The author is grateful for the assistance of Mrs. Sharon Spana (University of Sydney) in rodent monitoring, handling and experimentation. The authorwould like to thank Prof. Jonathan Stone and Dr. Dan Johnstone for the assistance in the preparation of this manuscript. PhD funding support has been provided by University of Sydney and Australian Center for Excellence in Vision.

Declaração de ética: O protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais de University of Sydney, AEC # 5657. A anestesia foi aprovado pelo comitê de ética animal (Universidade de Sydney, AEC # 5657). 1. Equipamentos Preparação <ol><li> Use rastreamento em tempo real temperatura da pele. Ligue computador e hardware de aquisição de dados. </li><li> Software de gravação de temperatura aberto e ajustar ajuste de temperatura a entre 30-35 ° C e a frequência da amostragem para cada 100 ms. </li><li> Opcional: termômetro retal Inserir para garantir que a temperatura do núcleo permanece estável a 37,5 ° C. </li></ol> 2. Calibração do Manual Sphygmomanometer <ol><li> Conecte neonatal braçadeira para sphygmomanometer.Use um manguito de tamanho 2 para um 250-550 g de rato. Um adaptador pode ser necessário ligar o tubo de manguito para o esfigmomanômetro. </li><li> Desinflar o manguito por qualquer afrouxamento da válvula de liberação de ar ou desligar o tubo de manguito da adaptaçãoou. Garantir que não haja pressão permanece na tubulação e a agulha do manômetro repousa em zero dentro do oval / retângulo. </li><li> Verifique a pressão entre tubos, manómetro e braçadeira. Inflar o manguito com bombas suaves do bulbo inflação até que ele lê 100 mmHg no manômetro. Assegurar a pressão permanece constante. Desinflar o manguito abrindo lentamente o valor da liberação do ar. </li></ol> 3. Preparação de animais Nota: Os animais que devem ser submetidos a lesão luz requerem adaptação escuro a noite antes da isquemia remoto. Animais submetidos a danos leves exigem escuro criação (12 hr luz: ciclo escuro (5 lux)) <ol><li> Execute isquemia remoto em ambos os roedores acordado ou anestesiados. Certifique-se de que os animais têm um tônus ​​muscular saudável. Garantir isso por beliscar a pata traseira superior para confirmar que não está presente muscular adequado. Proteção induzida por RIP contra a lesão leve foi testado em ratos sedentários até 6 meses de idade. </li><li> Preparação anestesiados para RIP <ol><li> Injectar ratos com uma injecção intraperitoneal de 60 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina. Verifique a profundidade da anestesia através da extensão da perna e que comprime a pele na parte inferior do pé. O animal não tem reflexo se ele está profundamente anestesiado. Aplicar lágrimas artificiais para evitar o ressecamento da córnea, enquanto sob anestesia. </li><li> Coloque ratos em cada uma almofada de calor ou tubos do aquecedor de água de circulação para manter a temperatura corporal constante de 37,5 ° C. Posicione o rato em decúbito ventral com pés de apoio dos membros inferiores para cima. Direito ou membro esquerdo pode sofrer isquemia remoto. </li></ol></li><li> Awake preparação para RIP Nota: Awake experimentação animal requer duas pessoas. Uma pessoa restringe o animal ea segunda pessoa opera o esfigmomanômetro manual. Os experimentadores devem estar confiantes para realizar o procedimento de restrição aumenta o risco de ferimentos para os tratadores. Os ratos submetidos a isquemia remoto deve ser condicionada to contenção manual. Dependendo orientações intuitivas contenção manual deve ser progresso de 30 segundos a um máximo de 5 minutos ao longo de um número de semanas. Animais tímidos que não conseguem se aclimatar à contenção manual deve ser excluído da experimentação acordado. Por último, a contenção manual é susceptível de causar estresse (e potencialmente introduzir fatores de confusão para o estudo) para animais e um grupo sham (colocação de manguito sem inflamação) deve ser usado para interpretar com precisão os resultados do estudo RIP. <ol><li> Cortar uma toalha em uma 15 cm x 30-50 cm de peça e colocar a borda curta perpendicular à lombada do rato, que cobre a cabeça ao topo dos membros posteriores. </li><li> Dobre a borda curta sob o dorso do rato com força e começar a embrulhar o rato com a borda longa remanescente de toalha. Fixe o animal enrolado embaixo do braço em posição supina. Se o rato é realizada sob o braço esquerdo, libertar membro direito do rato a partir da toalha. </li></ol></li></ol> 4. Aplicação of Temperatura Pele Probe <ol><li> Estender a perna do rato, que é submetida a isquemia e colocar a sonda na pele da planta da pata. Posicionar a sonda de pele para maximizar o contacto entre a sonda de temperatura e a pele. Empurre firmemente a sonda na pata e apor a sonda com fita de papel. </li><li> Verifique a colocação da sonda pele, controlando a temperatura no software de gravação de temperatura. Certifique-se de que a temperatura da pele fica entre 30-34 ° C e mantém-se estável. Acompanhe a temperatura da pele por 1-2 min. Ajustar a sonda na pele, se a temperatura é instável ou abaixo de 30 ° C. </li></ol> 5. A isquemia remoto <ol><li> Esvaziar a manga e assegurar a válvula de pressão de ar é fechada. Estenda a perna e vagamente cercar a braçadeira no membro posterior superior. Use o dedo indicador e polegar para estender a perna e os dígitos mais baixos para manter a manga na posição afrouxada. </li><li> Aumentar a pressão cuff do animal anestesiado a 160 mmHg, e em animais acordados increase a pressão da braçadeira a 180 mmHg. Nota: A pressão arterial de ratos anestesiados varia 120-140 mmHg e sobe para 160 mmHg quando estiver consciente. Começar as gravações temporizadas e temperatura pé uma vez que a pressão correcta seja alcançada. Nota: A temperatura do pé deve cair de 2 ° C após 5 min de pressão constante. </li><li> Manter a posição da manga de cima &quot;joelho&quot; do animal durante todo o isquemia. Pressão do balonete começará a cair depois de alguns minutos, ou se o membro do rato está se movendo. </li><li> Repetidamente bombear o bulbo inflação em rajadas curtas para manter a pressão do balonete desejado repetitivo breve explosão de bombeamento </li><li> Isquemia remoto pode ser libertado continuamente para entre 5 e 15 min. O protocolo de reperfusão de isquemia inclui dois períodos de 5 minutos de isquemia com um interveniente 5 min de reperfusão. </li><li> Esvaziar a pressão do balonete, desapertando a válvula de pressão de ar. Verifique a mudança de temperatura ao longo da isquemia prótocol. Solte a braçadeira. </li><li> Continuar com a experimentação lesão. Animais sob o efeito de anestesia terá de ser colocado sobre uma almofada de calor. Continue a acompanhar os animais até ambulatorial. Os animais não podem ser devolvidos à habitação até caminhar. </li></ol> 6. Lesão Light - Degeneração Retinal Modelo <ol><li> Escuro adaptar os animais durante a noite (12-15 horas). Imediatamente após isquemia condicionado remoto ou isquemia remoto sham (contenção animal) animais lugar na habitação Perspex com comida e água. </li><li> Ligue iluminação fluorescente (1.000 lux) localizado acima habitação perspex, às 9 horas, durante 24 horas. Após a exposição de luz, retornar os animais para escurecer iluminação cíclico durante 7 dias. </li></ol> Procedimentos Isquemia 7. Pós-remotos <ol><li> Avaliação visão com Eletrorretinograma (ERG): Nota: O ERG set-up e protocolo de flash seguido Brandli e Pedra 26. <ol><li> Escuro adaptar animais durante a noite (12-15 h). Debaixodim iluminação vermelha anestesiar os animais por injecção intraperitoneal de cetamina e xilazina (60 mg / kg e 5 mg / kg, respectivamente). Midriático (sulfato de atropina, 1,0%), anestesia corneana (proxymetacaine 0,5%). </li><li> Aplicar a hidratação da córnea (Carbomer polímero) colírio imediatamente na córnea. Aplique gel olho em intervalos de 20 min para manter a hidratação da córnea. </li><li> Desenhar uma linha frouxamente amarrado ao redor do globo ocular para ajudar gravações ERG estáveis. Monitorar a temperatura usando uma sonda retal e manter a temperatura corporal do animal em 37-37,5 ° C. </li><li> Posicionar a cabeça dentro de uma esfera de integração de Ganzfeld. Nota: O Ganzfeld é um estímulo de luz totalmente programável que fornece uniformes Whit pisca dos LEDs para o olho. </li><li> Grave usando o electrorretinograma de 4 mm de platina do eléctrodo positivo feito por encomenda ligeiramente tocar na córnea e um eléctrodo de 2 mm de diâmetro sedimento de Ag / AgCl inseridos na boca. Referência ambos os eléctrodos a uma agulha de aço inoxidávelinserido por via subcutânea na garupa. </li><li> Gravar sinais com ajuste passa-banda de 0.3-1,000 Hz (-3 dB), com uma taxa de aquisição de 2 kHz (AD Instruments). Depois de uma gravação ERG estável é estabelecida assunto o animal a uma adaptação 10 min escuro antes de iniciar as gravações. </li><li> Siga o protocolo de flash como previamente descrito por Brandli e Pedra 26. <ol><li> Programar a duração do flash (que usamos flashes 1-2 ms de duração), e defina sua intensidade para -4,4 a 2,0 log scot cd.sm -2. Use flashes brilhantes (2,0 log scot cd.sm -2, 1 ms) para medir a função da retina. Neste estudo é a comparação entre o controle, lesão leve e lesão leve com RIP. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. Ensaio TUNEL <ol><li> Eutanásia animais por injecção intraperitoneal de sobredosagem fenobarbital (100 mg / kg). Enuclear os olhos e corrigir em paraformaldeído a 4%. </li><li> Lavar os olhos em PBS antes cyroprotectingolhos durante a noite em sacarose a 30% (w / v). Incorporar os olhos em composto outubro e corte em 20 mm cortes sagitais, utilizando um criostato. </li><li> Realizar o ensaio TUNEL em secções da retina com coloração DAPI seguindo o protocolo de Maslim et al. 27 </li><li> Use microscopia de fluorescência para a contagem de TUNEL da retina. Células TUNEL foram registados a partir de a camada nuclear externa (ONL); a camada mais externa da retina que contém núcleos fotorreceptoras. Neste estudo, as contagens de TUNEL foram feitas em triplicado para cada olho, com cinco olhos para cada grupo de tratamento. </li><li> Use one-way ANOVA para grupo estatística comparar os meios de controle, lesão leve, e de prejuízo + RIP ratos leves. </li></ol>

The author has nothing to disclose.

Roedor membro posterior isquemia foi induzida com sucesso com um esfigmomanômetro e algemá entregar neuroproteção para os fotorreceptores da retina. Um achado consistente com o condicionamento induzido proteção isquêmico de fotorreceptores de uma lesão leve 9,28. Essencialmente, isquemia remoto faz com que a privação breve oxigênio aos tecidos. Assim, o pré-condicionamento isquémico remoto tem muitas semelhanças com o condicionamento isquémico ou alternativamente de...

A sobrevivência da maior parte, talvez todos, os tecidos do rosto de stress metabólico podem ser melhoradas por condicionamento prévio com um período de isquemia subletal 1,2. Pré-condicionamento isquêmico (IP), em termos práticos é a exposição dos tecidos à isquemia sub-letal, antes de as experiências de tecido estressores mais graves, como um insulto isquêmico subseqüente. Em modelos animais, IP fornece protecção notável para o cérebro, retina, coração e pulmões 3-6. Do mesmo modo, observações em pacientes com AVC mostrou uma ligação entre os ataques isquêmicos transitórios anteriores e melhores resultados clínicos 7,8. IP também protege fotorreceptores da retina de lesões não-isquêmica 9. A eficácia de IP em diversos tecidos e lesões sugere que está a activar um mecanismo inato de sobrevivência de células presente em todo o tecido. Pré-condicionamento isquémico do miocárdio foi sugerido ter efeitos protectores, através da regulação positivado factor de hipóxia indutível (HIF), conhecido para regular muitos processos metabólicos através da libertação de adenosina ou através da abertura de canais de potássio ATP mitocondriais 10,11. Canais de liberação de adenosina e ATP potássio estão envolvidos na isquemia cerebral, mas, as investigações sobre os mecanismos neuroprotectores de condicionamento isquêmico até à data têm sido focados na modificações anti-excitotoxicity, vias anti-apoptóticos e anti-inflamatórios 12,13. Em geral, a compreensão do processo molecular de condicionamento isquémico para protecção dos neurónios é limitada. Tentativas de pré-condicionamento isquêmico remoto para condicionar órgãos distantes criticamente importantes (coração, cérebro, pulmão), gerando isquemia em tecidos menos críticas. Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP), usando o membro posterior foi demonstrado ser neuroprotectores, em modelos de roedores de acidente vascular cerebral 14-17. O método descrito por nós proporciona um prot simples, fiável e não-invasivaOCOL para induzir PIR. A grande maioria dos protocolos RIP envolvem o membro posterior, presumivelmente porque a artéria femoral localizado no membro posterior superior pode ser facilmente identificado e o acesso para fixação cirúrgica e aplicação torniquete. Em estudos de isquemia dos membros invasivo para o estudo do cérebro e de protecção da pele, isquemia é induzida através da separação da artéria femoral dos ligamentos na virilha e aperto da artéria femoral 2,15,18. A isquemia resultante do aperto ou da artéria femoral ou cuffing membro foi confirmada por alterações no membro, incluindo uma perda de pulso, diminuição da oxigenação e uma queda na temperatura da pele. Isquemia remoto pode ser confirmada pela perda de pulso através da utilização de Doppler a laser ou ultra-som Doppler 17-19. A temperatura da pele pode ser utilizada como alternativa ao Doppler embora a relação não é linear 20,21. Gravações de temperatura precisas são comuns em laboratórios e lataser facilmente incorporado em estudos isquémicos remotos. Uma alternativa para a fixação femoral cirurgia é a indução de isquemia através de um torniquete. Garroteamento produz isquemia comparável ao obtido com pinçamento navio; Kutchner et ai. em comparação artéria femoral invasivo de aperto para um torniquete não-invasivo e encontrou os dois métodos interrompido o fluxo de sangue para o membro e reduziu os danos da pele em um modelo de cirurgia plástica de retalho de pele isquemia 18. Cuffing ou a perna ou o braço e aumentar a pressão da braçadeira para acima da pressão arterial sistólica foi encontrada para ser protetor contra o dano isquêmico em suínos e humanos 17,19,22. Torniquete diferentes abordagens para induzir remoto isquêmico incluem o uso de um manguito de pressão arterial ou um 17,22,23 elástico. No entanto, o uso de uma faixa elástica para induzir isquemia é um método inseguro, potencialmente dar origem a uma quantidade não regulada de pressão nomembro, com aumentos de pressão acima de 500 mmHg a ser gravado em humanos 24. Além disso, a isquemia do membro utilizando uma banda elástica conduz a lesão muscular em ratos, após a remoção da banda 23, como avaliado por Evans Blue Dye, um marcador in vivo de células musculares permeabilidade 25. Em contraste, a entrega de uma pressão controlada para o torniquete pode ser conseguido usando um medidor de pressão ligado a um 17,19,22,26 esfigmomanómetro. Neste estudo, um modelo de lesão de luz de degeneração de fotorreceptores foi usada para demonstrar a eficácia neuroprotectora de pré-condicionamento isquémico remoto. Remoto isquemia foi induzida imediatamente antes da lesão luz, e impediu subsequente degeneração de fotorreceptores como confirmado por testes de função da retina. O vídeo que acompanha irá demonstrar a aplicação de isquemia remoto não-invasiva.

<table><tbody><tr><td>Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer</td><td>Welch Allyn</td><td>DS56</td><td>Manual Sphygmomanometer</td></tr><tr><td>Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-102-1</td><td>Limb blood pressure cuff</td></tr><tr><td>Luer lock adaptor</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-178</td><td>Adaptor for neonatal cuff</td></tr><tr><td>Thermistor pod</td><td>AD Instruments</td><td>ML 309</td><td>skin tempertature unit</td></tr><tr><td>Skin temperture probe</td><td>AD Instruments</td><td>MLT 422/A</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab, 4 channel acquistion hardware</td><td>AD Instruments</td><td>PL 35044</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic blanket system with flexible probe</td><td>Harvard Appartus</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>Towel</td><td></td><td></td><td>optional: awake remote ischemia</td></tr><tr><td>Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml)</td><td>Abbot Animal Health</td><td>05260-05</td><td>optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr></tbody></table>

remote limb ischemic preconditioning:  a neuroprotective technique in rodents

Isquemia subletal protege os tecidos contra subsequente isquemia, mais severa a regulação positiva através de mecanismos endógenos no tecido afectado. Isquemia subletal também tem sido demonstrado que regulam positivamente os mecanismos de protecção nos tecidos remotos. Um breve período de isquemia (5-10 min) na pata traseira dos mamíferos induz respostas de auto-proteção no cérebro, pulmão, coração e retina. O efeito é conhecido por pré-condicionamento isquémico remoto (PIR). É uma maneira terapeuticamente promissora de proteger os órgãos vitais, e já está em fase de testes clínicos para o coração e cérebro lesões. Esta publicação mostra, um método minimamente invasivo controlada de fazer um galho - especificamente o membro posterior de um rato - isquêmica. Um medidor de pressão desenvolvido para uso em recém-nascidos humanos está ligado a um medidor de tensão manual e usado para aplicar pressão de 160 mmHg, em torno da parte superior do membro posterior. Uma sonda concebida para detectar a temperatura da pele é utilizado para verificar a ischemium, por registo da queda de temperatura da pele causado pela oclusão induzida por pressão das artérias das pernas, e o aumento da temperatura que segue libertação da braçadeira. Este método de RIP proporciona proteção a retina de ratos contra brilhante dano induzido por luz e degeneração.

Um manguito de pressão arterial elevada para acima de 160 mmHg interrompe o fluxo sanguíneo para o membro posterior como pode ser visto claramente na Figura 1B. A falta de oxigenação do tecido resultou numa redução da temperatura do pé do animal por um protocolo de isquemia-reperfusão (Figura 2). A temperatura do pé (33 ° C) foi menor do que a temperatura do núcleo e reduzida de forma fiável durante a elevação da pressão do balonete (31 ° C), aumentando quando a braçade...

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Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP) é um método de tecidos condicionado contra o stress prejudicial. Nós estabelecemos um método de isquemia remoto no membro posterior, inflando um manguito de esfigmomanômetro para 5-10 min. As capacidades neuroprotectoras de PIR foi demonstrada num modelo de degeneração da retina em roedores.

Membro Remoto Pré-Condicionamento Isquêmico: A Técnica neuroprotetor em roedores

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

remote-limb-ischemic-preconditioning-neuroprotective-technique

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.0K visualizações.  University of Sydney.  Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP) é um método de tecidos condicionado contra o stress prejudicial. Nós estabelecemos um método de isquemia remoto no membro posterior, inflando um manguito de esfigmomanômetro para 5-10 min. As capacidades neuroprotectoras de PIR foi demonstrada num modelo de degeneração da retina em roedores. 

Vídeo: Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

Estratégias para Estudo da neuroproteção de frio pré-condicionamento

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

Neurociência

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Oclusão bilateral artéria carótida comum como um estímulo pré-condicionamento adequados para induzir a tolerância isquêmica início da Isquemia Cerebral Focal

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Medicina

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Modelo murino de isquemia dos membros posteriores

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Biologia

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

Reproducable Paraplegia por Thoracic Aorta Oclusão em um modelo murino de Medula Espinhal A isquemia-reperfusão

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Usando o Eletrorretinograma na Avaliação da Função na Roedor Retina e os efeitos protetores do remoto Limb Pré-Condicionamento Isquêmico

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably reproduce the human disease are necessary to develop new therapies for this disease. The mouse hindlimb ischemia model has been widely used for this purpose, but the standard practice of inducing acute limb ischemia by ligation of the femoral artery can result in substantial tissue necrosis, compromising investigators&#39; ability to study the vascular and skeletal muscle tissue responses to ischemia. An alternative approach to femoral artery ligation is the induction of gradual femoral artery occlusion through the use of ameroid constrictors. When placed around the femoral artery in the same or different locations as the sites of femoral artery ligation, these devices occlude the artery over 1 - 3 days, resulting in more gradual, subacute ischemia. This results in less substantial skeletal muscle tissue necrosis, which may more closely mimic the responses seen in human PAD. Because genetic background influences outcomes in both the acute and subacute ischemia models, consideration of the mouse strain being studied is important in choosing the best model. This paper describes the proper procedure and anatomical placement of ligatures or ameroid constrictors on the mouse femoral artery to induce subacute or acute hindlimb ischemia in the mouse.

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

Métodos para aguda e subaguda Murino dos membros posteriores Isquemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.