sadece (transkript önceden bilinen analiz edilmesi) ve çeviri genom analizi için tatbik edilemez bir aday temelli yaklaşım yapılabilir olmasıdır. Ancak, 21. yüzyılın başında, araştırmacılar DNA kullanılarak bir genomik düzeyde polysomal RNA sorguya başladı nesil dizileme 16,17 ile daha yakın zamanda 15 ve mikroarray&#39;ler. Daha çok ayrı ayrı fraksiyonların QPCR analizi yapan daha haricinde bu protokolde tarif edildiği gibi, bu güçlü bir yaklaşım olarak, polysomal profil gerçekleştirilir, genel çeviri kısımlar (genellikle fraksiyon 2-4) ve polizom parçacıklar (genellikle kısımlar) toplanır ve varyasyonları analiz monosomes DNA mikro-dizisi ya da tüm genom RNA sekansları vasıtası ile. Dolayısıyla bu yaklaşım ile, bu değerlendirmek mümkündür tüm olan dağıtım kaymalar polisomlar dan monosomes için (çeviri azalma) ya da tam tersi (çeviri artış) belirli bir tedavi üzerine mRNAlarment. Belirli mRNA Polisomlar dağıtım Doğrulama ve miktar sonra qPCR yapılabilir. Polysomal profil ilkesinin daha da güçlü kullanım ribozom profillemesidir. Bu tekniğin daha yüksek verimlilik uzatma Polizom fraksiyonların 23 yüzlerce eşzamanlı izleme sağlayan son zamanlarda bildirildi. Mutant koleksiyonları veya büyük ölçekli RNAi ekranlarında öteleme verimliliği sondalama Bu açık bir avantaj sağlamaktadır. Ribozom profil protein sentezinde 24,25 yapan ribozomlar (ribozom ayak) tarafından korunan RNA parçaları eşleştirmek için yeni nesil dizileme yararlanır bir tekniktir. Bu teknikte, ribozom translokasyon sikloheksimid (geçici) ya da emetin (geri dönüşümsüz) bir ribozom ayak izi bir popülasyonunu üretmek üzere hücre lizizi ve RNaz sindirimi ile başlık ile inhibe edilebilir. Ribozomlar, zenginleştirilmiş total RNA izole edilir ve kirletici ribozomal ve mitokondriyal ribozomal RNA çıkarılır.Yaklaşık 26-28 nükleotid RNA ayak izi izole bir cDNA kütüphanesine dönüştürülmüştür, transkripsiyonu ve 26 dizilenmiştir ters. Standart Polizom profilleme aksine, bu yaklaşım sadece translationally düzenlenir belirli mRNA&#39;lan tanımlayan değil aynı zamanda belirli bir transkript boyunca tam işgal ve ribozomların yoğunluğu gibi kodon çözünürlükte mRNA özgü bilgileri verir. O nerede oluştuğunu transkript ribozom-istihdamına hakkında daha fazla bilgi verebilir Bu, özellikle, bu tür IRES-yataklık mRNA&#39;lanmn gibi çeviri özel modları ile mRNA&#39;larL için ilginçtir.

Protein sentezi (translasyon) düzenlenmesi, iyice hücre hayatta kalma ile bağlantılı önemli bir hücresel süreçtir. Çeviri hücrenin enerji% 50&#39;sinden fazlasını tüketir göz önüne alındığında, bu çeviri sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ki ve çeviri tedirginlikler iyi tolere edilmez olması şaşırtıcı değildir. Tersine, bir çok sapkın hücresel süreçlerle nakil mekanizması ve çeviri çıkış (yani proteom) değiştirilmek üzere olmasını gerektirir. Bu genellikle, çeşitli stres cevabı ve hastalık durumlarında da olduğu, ve muhtemelen en iyi kanser örneklenmiştir. Translasyon kontrolünde önemli bir avantajı, hızlıca, çeşitli iç ve dış tetikleyicilere karşılık olarak protein çıkışı yeniden programlamak hücrelerin yeteneği, ve böylece ince ayar mekanizması olduğunu şunun hücre yaşamı ve ölümüyle 1 arasındaki denge. Öteleme kontrolü iki yönü özellikle ilginçtir; düzenleyici mec doğa anlayışıilk yerde seçici çeviri ortaya, özel tetikle idare hücresel yanıt olarak katılmak hanism (ler) ve kontrol belli bir çeviri izin elemanları, ve spesifik mRNA tespiti ve bunların protein ürünleri. Polizom profil Her iki yöntemin etkin çalışma sağlayan bir tekniktir. Polizom profil tekniğinin genel amacı eğitim ve farklı hücresel şartlar altında belirli mRNA&#39;lann çeviri durumunu ölçmek için. Tekniğin temel ilkesi, böylece, bir sükroz gradyanı üzerinde ultra-santrifüj ile elde edilen poliribozomların &#39;dondurulması farklı kopyalar üzerinde aktif çeviri ribozomlar ve ayrı&#39; (birkaç ribozom bağlayıcı) son derece çevrilmiş transkriptler arasında bir ayrım için izin vererek mRNA dönüşümüyle yakalamak için kötü (bir veya iki ribozomlar bağlı) olanlar çevrilmiştir. Bu özel protokol, antibiyotik sikloheksimidin bağlandığım60S ribozomal alt birim ve bloklar ribozom E sitesinden 2 deasetillenmiş tRNA serbest, ribozom translokasyon inhibe ve çeviri mRNA üzerinde ribozomlar durak için kullanılır. Ancak, aynı zamanda blok yapıldı uzama 3, kullanılabilirler, örneğin, emetin gibi bloke edici maddeler. Western blotting ve çeviri işleminin son çıkış ölçmek 35S-metionin etiketleme teknikleri farklı olarak, bu nedenle, farklı koşullar altında mekanizmalarından ilişkin daha ayrıntılı bir çalışma için izin veren, profil aktif çevrilmemiş mRNA ile ribozom ilişki ölçüm avantajına sahiptir polisom. Bu yüzden, tekniği kolayca özel çeviri 4-6 farklı modlar incelemek için adapte edilebilir, protein faktörleri çeviri düzenleme, 7-9, protein sentezini 1,10,11 ya da üst baş yangınlar ya da mRNA yapıları etkilerini etkileyen, gerilimli şartlar yer Protein synth açık okuma çerçeveleriagenezis 12-14. Günümüzde, polisom profil uygulama daha geniş polisomlann ilişkili mRNA&#39;ları analiz etmek için, DNA mikrodizilerinin 15 ya da yeni nesil dizileme 16,17 kullanımı ile bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automated gradient maker</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composed of: tube piercing system,&amp;nbsp; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td></tr><tr><td>WinDaq data acquisition software</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (nucleases-free)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nucleases-free)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td></tr><tr><td>Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase inactivation solution</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td></tr></tbody></table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Protein sentezi Düzenleme strese hücre yanıt olarak önemli bir kontrol noktasını temsil eder. Özellikle, gizli RNA, düzenleyici elemanlar tipik olarak belirli bir stres tepkisi için gerekli olan proteinler için kodlayan spesifik mRNA, seçici çeviri izin vermek için gösterilmiştir. Bu mRNA&#39;lardan yanı sıra seçici çeviri sorumlu düzenleyici mekanizmaların karakterizasyonu Kimlik süredir moleküler biyoloji ön planda olmuştur. Polizom profilleme bu çalışmalarda bir dönüm yöntemdir. Polizom profil amacı, farklı kopyalar üzerinde aktif çeviri ribozomlar immobilize edilmesi ile mRNA dönüşümüyle yakalamak ve bu yüzden de çok tercüme transkript ve kötü tercüme olanlar arasında bir ayrım sağlayan, bir sükroz gradyanı üzerinde ultra-santrifüj ile elde edilen poliribozomların ayırmaktır. Bu daha sonra, klasik biyokimyasal ve moleküler biyoloji yöntemleri ile ayırt edilebilir. Önemli bir şekilde, birleştirme syüksek kapasiteli genomik yaklaşımları ile olysome profil öteleme düzenlemenin bir büyük ölçekli analizi sağlar.

Biz son zamanlarda apoptotik inhibitörleri XIAP ve Bcl-xL 12 kodlayan mRNA&#39;lan IRES-barındıran bir seçici çeviri inhibitörü olarak tümör baskılayıcı PDCD4 için yeni bir rol tarif var. Polizom profil IRES-aracılı çeviri PDCD4 özel katılımını göstermek için önemli bir tekniktir. HEK293 hücreleri geçici PDCD4 (Şekil 1A) endojenik düzeylerini tüketmek için transfekte edilmiş ve daha sonra profil analizleri polisom tabi tutuldu. Biz siCTRL ve siPDCD4 ile işlenen hücrelerde (Şekil 1B) karşılaştıran polisom profilindeki değişikliklerle eksikliği ile karar PDCD4 azaltılması kat, küresel hücresel Çeviri zarar almadığı gözlemlenmiştir. Benzer şekilde, XIAP 19 olmayan IRES varyantının polisom dağılımı, işlenmiş ve işlenmemiş hücreleri (Şekil 1C) arasında aynı idi. Buna karşılık, iki IRES-barındıran mRNA&#39;ların polisom dağılımı, XIAP ve Bcl-xL, önemli ölçüde değişmiş edildi. P yokluğundaDCD4 Bu iki mRNA&#39;ların dağılımı ağır ribopolysomes (Şekil 1D, E) içine kaydırılır. Bu XIAP ve Bcl-xL, mRNA (Şekil 1F), bu sonuçlar kararlı durum seviyelerinde değişikliklere eşlik olmadığından daha ileri olarak Western lekeleme (Şekil ile teyit edilmiştir, indirgenmiş PDCD4 seviyeleri ile hücrelerde XIAP ve Bcl-xL translasyonunu daha zengin oldukları bilinir 1G). <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Polisom profil XIAP ve Bcl-xL çeviri seçici önleyicisi olarak PDCD4 tanımlayan (A), HEK293 hücreleri PDCD4 siRNA veya kontrol (CTRL) ile muamele edildi, bir anti-PDCD4 lizlendi ve Western blot analizine tabi tutulmuştur siRNA olmayan hedefleme ve anti-Nucleolin antikorları. PDCD4 knock-down kapsamını doğrulamak (B) PDCD4 (A) gibi yıkıldığında veHücre lizatları, profil polisom tabi tutuldu. Temsilci Polizom profil üst panelde gösterilir; XIAP olmayan IRES (C) dağılımı, GAPDH edilene göre, Bcl-xL (D) ve XIAP IRES (E) mRNAlar, her bir parça halinde toplam mRNA yüzde (% mRNA) olarak gösterilmiştir. (F) Sabit -durum mRNA seviyeleri PDCD4, siRNA veya Kontrol (CTRL) siRNA ile muamele görmüş hücreler RT-qPCR ölçüldü. (G) &#39;den Lizatlar (A)&#39; da, anti-XIAP, anti-Bcl-xL, ve birlikte western blot analizine tabi tutulmuştur Anti-Nucleolin antikorlar. (NB. Veri başlangıçta 12 yayınlandı Şekil 1&#39;de sunulan) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling at JoVE.com

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K Görüntüleme.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

Video: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biyokimya

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Gelişim Biyolojisi

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biyoloji

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...