Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Hücre görüntüleme birimi teknik yardım için araştırma merkezinin teşekkür ediyoruz. M.-É. Huot olan bir Junior 1 araştırma bilim adamı Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Bu eser Kanada kurumları, Sağlık (sayı CIHR, paspas-286437 M.-É için hibe. araştırma tarafından desteklenmiştir Huot).

1. Puromycilation koşullar belirlenmesi Not: Bu teknik MRC-5 hücre adezyon işlemi 5 sırasında yerelleştirilmiş çeviri değerlendirmek için kullanılan yöntemi tanımlar. Puromycilation herhangi bir hücreyi yapılabilir gibi bu tedavi koşulları açısından puromisindir konsantrasyon ve istenen her hücre satırı için özdeş değil çünkü puromycilation koşulları kullanılmak üzere belirli hücre hatları için optimize etmek önemlidir kuluçka süresi. Bu koşullar nasıl tanımlandığını göstermek için üç örnek hücre hatları (Yani, HeLa, MRC-5 ve ha-7) için farklı kuluçka süreleri puromisindir konsantrasyonları artan ile tedavi edildi ( Resim 1).
<ol><li>Grow uygun 0.5 ml 24-şey plaka hücrelerde aynı sayıda kültür orta test önce 16 h tamamlayın. Tohum 30.000 MRC-5 hücre, 50.000 HeLa hücreleri veya iyi başına 50.000 ha-7 hücre. % 60-70 izdiham (şekil 1A) aşmasını önlemek emin olun.</li>
	<li>Puromisindir (0, 5, 10, 15, 20 ve 30 µg/mL) konsantrasyonları artan tam hücre kültür ortamının 1,5 mL ile hazırlamak 6 tüpleri. Önceden sıcak 37 ° C'de</li>
	<li>Puromisindir orta (hazırlanan adım 1.2), her toplama aktarmak için 0.5 mL her 6 yeni tüpler içine tüp ve sikloheksimit 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon tüm 6 yeni tüpler için ekleyin. Önceden sıcak 37 ° C'de</li>
	<li>Orta 0.5 mL tam kültür ortamının (satır 1 ve 2) ile değiştirin. İçin üçüncü satır, 0.5 mL 50 µg/mL ile sikloheksimit ( şekil 1B) takıma tam kültür ortamının ekleyin. 
	Not: Sikloheksimit tedavi için protein puromycilation çeviri uzama engellemek için onun yetenek nedeniyle en iyi negatif kontrol olarak kurulmuştur. Puromisindir birleşme çeviri uzamasını gerektirdiği için sikloheksimit tedavi puromycilated protein sinyalleri 5 , 18 bir kaybına neden.</li>
	<li>15dk 37 ° C'de (%5 CO 2) için kuluçkaya.</li>
	<li>0,5 mL 0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL, son konsantrasyonları sırasıyla A, B, C, D, E ve F. sütunlarda elde etmek için ikinci sırada 1.2. adımda hazırlanan puromisindir orta ekleyin Aynı zamanda, üçüncü sıradaki ( şekil 1 c) sikloheksimit takıma orta (Adım 1.3) puromisindir 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL ( şekil 1 c) son konsantrasyonları elde etmek için ilk satırı 1.2. adımda hazırlanan puromisindir Orta 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama her de fosfat tamponlu 1-3 1 mL olan satırları buz gibi 1 X serum fizyolojik (PBS) 5 dk sonra eklenmesi için ilk satır (iki kez yıkama) kuyu puromisindir, dan. 1 X Laemmli arabelleği 75 µL ekleyin (%4 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 4 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris HCl pH 6.8, %0,004 bromophenol mavi ve % 10 gliserol) bütün hücreli lysates her koşul için elde etmek için.</li>
	<li>Çalıştır % 10 SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) puromisindir birleşme değerlendirmek için 1/3 hazır örnekleri kullanarak.
	<ol><li>Belirleme birincil antikor kuluçka arabellek (%2 sığır serum albumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 ve %0.01 1:25,000 oranında sulandırılmış bir anti-puromisindir antikor (12 D 10) kullanarak Western blot analizi tarafından puromisindir şirketleşme düzeyi Sodyum azid). 
		Not: Resim 2 örnek olarak temsili Resim 1. adımda açıklandığı gibi yapılan farklı hücre satırı özleri karşılık gelen gösterilir.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cellulo içinde Çeviri görselleştirme lokalize Not: Burada açıklanan tekniği SICs MRC-5 hücrelerdeki içinde yerelleştirilmiş çeviri sırasında yapışma işlemi 5 değerlendirmek için kullanıldı. MRC-5 hücreleri burada kullanılmasına rağmen diğer hücre hatları 2.1. adımda açıklanan aynı metodolojisi ile kullanılabilir.
<ol><li>Hücre hazırlık.
	<ol><li>Ayırmak MRC-5 hücrelerin % 0.25 tripsin/2.21 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hank kullanarak &#39; s dengeli tuz çözüm (HBSS). Santrifüjü (200 x g de 5 dk) 15 mL konik santrifüj tüpü içinde tarafından hücreleri cips ve onları Dulbecco içinde askıya &#39; s sayım odası ile sayım sonra % 10 fetal sığır serum (FBS) 40.000 hücre/mL, ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).</li>
		<li>Süspansiyon korumak için bir tüp rotator 20 dk için kullanarak nazik döndürme altında 37 ° C'de askıya alınan hücreler kuluçkaya. 
		Not: Bu odak yapışma kompleksleri tam ayrılma için izin vermek için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Askıya alınmış MRC-5 (40.000 hücre/mL) hücrelerde iki 35-mm cam alt tabak tabak 2 mL. İlk 35-mm cam alt çanak puromycilation tahlil için kullanın (bkz. Adım 2.1.5) ve ikinci bir negatif kontrol kullanın (bkz. Adım 2.1.6).</li>
		<li>Hücreleri hücre adezyon ve SIC oluşumu için izin vermek 55 dk. 37 ° C'de (%5 CO 2) tutmak.</li>
		<li>Ekle puromisindir orta önceden tanımlanmış 1 bölümünde konsantrasyon kullanarak 35-mm cam alt yemekleri (tahlil). MRC-5 hücreleri tedavi etmek için 10 µg/mL puromisindir 37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kullanın.</li>
		<li>Bir negatif kontrol sikloheksimit ikinci 35-mm cam alt çanak 40dakika hücreleri onları önceden 50 µg/mL sikloheksimit ( şekil 2B) ile tedavi etmek için tohum sonra ekleyin. Sonra sikloheksimit ek olarak sonra 15 dk ekleyin puromisindir aynı konsantrasyonu kuluçka bu kez adım 2.1.5 (Örneğin, kullanım 10 µg/mL puromisindir 37 ° c (%5 CO 2) MRC-5 için 5 min için) gibi orta.</li>
		<li>Yıkama her plakalı iki kez buz gibi 2 mL 1 X PBS hücreleri ile ve 1 mL (1 X PBS içinde seyreltilmiş) % 4 formaldehit 15 dakika oda sıcaklığında (RT) düzeltin. 
		Dikkat: Paraformaldehyde kesinlikle kimyasal bir mahallede kullanılmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>Immunostaining.
	<ol><li>Pimlerle yapılan fiksasyon ardından paraformaldehyde, yıkama ile üç kez 2 mL 1 X PBS ve PBS-TritonX-100 (% 0.5) 500 µL içinde 20 dk RT hücreleri permeabilize az için kuluçkaya.</li>
		<li>Spesifik olmayan antikor bağlama önlemek için 500 µL PBS ile örnek blok &#8211; BSA (% 1) için dik, 20 dk</li>
		<li>PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez yıkayın ve 1 X PBS RT. 1 h için anti-puromisindir antikor (12 D 10) seyreltilmiş 1:12,500 300 µL ile kuluçkaya</li>
		<li>Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile 3 kez ve anti-fare IgG Birleşik bir fluorophore 300 µL ile kuluçkaya (burada, 488 nm) puromycilated polipeptitler görselleştirmek için PBS ve phalloidin Birleşik ile seyreltilmiş başka bir fluorophore için (burada, 555 nm) F-aktin görselleştirmek için. Dik, 1 h için kuluçkaya</li>
		<li>Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez ve daha sonra 5 1 µg/mL ile 4 takıma min için RT, içinde 300 µL PBS-Tween20 (% 0,1), kuluçkaya &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>2 mL PBS-Tween20 (% 0,1) ile üç kez yıkayın ve 2 mL 1 X PBS ile yıkayın. Hücreleri örnek 2 mL 1 X PBS resim alma sırasında tutarak kurumasını önlemek.</li>
	</ol></li></ol> 3. İmmünfloresan resim alma Not: aşağıdaki metodoloji-ebilmek var olmak kullanılmış ile piyasada bulunan herhangi bir confocal görüntüleme sistemi.
Miktar için dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak için <ol><li>belirleme uygun ayarları için her fluorophore. 
	Not: Temsilcisi miktar yalnızca piksel doygunluk kaçınılması ve sinyal eşik düzgün ayarlanır elde edilebilir. Bu ayarları, dikkatle lazer gücü, yüksek voltaj, ayarlayarak elde kazanç, ve ofset.
	<ol><li>Ayarlama yakınlaştırma faktörü (5 X) ve piksel boyutunu optimize etmek için piksel (512 x 512). 
		Not: Bu Nyquist teoremi göre optik çözünürlük, en azından 2,3 - kat daha küçük olmalıdır.</li>
		<li>İnceden inceye gözden geçirmek hız (12,5-20 µs/piksel) azaltmak ve yukarıda belirtilen ayarlara göre sinyal-gürültü oranı artırmak için (2 - 3 kez) ortalama kullanın.</li>
	</ol></li> <li>El ile uygun üst belirlemek ve odak uçaklar en uygun adım boyu (0.4 µm/dilim) ile z ekseni boyunca alt. 
	Not: Adım boyutu uçak 2.3 tarafından bölünmüş Aksiyel çözünürlük Nyquist teoremi göre belirlenir. Genellikle 20-25 katmanları yapışık hücreleri tüm hücre derinliği karşılamak gereklidir.</li>
	<li>Tüm bir tek hücre bir 60 X Apo planı yağı daldırma hedefi (1,42 sayısal diyafram) ile confocal bir görüntüsünü elde.</li>
</ol> 4. İmmünfloresan görüntü miktar <ol><li>zenginleştirme belirlenmesi.
	<ol><li>ImageJ yazılım (freeware http://fiji.sc kullanılabilir) kullanarak alınan hücre veri dosyasından faiz z-uçak katmanına karşılık gelen bir görüntüyü açmak.</li>
		<li>Çizgi çizme aracını kullanarak çizgi çizin (araç çubuğu &#8594; düz) nerede miktar isteniyorsa hücre bölgelerinde aracılığıyla. Üzerinde çift tıklatarak çizgi genişliğini değiştirmek &#34; düz; &#34; yoğunluk değerleri (8 şekil 3 ' de ayarla) çizginin genişliğini üzerinden ortalama olarak. 
		Not: Daha ince bir çizgi sinyal örtüşme farklı yapılardan önlemek için tercih edilir.</li>
		Yolun doğru şekilde ayarladıktan sonra <li>profil kararlı eksen boyunca sinyal yoğunluğu (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; arsa profil). 
		Not: Seçili z-uçak bölümü için hattı boyunca sinyal yoğunluğu (özel fluorophore) seçilen kanalın her piksel için karşılık gelen bir profili gösteren yeni bir pencere açılacaktır.
		<ol><li>Tekrar işlem için kullanılan fluorophore karşılık gelen her kanal (Yani, bir miktar için 488, 568 ve 405 için bir tane). 
			Not: Sinyal yoğunluk değeri her zaman çizilmiş çizgiyi yönünü takip sıralanır.</li>
		</ol></li> <li>Gri ölçekli sayısal değerler seçili z-uçak katman quantifications için karşılık gelen profil her piksel için elde etmek için profil verileri kopyalayın (Görüntü penceresinin menü çubuğundan &#8594; kopya) ve herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın.</li>
		Confocal elde edilen görüntünün her z-uçak bölüm ve miktar istendiği nerede her kanal için <li>Yinele adımları 4.1.1-4.1.4. 
		Not: Farklı z-uçak katmanları miktar toplam değeri her z-uçak katman hattı boyunca her pikselin hesaplayarak sinyal özel zenginleştirme genel bir değerlendirmesini elde etmek için havuza alınmış. Çizilen çizgi ortalama değerlerde dahil her z-uçak katman aynı ise bu tür havuz sadece elde edilebilir.</li>
		<li>Farklı kanalları çok sayıda Katmanlar ile bütün hücreli miktar için alternatif bir yöntem, StackprofileData olarak adlandırılan makroyu kullanmak (bkz. Ek dosya). 
		Not: Bu makro https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt serbestçe erişilebilir ve aşağıdaki gibi kullanılabilir: <ol><li>makro bir metin dosyasına yapıştırın ve bunu kaydedin</li>
			<li>Hücre confocal katmanları içerir görüntü dosyasını açın.</li>
			<li>Bir çizgi çizin, 4.1.2. adımda açıklandığı gibi makro almak için yeni bir pencere açın (menü çubuğu &#8594; eklentileri &#8594; makroları &#8594; çalıştırmak), StackprofileData makro karşılık gelen önceden kaydettiğiniz metin dosyasını seçin ve tıklatın &#34; açık. &#34; 
			Not: makro ithalat, yeni bir pencere adlı &#34; sonuçları &#34;-ecek açık ve tüm miktar kararlı eksen boyunca her z-uçak katmanı için listelenen ve resim dosyalarında mevcut kanal.</li>
			<li>Her kanal için veri kopyala (menü çubuğu &#8594; düzenleme &#8594; kopya) sinyal quantifications karşılık gelen grafik profili temsil elde etmek için. Herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın. Her kanal boyunca her z-uçak katmanı için yolun her piksel için toplam değerini hesaplamak. Grafik şekil 3 ' te sunulan benzer oluşturmak için bu değerleri kullanın.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Sinyal belirlenmiş hücresel alanda veya birim miktar.
	<ol><li>ImageJ yazılımı ile belgili tanımlık imge eğe açık.</li>
		<li>Çizmek geometrik form işlevini kullanarak ilgi alanı belirtmek için bir alan (araç çubuğu &#8594; &#34; dikdörtgen, &#34; &#34; oval, &#34; veya &#34; çokgen &#34;). 
		Not: Çizilmiş forma karşılık gelen alan için miktar değeri belirlenecektir.</li>
		<li>Herhangi bir arka plan sinyal önlemek için eşik düzeyi ayarlamak (menü çubuğu &#8594; görüntü ayarı &#8594; eşik); piksel yoğunluklarda çubuk grafik formunda temsil etmek için yeni bir pencere açılacaktır. Kaydırıcıyı kullanarak miktar piksellerindeki içerme/dışlama üzere değerleri değiştirin. Kırmızı renkte piksel miktar dahil olarak, hücre dışında kalan kırmızı pikseller ortadan kaldıran bir eşik seçin.</li>
		<li>Arka plan sinyal olmadan seçili alanı içinde piksel sinyal ölçmek için ölçü parametrelerini tanımlamak (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; ayarla ölçümleri) ve kontrol etmek emin olun &#34; Eşik sınırı &#34; ve &#34; entegre yoğunluk &#34; kutuları.</li>
		<li>Seçili alan için sayısal değerleri ölçmek (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; ölçü birimi). 
		Not: Sinyal şiddeti miktar-ecek sunulmak altında yeni bir pencerede &#34; IntDen &#34; ürün ortalama gri değerleri ve seçili alanı içinde piksel sayısını temsil eden kimlik.</li>
		<li>Çizmek geometrik formu kullanarak hücrenin tamamını içeren bir alanı (araç çubuğu &#8594; &#34; dikdörtgen, &#34; &#34; oval, &#34; veya &#34; çokgen &#34;) ve toplam sinyal için karşılık gelen bir değer elde etmek için adımlar 4.2.3-4.2.5 ile devam edin. İlgi alanı içinde sinyal yüzde elde etmek için tüm sinyal üzerinde seçili alanı içinde sinyal oranını hesaplamak.</li>
		<li>Miktar her z-uçak için hücre hacmi elde etmek için Yinele adımları 4.2.2-4.2.6. Geometrik formu gerektiği gibi uyum.</li>
		<li>Kopyala/Yapıştır üzerinden elde edilen veriler &#34; sonuçları &#34; windows için grafik tasvir ve ortalama bir değer bulmak için bir elektronik tabloya her z-uçak katmanı için.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo.">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li><li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells.">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li><li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+dynamics+of+single+mRNAs+in+live+cells+and+neurons.">Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons.</a> Science. 352, 1430-1435 (2016).</li><li>Halstead, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).</li><li>Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+translation+regulates+cell+adhesion+and+transendothelial+migration.">Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration.</a> J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).</li><li>El Fatimy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+in+a+Highly+Ordered+Neuronal+RiboNucleoParticles+Population:+A+Link+between+Stalled+Polyribosomes+and+RNA+Granules.">Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.</a> PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).</li><li>Paronetto, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells,+necessary+for+mouse+spermatogenesis.">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+puromycin+action:+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes.">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).</li><li>Goodman, C. A., Hornberger, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+synthesis+with+SUnSET:+a+valid+alternative+to+traditional+techniques.">Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques.</a> Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).</li><li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+muscular+atrophy:+the+role+of+SMN+in+axonal+mRNA+regulation.">Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation.</a> Brain Res. 1462, 81-92 (2012).</li><li>Costa-Mattioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+by+the+eIF2alpha+kinase+GCN2.">Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2.</a> Nature. 436, 1166-1173 (2005).</li><li>Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+long-lasting+synaptic+plasticity+and+memory.">Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory.</a> Neuron. 61, 10-26 (2009).</li><li>Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+cells+move+messages:+the+biological+functions+of+mRNA+localization.">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li><li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+the+bicoid+morphogen+gradient+matures.">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li><li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analysis+of+mRNA,+Translation,+and+Protein+Localization:+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions.">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li><li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation.">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968 (2012).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5.">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Son teknolojik gelişmeler mekanizmaları translasyonel upregulation ilgili daha iyi bir anlayış ya da nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz gibi biyolojik süreçleri içinde belirli mRNA'ların baskı için izin vermiş. Burada açıklanan düşük maliyetli metodoloji nasıl RNA bağlanıcı proteinler hücre adezyon, geçiş ve işgali gibi metastatik işlemleri düzenleyen çalışma hücrelerdeki görüntülenmeyecektir çeviri olayları sağlar.
De novo pr...

Farklı hücresel işlevler tarafından çeviri Yönetmeliği yeni araçlar ve mRNA çeviri ve düzenlenmiş protein sentezi1,2 hücre altı lokalizasyonu belirlemek için yöntemler geliştirmek için birçok araştırma ekipleri yol açtı ,3,4. Bu son teknolojik gelişmeleri içeren çeviri upregulation veya belirli mRNA'ların baskı nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz5 gibi biyolojik süreçler sırasında mekanizmaları gelişmiş bir anlayış için izin ver ,6,7,8. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı veya tehlikeli Kimyasalları ve çoğu laboratuvarları kullanılabilir olmayabilir belirli donanımları gerektirir. Bu nedenle, özellikle bu olası sorunları aşmak için çeviri olaylar hızlı değerlendirmesi için izin vermek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem belirli hücresel süreçler sırasında ortaya çıkan akut translasyonel modülasyon algılar ve ayrıca confocal mikroskobu kullanarak Çeviri Yerelleştirme için sağlar.
Yöntem tanımlamak burada yerelleştirilmiş çeviri Yayilim başlatma merkezleri (SIC)5denilen hücre altı bölmeleri içinde izlemek için kullanılmıştır. SICs yeni doğmakta olan yapışma kompleksleri üzerine yerelleştirilmiş numaralı seribaşı hücrelerde bulunan geçici yapılar vardır. SICs ve yapışma kompleksler farklı olmakla birlikte, onların kaderi yakından bağlantılıdır. Gerçekten de, SICs giderek odak yapışma karmaşık olgunlaşma bir yapışma siteye yapışma başlangıç aşamasında ortadan olduğu bilinmektedir. Bulduk RNA bağlanıcı proteinler özellikle mRNA çeviri (Örneğin, Sam68, FMRP ve G3BP1) kontrol etmek için bilinen ve RNA'ların bunlar içinde zenginleştirilmiş poliadenile yapıları5. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, SIC ilişkili mRNA çeviri bir denetim noktası olanak verecek şekilde davranır düzenlenmesi hücre adezyon birleştirilecek hücreler seribaşı gösterdi. Bu yöntemi, puromisindir birleşme göre yüzey çeviri tahlil (SunSET) algılama adapte bir sürüm düşünülebilir. Aslında sigara radioactively etiketli bir amino asit kullanarak küresel protein sentezi oranları ölçmek için geliştirilmiş, protein puromycilation de novo protein sentezi9görselleştirmek için etkili bir yol sunar. Bu yöntem puromisindir, çeviri erken zinciri fesih ribozom10üzerinden engeller bir antibiyotik iç davranışını kullanır. Gerçekten de, puromisindir yapısal olarak tyrosyl-tRNA, peptid zincirleri bir peptit bağı oluşumu ile elongating içine şirketler için sağlar benzerdir. Ancak, puromisindir bağlama büyüyen bir peptit zincirine yeni bir peptit bağı puromisindir tRNA içinde bulunan hydrolysable ester bağı yerine hydrolysable Amid bağı olduğundan sonraki aminoasil tRNA ile oluşturulmaktadır engeller. Böylece, erken sürümü ile aktif olarak çevrilmiş mRNA9,11' e,12 karşılık gelen çok sayıda kesilmiş puromycilated polipeptitler polipeptitler elongating içine puromisindir birleşmesiyle sonuçları .
Bu yöntemi kullanarak, kısa sürede dul içinde aktif çeviri değerlendirmek mümkün (Örneğin, 5 min) hücresel yapışma antibiyotik ile 5 dk süre takviye hücrelerde puromisindir karşı spesifik bir antikor kullanarak sırasında hücre adezyon sırasında farklı zaman noktalarda5işlem. Çok özel antikorlar karşı puromycilated yan yönettiği bu tahlil duyarlığını güvenmektedir. Puromycilated polipeptid immünfloresan tespiti de confocal görüntüleme sistemleri kullanarak büyük bir hassasiyetle sayısal yeni çevrilmiş mRNA genel hücre altı yeniden bölümlenir sağlar.
Bu nedenle, bu yöntem çok sayıda translasyonel düzenleyici mekanizmaları nöronal granülasyon6,13,14, gibi süreçleri dahil eğitim laboratuvarları için ilgili bir seçenek sunar 15, morphogen mRNA Yerelleştirme ve çeviri sırasında geliştirme16,17. Ayrıca hızlı biyolojik olaylarda, hücre göç, yapışma veya işgal gibi veya sadece translasyonel değişiklikleri5, neden ilaç tedavileri değerlendirmek için yerelleştirilmiş veya bölümlere çeviri eğitimi için de uygun olduğu 7 , 18. genel olarak, bu yöntem, hızlı, hassas ve düşük maliyetli bir şekilde yerelleştirilmiş veya kontrollü çeviri olaylar görselleştirme için sağlar.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>wisent</td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Puroycin antibody 12D10</td><td>EMD millipore</td><td>MABE343</td><td>western blot dilution 1:25,000&lt;br/&gt; Immunofluoresence dilution 1:10,000</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td><td>cell signaling technology</td><td>7076</td><td>western blot dilution 1:8,000</td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td><td>cell signaling technology</td><td>4408</td><td>immunofluoresecence dilution 1:400</td></tr><tr><td>CF568 Phalloidin</td><td>biotium</td><td>00044</td><td>immunofluoresecence dilution 1:400</td></tr><tr><td>Cyclohexmide</td><td>Sigma</td><td>C1988-1G</td><td>50&amp;micro;g/ml final concentration</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>final concentration 1&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>bio-Basic</td><td>PJ593</td><td>2.5&amp;micro;g/ml to 10&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Ibidi &amp;micro;-Dish 35 mm, high, ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7 cells</td><td>from Dr. Mazroui (Universit&amp;eacute; Laval)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fv1000</td><td>olympus</td><td></td><td>confocal imaging system</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td></td><td></td><td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td><td>bio-Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37% Solution</td><td>bio-Basic</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>bio-Basic</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative immunofluorescence to measure global localized translation

MRNA çeviri düzenleyen mekanizmalar mikrop çizgi geliştirme, hücre farklılaşma ve organogenesis, gibi çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra birden çok hastalıklar söz konusu. Çok sayıda yayın inandırıcı belirli mekanizmaları sıkıca mRNA çeviri düzenleyici göstermiştir. Çeviri kaynaklı protein ifade Yönetmeliği artan ilgi çalışma ve de novo protein sentezi cellulo içindetakip roman yöntemleri gelişmesine neden olmuştur. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı yapım onları ve kez okudu olabilir mRNA hedef sayısını sınırlama, karmaşıktır. Bu makale yalnızca temel reaktifler ve ölçmek ve herhangi bir hücre satırında çeşitli koşullarda oluşan değişiklikleri mRNA çeviri görselleştirmek için bir confocal floresan görüntüleme sistemi gerektirir bir yöntem öneriyor. Bu yöntem son zamanlarda zaman böylece biyolojik çeşitli sırasında kısa bir süre için de novo çeviri görselleştirme imkanı sunan, kısa bir süre içinde yapışık hücreleri hücre altı yapıları yerelleştirilmiş çevirisini göstermek için kullanılan işlemler veya değişiklik translasyonel faaliyet belirli uyaranlara yanıt olarak doğrulanması.

Doğru bir şekilde puromisindir birleşme kullanarak çeviri olayları gözlemlemek için her farklı puromisindir birleşme Kinetik (şekil 1)9,11 gösterir çünkü her hücre satırı için en uygun koşulları belirlemek için önemlidir ,12,18. Bu nedenle, puromisindir birleşme doğrulamak için istenen hücre kültürünü ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation at JoVE.com

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

quantitative-immunofluorescence-to-measure-global-localized

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.8K Görüntüleme.  Université Laval. Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Video: Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Genetik

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Biyokimya

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Biyoloji

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Nörobilim

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi and trans-Golgi network. Cellular functions of the Golgi are determined by the characteristic distribution of its resident proteins. The spatial resolution of conventional light microscopy is too low to resolve sub-Golgi structure or cisternae. Thus, the immuno-gold electron microscopy is a method of choice to localize a protein at the sub-Golgi level. However, the technique and instrument are beyond the capability of most cell biology labs. We describe here our recently developed super-resolution method called Golgi protein localization by imaging centers of mass (GLIM) to systematically and quantitatively localize a Golgi protein. GLIM is based on standard fluorescence labeling protocols and conventional wide-field or confocal microscopes. It involves the calibration of chromatic-shift aberration of the microscopic system, the image acquisition and the post-acquisition analysis. The sub-Golgi localization of a test protein is quantitatively expressed as the localization quotient. There are four main advantages of GLIM; it is rapid, based on conventional methods and tools, the localization result is quantitative, and it affords ~ 30 nm practical resolution along the Golgi axis. Here we describe the detailed protocol of GLIM to localize a test Golgi protein.

The precise localization of Golgi residents is essential for understanding the cellular functions of the Golgi. However, conventional optical microscopy is unable to resolve the sub-Golgi structure. Here we describe the protocol for a conventional microscopy based super-resolution method to quantitatively determine the sub-Golgi localization of a protein.

Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...