The author is grateful for the assistance of Mrs. Sharon Spana (University of Sydney) in rodent monitoring, handling and experimentation. The authorwould like to thank Prof. Jonathan Stone and Dr. Dan Johnstone for the assistance in the preparation of this manuscript. PhD funding support has been provided by University of Sydney and Australian Center for Excellence in Vision.

Etik deyimi: protokol 5657 # AEC University of Sydney hayvan bakım kurallarına izler. Anestezi hayvan etik kurul (University of Sydney, AEC # 5657) tarafından onaylanmıştır. 1. Ekipman Hazırlığı <ol><li> Gerçek zamanlı cilt ısısı izleme kullanın. Bilgisayarda açın ve veri toplama donanımı. </li><li> Açık sıcaklık kayıt yazılımı ve sıcaklık 30-35 arası C ayar ve her 100 msn örnekleme sıklığını ayarlayın. </li><li> İsteğe bağlı: çekirdek sıcaklığını sağlamak için Ekle rektal termometre 37.5 ° C&#39;de sabit kalır. </li></ol> Manuel tansiyon aleti 2. Kalibrasyon <ol><li> Bir 250-550 gr sıçan için bir boyut 2 manşet sphygmomanometer.Use yenidoğan kolluğu bağlayın. Bir adaptör tansiyon aleti için manşon tüpünü bağlamak gerekli olabilir. </li><li> Her iki hava tahliye vanasını gevşemesine veya uyarlamak gelen manşon tüpünü ayırarak manşeti Söndürya da. Hiçbir baskı emin olun tüp kalır ve manometre iğne oval / dikdörtgen içinde sıfır aittir. </li><li> Boru, manometre ve manşet arasındaki basıncını kontrol edin. Bu manometre 100 mmHg okuyana kadar enflasyon ampul yumuşak pompalarla şişirin. Basınç sabit kalır emin olun. Yavaş yavaş hava bırakma değeri açarak manşeti söndürün. </li></ol> 3. Hayvan Hazırlık Not: Koyu uyumu gerektiren hafif yaralanma geçmesi için uzaktan iskemi gece önce olan Hayvanlar. Işık hasarı geçiren Hayvanlar karanlık yetiştirme (12 saat ışık: karanlık döngüsü (5 lux)) gerektiren <ol><li> Uyanık veya anesteziye kemirgenlerde ya uzaktan iskemi gerçekleştirin. Hayvanlar sağlıklı bir kas tonusunu olduğundan emin olun. Yeterli kas mevcut olduğunu teyit etmek için üst arka uzuv kısma bu sağlayın. Hafif yaralanmalara karşı RIP kaynaklı koruma yaşı 6 aya kadar sedanter sıçanlarda test edilmiştir. </li><li> R anesteziye hazırlıkIP <ol><li> 60 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin ve intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçanlarda enjekte edilir. Bacak uzatma ve ayak altındaki deriyi sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. derinden Narkoz ise hayvan yok refleksi vardır. Anestezi altında iken kornea kuruluğu önlemek için yapay gözyaşı uygulayın. </li><li> Bir ısı pedi veya 37.5 ° C arasında sabit bir vücut sıcaklığını muhafaza etmek için su ısıtıcı boru dolaşım ya da üzerinde sıçanlar yerleştirin. Alt ekstremite &#39;ayak pedleri yukarı bakacak şekilde yüzüstü pozisyonda sıçan yerleştirin. Sağ ya da sol kol uzak iskemi uğrayabilir. </li></ol></li><li> RIP uyanık hazırlık Not: hayvan deneyleri iki kişi gerekir Uyanık. Bir kişi hayvanı kısıtlayan ve ikinci kişi manuel sfingomanometre çalışır. deneyci kısıtlama işleyicileri yaralanma riskini artırır olarak yordamı gerçekleştirmek için emin olmalıdır. Uzaktan iskemi uygulanan fareler t klimalı olmalıdıro manuel kısıtlama. Sezgisel kılavuzlar bağlı olarak el emniyet birkaç hafta içinde 5 dakikalık bir maksimum 30 saniye arasında ilerleme olmalıdır. Manuel kısıtlama acclimatise başarısız Çekingen hayvanlar uyanık deney dışında tutulmalıdır. Son olarak, manuel kısıtlama doğru RIP çalışma sonuçlarını yorumlamak için kullanılması gereken hayvanlara stres (ve potansiyel olarak çalışmaya boşa tanıtmak) ve sahte kohort (inflamasyon olmadan manşet yerleştirme) neden olabilir. <ol><li> 15 cm x 30-50 cm parçaya bir havlu kesin ve arka bacaklarda üstüne başını örten, sıçan omurga dik ve kısa kenarı yerleştirin. </li><li> Sıçan gövde altında kısa kenarı sıkıca sokmak ve havlu kalan uzun kenarı ile sıçan sarmak başlar. Bir yatar pozisyonda kol altında sarılı hayvan sabitleyin. Sıçan sol kolunun altında tutulursa, havlu gelen sıçan sağ ekstremite özgür. </li></ol></li></ol> 4. Uygulama of Cilt Sıcaklık Probu <ol><li> Iskemi geçmesi ve footpad cilt probu yerleştirmektir sıçan bacak uzatın. Sıcaklık probu ve deri arasındaki temasını maksimize etmek için cilt probunu yerleştirin. Sıkıca footpad soruşturmanın itin ve kağıt bant ile prob yapıştırmayın. </li><li> Sıcaklık kayıt yazılımı sıcaklığını takip ederek cilt prob yerleşimini kontrol edin. Cilt ısısı 30-34 ° C arasında ve sabit kalır emin olun. 1-2 dakika boyunca deri sıcaklığını takip edin. Sıcaklık kararsız veya 30 ° C&#39;nin altında ise deri probu ayarlayın. </li></ol> 5. Uzaktan İskemi <ol><li> Manşeti Deflate ve hava basınç valfi kapalı olduğundan emin olun. Bacak uzatmak ve gevşek üst arka bacak üzerinde Manşeti kuşatmak. Pozisyonda gevşek manşet tutmak için bacak ve alt basamak uzatmak için işaret parmağı ve başparmak kullanın. </li><li> Uyanık hayvanlar artışlarla 160 mmHg, ve anesteziye hayvanın manşet basıncı kaldırın180 mmHg kaf basıncı ase. Not: sıçanların anesteziye kan basıncı 120-140 mmHg arasında değişir ve zaman bilinçli 160 mmHg yükselir. Doğru basınca ulaşıldığında zamanlayıcı ve ayak sıcaklığı kayıtları başlar. Not: Ayak sıcaklığı sabit basınç 5 dakika sonra 2 ° C ile damla gerekir. </li><li> Iskemi boyunca hayvanın &quot;diz&quot; yukarıdaki manşet pozisyonunu koruyun. Manşet basıncı bir kaç dakika sonra düşmeye başlayacak, ya da sıçan uzuv hareket ediyorsa. </li><li> Art arda pompalama istenen kaf basıncı tekrarlayan kısa bir patlama korumak için öbekler halinde enflasyon ampul pompa </li><li> Uzaktan iskemi dk 5 ila 15 için sürekli olarak teslim edilebilir. iskemi reperfüzyon protokolü bir müdahale 5 dk reperfüzyon ile 5 dk iskemi 2 dönemlerini kapsamaktadır. </li><li> Hava basıncı valfini gevşeterek kaf basıncını söndürün. Iskemi pro boyunca sıcaklık değişimini kontroltokol. Manşeti bırakın. </li><li> Yaralanma deneme ile devam edin. Anestezi etkisi altında hayvanlar bir ısı pedi üzerine yerleştirilmesi gerekir. Ayaktan kadar hayvanları izlemeye devam edin. Hayvanlar yürüyüş kadar konut iade edilemez. </li></ol> 6. Işık Yaralanma - Retina Dejenerasyon Modeli <ol><li> Karanlık bir gecede hayvanları (12-15 saat) uyarlar. Hemen uzaktan iskemi klima veya sahte uzaktan iskemi (hayvan kısıtlama) yiyecek ve su ile Perspex konut yer hayvanları takip. </li><li> 24 saat 9&#39;da Perspex yuvasının altında bulunan floresan aydınlatma (1.000 lux) açın. Işığa maruz kalma sonrasında, 7 gün boyunca döngüsel aydınlatma loş hayvanların dönün. </li></ol> 7. Sonrası uzaktan İskemi İşlemleri <ol><li> Elektroretinogram (ERG) ile Vision değerlendirme: Not: ERG set-up ve flaş protokolü BRANDLI ve Stone 26 izledi. <ol><li> Koyu bir gecede hayvanları adapte (12-15 saat). AltındaBu ışıklandırma ketamin ve ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu (60 mg / kg ve 5 mg / kg, sırası ile) ile hayvanların anestezisi dim. Midriyatik (atropin sülfat% 1.0), kornea anestetik (Proxymetacaine% 0,5). </li><li> Kornea hidrasyon uygulayın (Carbomer polimer) göz kornea hemen düşer. Kornea hidrasyon korumak için 20 dakika aralıklarla göz jeli uygulayın. </li><li> Istikrarlı ERG kayıtları yardım etmek için göz küresi etrafında gevşek bağlanmış iplik çizin. Bir rektal prob kullanarak sıcaklığı izlemek ve 37-37,5 ° C &#39;de, hayvanın vücut ısısını korumak. </li><li> Bir Ganzfeld entegre kürenin içinde başını yerleştirin. Not: Ganzfeld göze LED&#39;ler üniforma katiyen yanıp sunan tam programlanabilir ışık uyarıcıdır. </li><li> Hafifçe kornea dokunmadan ısmarlama 4 mm platin pozitif elektrot ve ağız içine yerleştirilen bir 2 mm çapında Ag / AgCl elektrot kullanılarak pelet elektroretinogram kaydedin. Paslanmaz çelik iğne her iki elektrotlar Referanskıç içine deri altından yerleştirilen. </li><li> 2 kHz edinme oranı ile 0.3-1,000 Hz (-3 dB) bant geçiren ayarıyla Tutanak sinyalleri (AD Instruments). Istikrarlı bir ERG kayıt kayıtları başlamadan önce konuyu 10 dk karanlık adaptasyonu hayvan kurulduktan sonra. </li><li> Daha önce BRANDLI ve Stone 26 tarafından açıklanan flaş protokolünü takip ediniz. <ol><li> Flaş süresini programlamak (biz yanıp söner süresi 1-2 msn kullanılır) ve -4.4 günlük scot cd.sm -2 2.0 onun yoğunluğunu ayarlayın. Retina fonksiyonu ölçmek için parlak yanıp söner (2.0 günlük scot cd.sm -2, 1 ms) kullanın. Bu çalışmada kontrol, ışık yaralanma ve RIP ile hafif yaralanma arasındaki karşılaştırma olduğunu. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. TÜNEL tahlili <ol><li> Fenobarbital aşırı dozda (100 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile hayvanlar öldürülür. Gözleri enükleasyon ve% 4 paraformaldehid düzeltmek. </li><li> Cyroprotecting önce PBS içinde gözleri yıkayıngözler, gece boyunca sükroz% 30 (a / h). Ekim bileşik gözleri göm ve bir kriyostat kullanılarak 20 mikron sagital kesitler halinde kesilmiş. </li><li> Maslim ark protokolü takip DAPI boyama ile retina bölümlerde TÜNEL tahlil gerçekleştirin. 27 </li><li> Retina TÜNEL sayım için floresan mikroskobu kullanarak. TÜNEL hücreleri dış nükleer tabaka (onl) kaydedildi; fotoreseptör çekirdekleri içeren retinanın dış tabakası. Bu çalışmada, TÜNEL sayımı, her tedavi grubu için 5 gözlü, her bir göz için üç kopya halinde yapılmıştır. </li><li> Karşılaştırmak istatistiksel gruba tek yönlü ANOVA kullanın kontrolü, hafif yaralanma ve hafif yaralanma + RIP sıçan anlamına geliyor. </li></ol>

The author has nothing to disclose.

Kemirgen arka bacak iskemisi başarılı bir şekilde manuel tansiyon aleti ile uyarılan ve retina fotoreseptör için nöro teslim manşet oldu. Işık yaralanma 9,28 den fotoreseptör iskemik klima kaynaklı koruma ile tutarlı bir bulgu. Esas olarak, uzaktan iskemi dokulara kısa bir oksijen deprivasyonuna neden olur. Bu nedenle, uzak iskemik önkoşullamanın iskemik klima veya alternatif olarak adlandırılan iskemik hoşgörü, hipoksik önkoşullama ve bir dereceye kadar, ...

En hayatta, belki de, metabolik stres karşısında dokuları subletal iskemi 1,2 bir süre ile önceden klima geliştirilebilir. Pratik açıdan İskemik önşartlama (IP) doku deneyimlerinden böyle bir sonraki iskemik hakaret olarak daha şiddetli stres, önce subletal iskemi doku maruz vardır. Hayvan modellerinde, IP beyin, retina, kalp ve akciğerler 3-6 çarpıcı bir koruma sağlar. Buna karşılık, inme hastalarında gözlemler önceki geçici iskemik atak ve daha iyi klinik sonuçlar 7,8 arasında bir bağlantı göstermiştir. IP ayrıca iskemik olmayan yaralanmalar 9 retina fotoreseptörleri korur. Farklı doku ve yaralanmalarda IP etkinliği tüm dokuda bulunan hücre canlılığının doğuştan gelen bir mekanizma aktive olduğunu göstermektedir. Miyokardın İskemik ön şartlama, yukarı doğru düzenleme aracılığıyla koruyucu etkileri olduğu ileri sürülmüştüradenozin serbest bırakılması yoluyla veya mitokondriyal ATP potasyum kanallarının 10,11 açıklıktan çok metabolik yolları düzenleyen bilinen hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) &#39;nin. Adenozin bırakma ve ATP potasyum kanalları bugüne kadar iskemik klima nöroprotektif mekanizmalar içine araştırmalar, anti-eksitotoksisitesi, anti-apoptotik ve anti-inflamatuar yolların 12,13 modifikasyon odaklanmış olan, serebral iskemi karıştığı fakat. Genel olarak, nöronlar korumak için iskemik klima moleküler sürecin anlaşılması sınırlıdır. Uzaktan iskemik önkoşullama girişimleri daha az kritik dokularda iskemi oluşturarak uzak son derece önemli organları (kalp, beyin, akciğer) şart için. Arka bacak ile uzaktan iskemik ön şartlama (RIP) inme, 14-17 arasında, kemirgen modellerinde nöro-koruyucu olduğu gösterilmiştir. bizim tarafımızdan açıklanan yöntem, basit, güvenilir ve non-invazif Prot sağlarRIP uyarılması için ocol. RIP protokolleri büyük çoğunluğu üst arka bacak bulunan femoral arter kolayca tespit ve cerrahi sıkıştırma ve turnike uygulama için erişilebilir muhtemelen çünkü, arka uzuv içerir. Beyin ve cilt koruma çalışmaları için invazif ekstremite iskemik çalışmalarda, iskemi, kasık ligament femoral arter ayrılması ve femoral arter 2,15,18 sıkıştırarak endüklenir. ekstremite Kesilen ya da femoral arter ya da sıkıştırma kaynaklanan iskemi bir pals kaybı azalması oksijenlenme ve cilt sıcaklığında bir düşüş de dahil olmak üzere bacak değişiklikler ile teyit edilmiştir. Uzaktan iskemi lazer Doppler ultrason veya Doppler 17-19 kullanılarak nabız kaybı ile teyit edilebilir. Cilt sıcaklığı ilişkisi 20,21 doğrusal olmayan olmasına rağmen Doppler alternatif olarak kullanılabilir. Doğru sıcaklık kayıtları laboratuarlar ve can olağanKolayca uzak iskemik çalışmalar içine dahil edilebilir. Cerrahi sıkma femoral bir alternatif turnike kullanılarak iskemi indüksiyon olduğunu. Turnike uygulama kabı sıkma ile elde edilene karşılaştırılabilir iskemi üretir; Kutchner ve diğ. non-invaziv turnike için sıkma invaziv femoral arter karşılaştırıldı ve her iki yöntem flep iskemi 18 bir plastik cerrahi modelinde ekstremite kan akımını ve daha az cilt hasarı durduruldu bulundu. Bacağı veya kolu ya Kesilen ve sistolik kan basıncının üzerinde manşon basıncı yükselterek domuz ve insan 17,19,22 iskemik hasara karşı koruyucu olduğu bulunmuştur. Farklı turnike iskemik tansiyon ölçme veya elastik bant 17,22,23 kullanımını içerir uzak uyaran yaklaşımları. Ancak, iskemi ikna etmek için bir elastik bant kullanımı güvensiz bir yöntem basınç bir düzenlemesiz miktarda potansiyel veren yükselişi500 mmHg üzerinde basınç yükselir ile ekstremite, insanlarda 24 kaydedilmektedir. Bundan başka, bir elastik bant ile kol veya bacak iskemisi Evans mavi boya, myofiber geçirgenliği 25 in vivo bir işaretleyici ile değerlendirildiği gibi, bandın 23 çıkarılmasından sonra farelerde kas hasarına yol açar. Bunun aksine, turnike kontrollü bir basınç dağıtım tansiyon aleti 17,19,22,26 bağlı kan basıncı ölçümü kullanılarak elde edilebilir. Bu çalışmada, fotoreseptör dejenerasyonu hafif bir yaralanma modeli uzaktan iskemik ön koşullandırma ve nöro-koruyucu etkinliğini göstermek için kullanılmıştır. Uzaktan iskemi hafif yaralanma hemen önce uyarılan ve retina fonksiyon testleri ile teyit gibi sonraki fotoreseptör dejenerasyonu engellenmiştir. Ekteki video non-invaziv uzaktan iskemi uygulamasını gösterecektir.

<table><tbody><tr><td>Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer</td><td>Welch Allyn</td><td>DS56</td><td>Manual Sphygmomanometer</td></tr><tr><td>Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-102-1</td><td>Limb blood pressure cuff</td></tr><tr><td>Luer lock adaptor</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-178</td><td>Adaptor for neonatal cuff</td></tr><tr><td>Thermistor pod</td><td>AD Instruments</td><td>ML 309</td><td>skin tempertature unit</td></tr><tr><td>Skin temperture probe</td><td>AD Instruments</td><td>MLT 422/A</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab, 4 channel acquistion hardware</td><td>AD Instruments</td><td>PL 35044</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic blanket system with flexible probe</td><td>Harvard Appartus</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>Towel</td><td></td><td></td><td>optional: awake remote ischemia</td></tr><tr><td>Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml)</td><td>Abbot Animal Health</td><td>05260-05</td><td>optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr></tbody></table>

remote limb ischemic preconditioning:  a neuroprotective technique in rodents

Öldürücü iskemi etkilenen dokuda endogen mekanizmalar yukan doğru düzenlenmesi vasıtasıyla daha sonra, daha ağır iskemiye karşı dokuları korur. Öldürücü iskemi uzaktan dokularda koruyucu mekanizmalar artırdığı gösterilmiştir. Memelilerin arka bacak iskemi (5-10 dk), kısa bir süre, beyin, akciğer, kalp ve retinada kendini koruma tepkileri indükler. etki uzak iskemik önkoşullamanın (RIP) olarak bilinir. Bu hayati organları korumak terapötik umut verici yoludur ve kalp ve beyin yaralanmaları için klinik çalışmalarda altında zaten. Bir sıçan, özellikle arka uzuv - - iskemik Bu yayın bir uzuv yapma kontrollü, minimal invaziv yöntem gösterilmektedir. İnsan yenidoğanlarda kullanılmak üzere geliştirilen bir kan basıncı manşet manuel tansiyon aleti bağlı ve arka bacak üst kısmı 160 mmHg basınç uygulamak için kullanılır. Cilt sıcaklığını tespit etmek için tasarlanmış bir sonda ischemi doğrulamak için kullanılırBir bacak arterlerinin basınç kaynaklı tıkanıklığı nedeniyle cilt sıcaklığında düşüş, ve manşet bırakılmasını takip sıcaklık artışını kaydederek. RIP Bu yöntem parlak ışık kaynaklı hasar ve dejenerasyona karşı sıçan retinaya koruma sağlamaktadır.

160 mmHg üzerinde yükselmiş bir kan basıncı manşet Şekil 1B açıkça görüldüğü gibi arka bacak kan akışını durdurur. doku oksijenasyonu eksikliği bir iskemi-reperfüzyon protokolü (Şekil 2) için hayvanın ayak sıcaklığını düşürerek bir sonuçlandı. Ayak sıcaklığı (33 ° C) manşet (32 ° C) sönük iken yükselen kaf basıncı yüksekliği (31 ° C) sırasında çekirdek sıcaklığından daha düşük ve güvenilir azaltılmış oldu. Tek bir 1000 lux ...

Watch this Scientific Journal Video about Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents at JoVE.com

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Uzaktan iskemik önkoşullama (RIP) zarar strese karşı koşullandırma dokuların bir yöntemdir. Biz 5-10 dakika bir tansiyon aleti manşet şişirilerek, arka bacak uzaktan iskemi bir yöntem kurduk. RIP nöroprotektif yetenekleri kemirgenlerde retina dejenerasyonu modelinde gösterilmiştir.

Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullanma: Kemirgenler Bir Nöroprotektiftir Tekniği

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

remote-limb-ischemic-preconditioning-neuroprotective-technique

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.0K Görüntüleme.  University of Sydney.  Uzaktan iskemik önkoşullama (RIP) zarar strese karşı koşullandırma dokuların bir yöntemdir. Biz 5-10 dakika bir tansiyon aleti manşet şişirilerek, arka bacak uzaktan iskemi bir yöntem kurduk. RIP nöroprotektif yetenekleri kemirgenlerde retina dejenerasyonu modelinde gösterilmiştir. 

Video: Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

Soğuk önkoşullamanın nöro-Çalışması için Stratejiler

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

Nörobilim

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Odak Serebral İskemi Erken İskemik Tolerans tetikleyebilecek bir Yeterli Önkoşullama Uyarıcı olarak bilateral Ortak Karotis Arter Tıkanıklığı

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Tıp

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Murin Model Hindlimb İskemi

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Biyoloji

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

Spinal Kord İskemi-reperfüzyon bir Mürin Modelinde Torasik Aort Tıkanıklığı tarafından tekrarlanabilir Parapleji

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Kemirgen Retina ve Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullamanın Koruyucu Etkileri Fonksiyonu Değerlendirmek Üzere elektroretinogram kullanma

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Farelerde Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma ve Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ardından Nörovasküler Koruma Kantitasyonu

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Langendorff-perfüze sıçan Hearts indüksiyon ve İskemi-reperfüzyon Hasarı Değerlendirilmesi

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably reproduce the human disease are necessary to develop new therapies for this disease. The mouse hindlimb ischemia model has been widely used for this purpose, but the standard practice of inducing acute limb ischemia by ligation of the femoral artery can result in substantial tissue necrosis, compromising investigators&#39; ability to study the vascular and skeletal muscle tissue responses to ischemia. An alternative approach to femoral artery ligation is the induction of gradual femoral artery occlusion through the use of ameroid constrictors. When placed around the femoral artery in the same or different locations as the sites of femoral artery ligation, these devices occlude the artery over 1 - 3 days, resulting in more gradual, subacute ischemia. This results in less substantial skeletal muscle tissue necrosis, which may more closely mimic the responses seen in human PAD. Because genetic background influences outcomes in both the acute and subacute ischemia models, consideration of the mouse strain being studied is important in choosing the best model. This paper describes the proper procedure and anatomical placement of ligatures or ameroid constrictors on the mouse femoral artery to induce subacute or acute hindlimb ischemia in the mouse.

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

Akut ve Subakut Fare Arka ayağın İskemi Yöntemleri

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.