Biz 37 ° C PFA fiksasyon denemek için öneri içeren yararlı tartışmalar için Dr Harold Dvorak kabul. Bu çalışma NIH hibe P01 CA92644 tarafından ve Kanser Araştırmaları Ulusal Vakfı bir sözleşme ile desteklenmiştir.

1.. Kollajen Kaplamalı Camlar Diskte Hücre Kültürü <ol><li> Bir cam kavanoz (4 oz) ve diskler sterilize etmek otoklav içinde yer cam disk (çapı 12 mm). </li><li> Bir 50 ml Falcon tüpü içinde 25 ml% 70 etanol koyun ve bir hücre kültürü kaputu yerleştirin. Çözeltinin seviyesi 20 ml düşene kadar bu çözelti, birden çok kez tekrar edilebilir. </li><li> Cam disk kolu için kullanmadan önce, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde bir ekstra ince nokta ile keskin bir forseps yerleştirin. </li><li> Dikkatlice tüp dışında forseps kaldırmak ve kapağını kapatın, daha sonra yavaşça 2 dakika boyunca hava ile kuruması için tüpün üstüne etanol tedavi forseps yerleştirin. Forseps ucu kaputu şey dokunmak izin vermeyin. </li><li> Cam kavanoz dışında bir steril cam diski kapmak ve 24-yuvalı hücre kültürü plakasının bir kuyu içine yerleştirmek için steril forseps kullanın. Kuyu istenen sayıda diskler ile doldurulan kadar tekrarlayın. </li><li> Bovine kolajen çözeltisi 500 ul (koyun50 ng / ml) bir cam disk içeren ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2, hücre kültürü yetiştirme cihazı yerleştirmek her kuyuya. Daha uzun bir inkübasyon hiçbir zararı yoktur. </li><li> Hasat HUVEC (insan göbek damar endothelial hücreleri) ya da daha önce PC3 tripsinizasyon ile 150 mm hücre kültürü plakasında yetişen ve tam kültür ortamı kullanılarak tripsin aktivitesini bloke edilmiştir (prostat tümör hücreleri). Bir 15 ml Falcon tüpü içine hücreleri toplamak. </li><li> Hücre sayısını ve canlılığı% 90 daha büyük olduğundan emin olun. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 200 x g santrifüj ile hücreler Pelet Süpernatant kaldırmak. </li><li> 10 5 hücre / ml olacak şekilde seyreltmek hücreleri için kültür ortamı kullanın. Hücreleri buz üzerinde yerleştirin. </li><li> Hücre kültürü kaputu kolajen ve yavaşça aspire cam diskler kolajen ile kaplanmış edildiği de her bir hücre süspansiyonu, 500 ul koyun. 24 oyuklu bir plaka içerisinde, 5 x 10 4 hücre / çukur% 60 conf verecekHUVEC ve PC3 hücreleri için% 30 akma luency. Not: yüksek hücre yoğunluğu için daha fazla hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> Kültür, 37 ° C, 1 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat, ya da nanopodia faaliyetleri ve hücre geçişi izlemek için 24 saat boyunca% 5 CO2 inkübatörü içinde hücreler. Tipik olarak, hücreler ilk 30 dakika içinde cam disk eklemek, daha sonra Polarize ve ilk bir saat içinde göç başlar ve ilerleyen saatlerde arası etkileşimleri ve hücre bölünmesini gerçekleştirin. </li></ol> 2. Hücre Fixation <ol><li> Her iyi hücrelerini düzeltmek için 500 ul% 4 PFA (paraformaldehid) ihtiyacınız olacak. Ticari olarak üretilen ya da taze% 4 PFA kullanılabilir yapılmış ya. Hazırlanan kuyu sayısına göre gerekli PFA miktarını hesaplayın ve bir 15 ml Falcon tüpüne PFA yerleştirin. DİKKAT: paraformaldehıt bir kanserojen olabilir. </li><li> 37 ° C inkübatör yerinde zaten bir strafor stand şahin tüp koymak. Savaş için 30 dakika boyunca inkübatör tüpü terk37 ° C&#39;ye kadar PFA m </li><li> Kültürü kaputu bir ısıtma pedi yerleştirin ve açın. </li><li> 24-iyi hücre kültürü plakası ve kuluçka prewarmed PFA çıkarın ve ısıtma yastığı üstüne yerleştirin. </li><li> Bir kuyudan orta aspire bir elinizi kullanın ve hemen sonra hafifçe iyi kenarı boyunca kuyuya 500 ul PFA slayt için diğer elinizi kullanın. Kolay aspirasyonu için, o açıyla istikrarlı olduğunu böylece Strafor standı dayayarak, yaklaşık 45 ° de kültür plaka eğin. Bu, aspirasyon ile kültür içinde hücreleri bozmadan oyuğuna PFA çözeltisi eklenerek kolaylaştıracaktır. Bu hücre faaliyetleri, orijinal hücre yapısını korumak için en önemli adımdır. </li><li> Bir cam disk ile tüm kuyuları PFA almış kadar işlemi tekrarlayın. Not: kuyudan önceden varolan çözüm değiştirmek için gereken tüm adımlar aynı aspirasyon prosedürleri uygulayacaktır. </li><li> 5 dakika boyunca 37 ° C &#39;de plaka koyun. </li&gt; <li> Geri kültürü kaputu plaka almak ve adım 2.5 açıklandığı gibi Strafor karşı yatırın. Nazikçe bir toplama tüpüne kuyudan PFA aktarmak için bir elinizi kullanın; hemen sonra da en az 500 ul oda sıcaklığında PBS yerleştirmek için diğer elinizi kullanın. Tüm çukurlar yıkanıp sonra, geri ve de her bir kere daha PBS yıkama tekrarlayın. Tehlikeli atık kabı içine toplanır PFA boşaltın. </li><li> PBS,% 2 fetal sığır serumu eklenerek ICC bloke tamponu hazırlayın. % 0.04 sodyum azid (% 20 stok çözeltisinden seyreltilmiş), bir koruyucu madde olarak ilave edilir. DİKKAT: Sodyum azid zehirli bir bileşiktir. Tampon bakteriyel kontaminasyon olmaksızın uzun bir süre için 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Yine de her iyi PBS kaldırmak için aspire ve hemen sonrasında ICC engelleme tampon 500 ul ekleyerek aracılığıyla döngüsü bir kez, bir stand karşı eğik kültür plaka ile. Hücreler artık immunofloresan boyama için hazır bulunmaktadır. Gerekirse,Sabit hücre TM4SF1 proteinin önemli bir kayıp olmaksızın bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında saklanır. </li></ol> 3. Nanopodia arasında TM4SF1 İmmünofloresan boyanması <ol><li> Her bir oyuğa olarak, Triton X-100% 0.01 ihtiva eden yeni bir bloke edici tampon ile 500 ul bloke edici tampon ICC değiştirmek ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. Hücre zarlarından TM4SF1 kaldırmak gibi% 0.03 Triton X-100 daha yüksek kullanmayınız. Boyama hemen başlamak için hazır olup olmadığını PBS adım 2.10 ile yıkanmış hücrelerini doğrudan Triton içeren engelleme tampon taşınmış olabilir. </li><li> ICC bloke etme tampon maddesi içinde 0.5 ug / ml anti-birincil TM4SF1 (ya da anti-CD9) antikoru seyreltin. </li><li> Her bir oyuğa olarak, ICC/0.01% Triton tamponunu çıkarın ve anti-TM4SF1-antikor çözeltisi 300 ul ile değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe ya da 4 ° C&#39;de bir gece bekletin </li><li> En az 500 ul PBS ile daha iyi her yıkayın. 3x tekrarlayın; Her zaman le de vermekinkübasyon süresi ast 5 dak. </li><li> Ikinci bir antikoru ve phalloidin çözelti hazırlayın ICC bir Alexa 488 etiketli eşek anti-fare ikincil antikoru (2 ug / ml nihai konsantrasyon) 1000 kat dilüsyonu ve Phalloidin 1000 x seyreltme (50 ng / ml nihai konsantrasyon) kullanılarak, blokaj tamponu. </li><li> PBS çıkarın ve her bir oyuğa, ikincil antikor ve phalloidin çözeltisi 300 ul ilave edin ve 2 saat boyunca inkübe ya da 4 ° C&#39;de bir gece bekletin </li><li> Yıkama başına en az 5 dakika inkübasyon ile PBS yıkama adımları tekrarlayın. Son yıkamadan olarak, 1 saat boyunca PBS içinde de her bırakın. </li><li> Bir cam slayt üzerinde anti-solmaya montaj medya tek bir damla (~ 10 ul) bırakın. </li><li> Bend sert bir yüzeye hafifçe bastırarak şırınga iğnesi, 90 ° 19 G 1 ½ ucu. Bükülmüş iğne tutun ve yavaşça iyi bir cam diski yukarı kaldırın, ve keskin forseps kullanarak diski kavramak için diğer elinizi kullanın tek bir elinizi kullanın. </li><li> Cam diski Turn &amp;# 160; cam slayt hücre yan kişiyi montaj medya icar yüz aşağı. Yavaşça cam diski yerleştirin ve oda sıcaklığında karanlık bir yerde gece boyunca kurumaya bırakın. </li><li> Görüntü immünofloresans lekeli nanopodia devam, ya da -20 ° C&#39;de slayt kutuda saklayın slaytlar Slaytlar -20 ° C&#39;de birkaç ay boyunca görüntülenebilir kalacaktır </li></ol>

<ol>
	<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li><li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis.">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li><li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4SF1:+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration.">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li><li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L6,+an+IgG2a+antibody+that+reacts+with+most+human+carcinomas.">Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).</li><li>Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+and+stem+cell+research.">Molecular imaging and stem cell research.</a> Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).</li><li>Hemler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+functions+and+associated+microdomains.">Tetraspanin functions and associated microdomains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).</li><li>Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+thymosin+beta-10+by+early+passage+and+senescent+vascular+endothelium+is+modulated+by+VPF/VEGF:+evidence+for+senescent+endothelial+cells+in+vivo+at+sites+of+atherosclerosis.">Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis.</a> FASEB. 15, 458-466 (2001).</li><li>Itoh, T. J., Hotani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+and+the+regulation+by+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).</li><li>Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-jump+studies+of+microtubule+dynamic+instability.">Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability.</a> J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).</li><li>Pollice, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+paraformaldehyde+and+methanol+fixation+for+simultaneous+flow+cytometric+analysis+of+DNA,+cell+surface+proteins,+and+intracellular+proteins.">Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.</a> Cytometry. 13, 432-444 (1992).</li><li>Macarulla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+solubilization+by+the+non-ionic+detergent+triton+X-100.+A+comparative+study+including+model+and+cell+membranes.">Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes.</a> Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).</li><li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+(SECM).">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li><li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13+(aminopeptidase+N)+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells.">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Nanopodia sıkıca TMED aracılığıyla Matris takmak ve ortamı duygusu ve hücreler arası etkileşimleri 2,3 aracılık için polarize mobil hücreden fazla 100 mikron uzatabilirsiniz ince hücresel membran kanalları vardır. Bu yüzden sıkıca kalıntıları uzak hücre hamle olarak geride kaldığını matrix uymak Nanopodia (Şekil 1 ve 2). Nanopodia böylece bizi hücrelerin çevrelerini nasıl hissettiğinin çalışma ve hücre hareketin yolunu belirlemek için, i...

Hareket için polarizasyon esnasında, hayvan hücreleri filopodia, lamellipodia, geri çekme lifler ve fırfır 1 de dahil olmak üzere, yüzeyleri dinamik, membran uzantıların, çeşitli uzanır. Son zamanlarda bu listeye eklenir nanopodia, ince bir yeni tanınan tipi (çapı 100-300 mikron), gibi filopodia gibi F-aktin yapılarının uzatılması için membran kanalları sağlamak uzun (en fazla 50-100 mikron uzunluğunda) membran projeksiyon vardı geri çekme ve elyaf ve bu leke pozitif TM4SF1 (Transmembran-4-L-altı family-1) kültürlenmiş endotelyal ve tümör hücreleri içinde 2,3 ile. TM4SF1 ilk molekül endotel hücre proliferasyonu ve göçünde 2,3 önemli bir rol oynayan bir endotelyal hücre biyolojik olan keşfinden önce, bir tümör hücresi antijenine 4 olarak bilinen tetraspanin benzeri topolojisi ile bir proteindir. Immünofloresan boyama TM4SF1 perinuc lokalize olduğunu ortaya çıkardılear veziküller ve plazma zarına ve TM 4SF1 e nriched mikro d omains (TMED) içinde zenginleştirilmiştir. TMED çapa Matris nanopodia ve nanopodia 1-3 TMED / um uzunlukta bir düzenli aralıklı bantlı desen mevcut. Nanopodia tipik olarak bir hücrenin gelen ön uzanan ve hareket için hücre polarizasyon esnasında arka arkaya. Nedeniyle TMED bir firma yapışık doğaya, nanopodia uzak hareket olarak hücre içine geri geri edemiyoruz; terk nanopodia artıkları böylece hücresel hareketinin yolunu iz. F-aktin uzatma ve geri çekme için membran kanalları sağlamak ve hücreler arası etkileşim ve iletişimin 2,3 sitelerdir Nanopodia. Bu özellikler hücresel kutuplaşma, çevre hücresel algılama, hücre hareket yolu ve yön tayini, ve hücreler arası etkileşimler sırasında F-aktin aksamını altında yatan mekanizmaları incelemek için eşsiz bir fırsat sağlayacak nanopodia anlamına birnd iletişimi. Nedeniyle TMED oldukça hidrofobik doğa ve nanopodia ince ve kırılgan membranöz doğaya, özel bakım TMED ve nanopodia korumak için alınması gerekir. Nanopodia ve ortak laboratuvar yöntemlerle TMED çıkarılması yıkımı sadece altmış üç yayınlar 1986 1 yılında ilk keşif beri ve üzerine 100-300 mikron microdomains içinde TM4SF1 zenginleştirme bilgi eksikliği tamamlamak için TM4SF1 çıktı neden olası bir nedeni hücre yüzeyi, 2009 2, endotel hücrelerinde TM4SF1 raporu kadar. Geleneksel immüno-lekeleme yöntemleri yaygın hücreleri düzeltmek ve hücreler 5 permeabilize% 0.1 veya daha yüksek bir Triton X-100 konsantrasyonu kullanmak için, etanol, metanol veya aseton gibi organik çözücüleri kullanırlar. (I) 37 ° C% 4 PFA kullanımı ve 37 hücreleri düzeltmek: Burada anlatılan çalışmalar TMED ve nanopodia ortaya çıkarmak için geleneksel yönteme üç büyük değişiklikler uygulanmıştır76, C kuluçka makinesi, (ii) oda sıcaklığında nazik bir PBS yıkama uygulanır, ve (iii) Triton X-100, Triton X-100,% 0.03 &#39;den daha fazla özü gibi, primer antikor ilave edilmeden önce hücreler nüfuz edilebilir kılınması için sadece kısa bir süre için en az% 0.03 oranında kullanmak TM4SF1. Tüm tetraspanins hücre zarı 6 mikro bölgesini oluşturur ve bazı endotelyal ve tümör hücrelerine 2,3 in TMED ile colocalize. CD9, CD81 ve CD151 gibi tetraspanins her yerde bulunan bir ifade olarak, burada açıklanan boyama protokolü nanopodia fonksiyonunun çalışmalar için TM4SF1 olmayan pek çok farklı hücre tipleri için uzatılabilir.

<table><tbody><tr><td>Glass disks</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>Glass jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube with Styrofoam rack</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes</td></tr><tr><td>Sharp forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps</td></tr><tr><td>24-well Cell culture plate</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>24-well Cell Culture Plate</td></tr><tr><td>150 mm Cell culture plate</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>150 mm cell culture plate</td></tr><tr><td>19 G 1 &amp;frac12; Syringe needle</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 &amp;frac12;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2701</td><td>Decon&#039;s Pure Ethanol 200 Proof</td></tr><tr><td>Collagen solution</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0.25% Trypsin-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Solution, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyde)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement &amp;amp; Growth Factors</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.</td></tr><tr><td>Mouse anti-human TM4SF1 antibody&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MAB3127</td><td>Epitope is located in extracellular domain</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD9 antibody&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>Epitope is located in extracellular domain</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Rhodamine-conjugated Phalloidin</td></tr><tr><td>Anti-fade mounting media&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td></tr><tr><td>70% Ethanol&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>17.5 ml of ethanol (200 proof)&lt;br/&gt; 7.5 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>10x PBS (make 200 ml)</td><td></td><td></td><td>20 ml of 10x PBS&lt;br/&gt; 180 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>20% Triton X-100 (make 20 ml)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml Triton X-100&lt;br/&gt; 16 ml double-deionized water</td></tr><tr><td>4% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (make 25 ml)</td><td></td><td></td><td>1 g of NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 25 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Stock solution of 50 &amp;mu;g/ml (50 ml)&lt;br/&gt; 830 &amp;mu;l of Collagen I (3 mg)&lt;br/&gt; 50 ml PBS</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS&lt;br/&gt; 2% FBS (add 1 ml)&lt;br/&gt; 0.04% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (add 100 &amp;mu;l of 4% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)</td><td></td><td></td><td>50 ml of ICC Blocking Buffer&lt;br/&gt; 25 &amp;mu;l of 20% Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx&quot;&gt;www.lonza.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7&quot;&gt;www.atcc.org&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cell culture incubator&amp;nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Water Jacketed Incubator</td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>K&amp;amp;H Manufacturing</td><td>1020</td><td>K&amp;amp;H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (&lt;a href=&quot;http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y&quot;&gt;www.amazon.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr></tbody></table>

nanopodia - thin, fragile membrane projections with roles in cell movement and intercellular interactions

Kültür yapışan hücreler hareketi ve hücreler arası etkileşimleri desteklemek için polarize durumunu korumak. Nanopodia, ince uzun, TM4SF1 (Transmembran-4-L-altı ailenin-1), imüno-lekeleme yoluyla görselleştirilebilir endotel ve kanser hücrelerinde büyük ölçüde F-aktin-negatif zar tahminleridir. 100-300 mikron çapında TMED de TM4SF1 kümeleri 14 kadar bireysel TM4SF1 moleküllere 3 ihtiva eden (TM 4SF1 e mikro d omains nriched). TMED 1 μ m &#39;başına TMED 3 ve sıkıca matrisine nanopodia çapa düzenli aralıklarla nanopodia boyunca aralıklı olarak düzenlenmiştir. Bu polarize endotel veya tümör hücrelerinin ön ön veya arka arkaya gelen daha 100 μ m uzatmak nanopodia sağlar ve MATR üzerinde geride olmak zar artıkları olurix hücre uzaklaşıyor zaman. TMED ve nanopodia nedeniyle aşırı kırılganlık ve sıcaklık hassasiyeti göz ardı edilmiştir. Rutin yıkama ve tespit yapısını bozabilir. Nanopodia lekelenme% 0.01 Triton X-100 kısa süreli maruz bırakma ve ardından, 37 ° C &#39;de paraformaldehit (PFA) doğrudan tespit ile korunur. Hücre biyolojisinde yeni ufuklar açmak Nanopodia: algılamak ve bir mesafede diğer hücreleri belirlemek, yakın temas sırasında hücreler arası etkileşimleri başlatabilir ve hareket, çoğalma dahil sinyal mekanizmaları, hücrelerin çevrelerini nasıl hissettiğinin anlayışımızı yeniden şekillendirmek ve hücre için söz veriyorum -hücre iletişimi. TM4SF1 türetilmiş nanopodia çalışmak için geliştirilen yöntemler, klasik tetraspanins, özellikle de her yerde bulunan bir ifade CD9, CD81 ve CD151 vasıtasıyla diğer hücre tiplerinde meydana nanopodia çalışmaları için yararlı olabilir.

Adım 1 için: (Örneğin HUVEC&#39;e ve bu çalışmada kullanılan PC3 olarak) hücreler normal büyümek mümkün ise, hücreler numaralı seribaşı sonra, 30 dakika içinde kollajen kaplı disk takmak Polarize ve kısa bir süre sonra mobil olmak ve ileride kendi yolunu nanopodia uzatacak hareketin. Şekil 1A ve 1B, sırasıyla bir polarize ve çoğalan HUVEC. Şekil 2A, bir cep halinde polarize PC3 hücreleri sini göstermektedir. <p ...

Watch this Scientific Journal Video about Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions at JoVE.com

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Nanopodia bir hücrenin ön ön veya arka arka 100 mikron kadar uzanır ve hücresel ortamı anlamda ince ama kırılgan zar kanallardır. 37 ° C&#39;de, hafif bir yıkama, ve etanol, metanol veya aseton gibi bir organik çözücü önlemeyi ve daha yüksek Triton X-100 konsantrasyonları doğrudan tespiti, bu hücresel yapılar gözlemlemek için gereklidir.

Nanopodia - Cep Hareketi ve Intercellular Etkileşimleri Rolleri İnce, Kırılgan Membran Projeksiyonlar

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Görüntüleme.  Harvard Medical School.  Nanopodia bir hücrenin ön ön veya arka arka 100 mikron kadar uzanır ve hücresel ortamı anlamda ince ama kırılgan zar kanallardır. 37 ° C'de, hafif bir yıkama, ve etanol, metanol veya aseton gibi bir organik çözücü önlemeyi ve daha yüksek Triton X-100 konsantrasyonları doğrudan tespiti, bu hücresel yapılar gözlemlemek için gereklidir. 

Video: Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and provides a theoretical basis for the rational design of nano-medicine delivery. Single particle tracking (SPT) analysis could probe the position and orientation of individual nanoparticles on cell membrane, and reveal their translational and rotational states. Here, we show how to use traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on live cell membrane. We also show how to extract the location and orientation of AuNRs using ImageJ and MATLAB, and how to characterize the diffusive states of AuNRs. Statistical analysis of hundreds of particles show that single AuNRs perform Brownian motion on the surface of U87 MG cell membrane. However, individual long trajectory analysis shows that AuNRs have two distinctly different types of motion states on the membrane, namely long-range transport and limited-area confinement. Our SPT methods can be potentially used to study the surface or intracellular particle diffusion in different biological cells and can become a powerful tool for investigations of complex cellular mechanisms.

Here, we show the use of traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on cell membrane. The location and orientation of single AuNRs are detected using ImageJ and MATLAB, and the diffusive states of AuNRs are characterized by single particle tracking analysis.

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Biyokimya

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Biyoloji

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Protocol for Analysis and Consolidation of TrackMate Outputs for Measuring Two-Dimensional Cell Motility using Nuclear Tracking

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To understand the regulation of cell motility, we must be able to measure it easily and consistently under different conditions. Here we describe a method for measuring and quantifying single-cell and bulk motility of HaCaT keratinocytes using a nuclear stain. This method includes a MATLAB script for analyzing TrackMate output files to calculate displacements, motility rates, and trajectory angles in single cells and in bulk for an imaging site. This motility analysis script allows for quick, straightforward, and scalable analysis of cell motility rates from TrackMate data and could be broadly used to identify and study the regulation of motility in epithelial cells. We also provide a MATLAB script for reorganizing microscopy videos collected on a microscope and converting them to TIF stacks, which can be analyzed using the ImageJ TrackMate plugin in bulk. Using this methodology to explore the roles of adherens junctions and actin cytoskeletal dynamics in regulating cell motility in HaCaT keratinocytes, we demonstrate evidence that Arp2/3 activity is required for the elevated motility seen after &#945;-catenin depletion in HaCaT keratinocytes.

This protocol for high-throughput measurement of cell motility in HaCaT keratinocytes describes methods for collecting and processing images of cell nuclei and performing particle tracking using the ImageJ plugin TrackMate.

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Types of Membrane Protrusions

The protrusion of the cell surface is an initial step for several cellular processes, including cell migration, phagocytosis, and neurite outgrowth. These membrane protrusions are a result of cytoskeletal rearrangement. The most&#160; widely observed cell protrusions include lamellipodia, pseudopodia, filopodia, microvilli, invadopodia, and podosomes. These protrusions can be of two types &#8212; static or dynamic.
The microvilli, an example of stable protrusions, are finger-like projections with a generally stable actin architecture. These brush-like extensions are found on the apical surface of epithelial cells lining internal organs, such as the intestine. They greatly increase the surface area for enhanced nutrient absorption.
Contrastingly, dynamic protrusions are primarily involved in cell migration. The majority of these structures use actin polymerization as the driving force for membrane deformation. Additionally, actin binds myosin motor proteins to form contractile bundles. The myosin motors pull on the actin filaments, thus rearranging them during migration. Based on their appearance, actin-dependent protrusions are classified as lamellipodia, pseudopodia, filopodia, and invadopodia.
Many migrating cells like keratinocytes or fibroblasts exhibit lamellipodia, which are thin, sheet-like projections at the leading edge of these cells. They are involved in the rapid migration of cells to sites of injury for repair and regeneration. Lamellipodia&#160; can extend bundled actin filaments to form finger-like projections called filopodia. For example,&#160; neurons form these outgrowths to sense environmental signals and rewire the nervous system after trauma.
Other membrane protrusions include the podosomes&#160; and invadopodia. While podosomes are transient peg-like structures developed by migrating cells like macrophages, invadopodia are projections produced by metastatic cells on the extracellular matrix. Additionally, invadopodia secrete proteolytic enzymes, degrading the extracellular matrix to break tissue architecture and metastasize into adjacent tissues. Lastly, blebs are spherical membrane projections formed due to internal hydrostatic pressure. They do not depend on the actin cytoskeleton for their enlargement. Fibroblasts and immune cells exhibit bleb formation for migration and other cellular processes such as apoptosis.

Membran Çıkıntı Çeşitleri

The protrusion of the cell surface is an initial step for several cellular processes, including cell migration, phagocytosis, and neurite outgrowth. These ...

Education

JoVE Core

Hücre Biyolojisi

Unit 1

Hücre Polarizasyonu ve Göç

KEY TERMS AND CONCEPTS

Mechanism of Lamellipodia Formation

Cells migrating in response to external stimuli form lamellipodia, which are thin membrane protrusions supported by a mesh of linked, branched, or unbranched actin filaments. These actin filaments interact with myosin motor proteins, creating the dynamic actomyosin complex within the cytoskeleton. Contractility, or the ability to generate contractile stress, is inherent to the actomyosin complex. It helps cells detect the stiffness of the surrounding ECM and exert contractile force for migration.
At the leading edge, the binding of an activated Rac GTPase to the WAVE complex initiates lamellipodia formation. Subsequently, the WAVE complex changes conformation to prime actin nucleators like the Arp2/3 complex for polymerization and branching of filaments. Additionally, members of the formin family localize at the sites of lamellipodia formation, elongating the unbranched filaments. The force generated by continuous actin polymerization pushes the membrane outwards and forms the membrane protrusion. The actin mesh at the leading edge contributes to the formation of focal adhesion points on the ECM, preventing the retraction of lamellipodia.
After lamellipodia formation, the dissociation of filaments begins at the rear end of the dynamic actin meshwork. The actin monomers steadily detach from the minus ends and attach to the plus ends of filaments in the actin network, resulting in treadmilling. This cyclic assembly and disassembly causes&#160; the forward movement of the entire actin filament network even though the position of individual filaments remains stationary to the substratum.
Behind the dynamic lamellipodial meshwork lies a stable network of bundled linear actin filaments called the lamella. This actin network supports the lamellipodium by developing mature and strong adhesion sites, which resist cell compression during migration. Additionally, stable actin filaments of the lamella associate with myosin proteins and use their inherent contractibility to propel the cell forward.

Lamellipodia Oluşumunun Mekanizması

Cells migrating in response to external stimuli form lamellipodia, which are thin membrane protrusions supported by a mesh of linked, branched, or ...

Mechanism of Filopodia Formation

Filopodia are thin, actin-rich cellular protrusions that play an important role in many fundamental cellular functions. They vary in their occurrence, length, and positioning in different cell types, suggesting their diverse roles.
Their main function is to guide migrating cells during normal tissue morphogenesis or cancer metastasis by recognizing and making initial contacts with the extracellular matrix. However, they can also act as stationary cell anchors or help to establish communication between two cells. For example, the formation of filopodial bridges between two adjacent endothelial or epithelial cells is important for the subsequent establishment of adherens junctions. In addition, filopodia can also help the cells to reach and internalize distant targets, such as pathogens.
Filopodia Formation and Disassembly
Actin nucleation, elongation, and bundling are critical for filopodia formation and function. The filopodia core comprises 12-20 actin filaments spaced 12 nm apart. Bundling of these filaments by fascin is crucial to give filopodia the rigidity to maintain its elongated shape.
The disassembly of actin filaments during the retraction phase involves periodic helical and rotational motion of the actin shaft and is regulated by several factors. For instance, capping proteins promote filopodial retraction by shielding the polymerizing ends of the filaments from further elongation. RhoA kinase activity also regulates actin polymerization within filopodia.

Filopodia Oluşum Mekanizması

Filopodia are thin, actin-rich cellular protrusions that play an important role in many fundamental cellular functions. They vary in their occurrence, ...

Cancer Cell Migration through Invadopodia

Invadosome is a broad category of cell surface structures with proteolytic activity that&#160; degrades the extracellular matrix (ECM). Invadosomes are present in normal cell types, including macrophages, endothelial cells, and neurons, as well as tumor cells. Although the macrophage podosomes and tumor cell invadopodia are classified as invadosomes, they have different structures, molecular pathways, and functions. Podosomes are short structures that last for a few minutes. However, invadopodia can last for hours and are many microns in length.
In tumors, invadopodia are essential for cell intravasation and extravasation through blood vessels. They are similar to lamellipodia and filopodia, with a filamentous actin core shaped by actin nucleators and regulatory factors. The lifecycle of an invadopodium is initiated by complex processes involving various signaling cascades that remodel the cytoskeleton and cell membrane. The actin cytoskeleton is reorganized and assembled into new filaments and branches, which requires the activity of actin nucleators such as formins or the ARP2/3 complex.
The Arp2/3 complex requires nucleation-promoting factors (NPF) for optimal activity as it is slow to spontaneously initiate new actin branches. Cortactin, an NPF and scaffold protein, recruits ARP2/3 to filaments, allowing branching of the actin network. Additionally, cortactin can stabilize the newly generated branches. The formin proteins induce the elongation of unbranched actin filaments, while filament bundling is coordinated by fascin. Together these events promote actin filament polymerization and maturation of the invadopodium.&#160;
After the invadopodium stabilizes, kinesins use the neighboring microtubules as tracks to transport vesicles with proteases from the Golgi network. These vesicles release enzymes such as&#160; matrix metalloproteases, cathepsins, and serine proteases from the membrane of the invadopodia to degrade the surrounding ECM. Lastly, the actin core is disassembled to retract the invadopodium. Several proteins are implicated in the retraction pathway, but it is unclear how these proteins interact during the final stage of the invadopodium life cycle.&#160;

Invadopodia Yoluyla Kanser Hücresi Göçü

Invadosome is a broad category of cell surface structures with proteolytic activity that&#160; degrades the extracellular matrix (ECM). Invadosomes are ...

Cell Migration

Cell migration, the process by which cells move from one location to another, is essential for the proper development and viability of organisms throughout their life. When cells are not able to migrate properly to their ordained locations, various disorders may occur. For example, disruption in cell migration causes chronic inflammatory diseases such as arthritis.

<h4>General Mechanism</h4>

Generally, cellular migration begins when a cell, such as a fibroblast, responds to an external-polarizing-chemical signal. As a result, one end extends itself as a protrusion called the leading edge, which attaches itself to substrates via secreted adhesive compounds, in its microenvironment. The trailing edge&mdash;the area that serves as the back of the cell&mdash;also adheres to substrates to anchor the cell. After adhesion, the cell is propelled towards its destination by a sequence of contractions that are generated by cytoskeletal motility structures. Then, the adhesive attachment at the trailing edge gets released. These steps are repeated cyclically until the fibroblast reaches its destination.

<h4>Polarization</h4>

There is a diversity in the different types of signaling molecules that initiate cell migration. They illicit two types of responses: chemokinetic and chemotactic. Chemokinesis refers to movement that occurs when signaling molecules either symmetrically or asymmetrically stimulate cell migration without dictating the directionality of the resultant movement. Chemotaxis refers to a movement where a gradient of soluble (chemotactic) or substrate-bound (haptotactic) signaling molecules dictates the directionality of cellular movement.

Membrane receptors such as G-protein coupled receptors (GPCR) and receptor tyrosine kinase receptors (RTK) detect external signaling molecules and cause an accumulation of phosphatidylinositol (3,4,5) triphosphate (PIP3) at the leading edge. The accumulation of PIP3 then leads to the activation of Rho-family Ras-like small proteins called Rac, Cdc42, and Rho. Rac and/or Cdc42 cause cytoskeletal changes such as actin polymerization at the leading edge while Rho causes actin-myosin contractions at the trailing edge. As a result of actin polymerization, protrusions are generated at the leading edge.

<h4>Types of Protrusions</h4>

Actin serves as a physical scaffold for protrusions. Consequently, the shape of protrusion structures varies depending on how actin is assembled. Two commonly studied types of protrusions are lamellipodia and filopodia. Lamellipodia are broad, sheet-like protrusions that contain a branched network of thin, short actin filaments. When lamellipodia lift away from the substrate and move backward, a notably distinct ruffling movement occurs. Lamellipodia protrusions can be found in cells like fibroblasts, immune cells, and neurons. Filopodia are thin-finger-like protrusions that emanate from cell membranes. They are often observed in cells, such as neurons, working in tandem with lamellipodia during migration.