نحن نعترف الدكتور هارولد دفوراك لإجراء مناقشات مفيدة بما في ذلك الاقتراح في محاولة التثبيت في 37 ° C PFA. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح P01 CA92644 وبموجب عقد من المؤسسة الوطنية لأبحاث السرطان.

1. الثقافة الخلية على الكولاجين المغلفة القرص زجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأقراص مكان الزجاج (12 مليمتر في القطر) في وعاء زجاجي (4 أوقية) والأوتوكلاف لتعقيم الأقراص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 25 مل 70٪ من الإيثانول في أنبوب 50 مل الصقر ووضعه في غطاء ثقافة الخلية. هذا الحل يمكن إعادة استخدامها عدة مرات حتى مستوى الحل ينخفض ​​إلى 20 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ملقط حاد مع نقطة غرامة اضافية في الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق قبل استخدامه للتعامل مع القرص الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية ملقط من الأنبوب وأغلق الغطاء، ثم ضع برفق الإيثانول تعامل ملقط على رأس الأنبوب إلى الهواء الجاف لمدة 2 دقيقة. لا تسمح غيض من ملقط للمس أي شيء في غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط معقم للاستيلاء على قرص واحد زجاجية معقمة للخروج من جرة الزجاج ووضعه في بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية. كرر حتى تم ملؤها العدد المطلوب من الآبار مع أقراص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 500 ميكرولتر من محلول الكولاجين البقري (50 نانوغرام / مل) في كل بئر يحتوي على قرص من الزجاج ووضعه في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 خلية ثقافة حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ليس هناك ضرر في الحضانة لفترة أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد HUVEC (الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان) أو PC3 (الخلايا السرطانية في البروستاتا) التي كانت تزرع بالفعل في 150 ملم وحة الثقافة الخلية من خلال trypsinization ومنع النشاط التربسين باستخدام كاملة المتوسطة ثقافتها. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل الصقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا والتأكد من جدوى أكبر من 90٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مستنبت لتمييع الخلايا إلى 10 5 خلية / مل. وضع الخلايا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الكولاجين في غطاء محرك السيارة خلية ثقافة ووضع بلطف 500 ميكرولتر من تعليق خلية إلى كل بئر التي تم precoated الأقراص الزجاج مع الكولاجين. سوف 5 × 10 4 خلايا / جيد في 24 لوحة جيدا تعطي 60٪ أسيوطluency لHUVEC و 30٪ confluency للخلايا PC3. ملاحظة: إضافة المزيد من تعليق خلية لأعلى كثافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 ساعة، 2 ساعة، 4 ساعة، 6 ساعة، أو 24 ساعة لتتبع أنشطة nanopodia ومرور الخلية. عادة، سوف الخلايا نعلق على القرص الزجاج في أول 30 دقيقة، ثم البدء في استقطاب وتهاجر في الساعة الأولى، وإجراء التفاعلات بين الخلايا وانقسام الخلايا في الساعات التالية. </li></ol> 2. تثبيت الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل بئر ستحتاج 500 ميكرولتر PFA 4٪ (بارافورمالدهيد) لإصلاح الخلايا. إما تصنيعها تجاريا أو تقدم طازجة PFA 4٪ يمكن استخدامها. حساب كمية PFA اللازمة استنادا إلى عدد من الآبار على استعداد، ووضع منهاج العمل في أنبوب 15 مل الصقر. تنبيه: امتصاص العرق هو مادة مسرطنة مشتبه بهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب الصقر في موقف الستايروفوم التي كانت بالفعل في مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية. ترك الأنبوب في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إلى الحربم حتى PFA إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وسادة التدفئة في غطاء محرك السيارة والثقافة، وتشغيله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية وPFA prewarmed للخروج من الحاضنة ووضعه على رأس وسادة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام يدا واحدة لنضح المتوسطة من بئر، وعلى الفور بعد استخدام اليد الأخرى إلى الشريحة بلطف 500 ميكرولتر PFA في البئر من خلال الحافة جيدا. لتسهيل الطموح، إمالة لوحة الثقافة في حوالي 45 درجة، يميل ضد موقف الستايروفوم بحيث أنها مستقرة في هذه الزاوية. وسوف يسهل هذا الطموح وإضافة PFA حل لالبئر من دون إزعاج الخلايا في الثقافة. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية للحفاظ على بنية الخلية الأصلية للأنشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر العملية حتى تلقوا جميع الآبار مع قرص الزجاج PFA. ملاحظة: ستكون جميع الخطوات التي تحتاج إلى تغيير الحل موجود مسبقا من البئر تطبيق إجراءات الطموح نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ اللوحة إلى غطاء محرك السيارة والثقافة، وإمالة ضد الستايروفوم كما هو موضح في الخطوة 2.5. استخدام يد واحدة لنقل بلطف PFA من البئر في أنبوب جمع؛ استخدام اليد الأخرى لوضع مباشرة بعد ذلك لا يقل عن 500 غرفة درجة الحرارة PBS ميكرولتر في البئر. بعد أن تم غسلها جميع الآبار، والعودة وتكرار الغسيل PBS مرة أخرى في كل جيدا. إفراغ PFA جمعها في وعاء النفايات الخطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عازلة تمنع المحكمة الجنائية الدولية بإضافة 2٪ مصل بقري جنيني لبرنامج تلفزيوني. يضاف 0.04٪ أزيد الصوديوم (20٪ من تمييع الحل الأسهم) كمادة حافظة. تنبيه: أزيد الصوديوم هو مركب سام. ويمكن تخزين المخزن المؤقت في 4 درجة مئوية لفترة طويلة من الزمن دون التلوث الجرثومي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع لوحة الثقافة لا يزال يميل ضد موقف، مرة أخرى من خلال كل دورة الشفط جيدا لإزالة برنامج تلفزيوني ومباشرة بعد ذلك بإضافة 500 ميكرولتر من المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة. الخلايا هي الآن جاهزة للتلوين المناعي. إذا لزم الأمر، وخلايا ثابتة يمكن تخزينها في الثلاجة 4 ° C لمدة أسبوع دون خسارة كبيرة من البروتين TM4SF1. </li></ol> 3. TM4SF1 المناعي تلون Nanopodia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل بئر، واستبدال العازلة حجب 500 ميكرولتر المحكمة الجنائية الدولية مع عازلة تمنع جديدة تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100 والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. لا تستخدم أعلى من 0.03٪ تريتون X-100 كما أنه سيتم إزالة TM4SF1 من أغشية الخلايا. PBS غسلها الخلايا من الخطوة 2.10 يمكن نقلها مباشرة إلى المخزن المؤقت حجب تحتوي على تريتون إذا كان على استعداد لتلطيخ أن تبدأ على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأساسية المضادة للTM4SF1 (أو المضادة للCD9) الأجسام المضادة إلى 0.5 ميكروغرام / مل في المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل بئر، وإزالة ICC/0.01٪ تريتون العازلة واستبدالها 300 ميكرولتر من الحل لمكافحة TM4SF1 الضد. احتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو ترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر مع ما لا يقل عن 500 ميكرولتر PBS. تكرار 3X؛ في كل مرة تعطي في LeAST 5 دقائق من الوقت الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة وphalloidin حل الثانوي في المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة، وذلك باستخدام 1،000 مرة التخفيف من اليكسا 488 المسمى حمار مكافحة فأر الضد الثانوية (2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) و 1،000 س التخفيف من phalloidin (50 نانوغرام / مل تركيز النهائي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية وحل phalloidin إلى كل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة أو ترك الأمر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار PBS غسل الخطوات مع ما لا يقل عن 5 دقائق في الحضانة غسل. في غسل الماضي، وترك كل بئر في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إسقاط قطرة واحدة (~ 10 ميكرولتر) من مكافحة تتلاشى تصاعد وسائل الاعلام على شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منحنى غيض من 19 G 1 ½ حقنة في الإبرة 90 درجة عن طريق الضغط بلطف على سطح صلب. استخدام يد واحدة لعقد إبرة محني ورفع بلطف صعودا قرص الزجاج من البئر، واستخدام اليد الأخرى لفهم القرص باستخدام ملقط حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل القرص الزجاج و# 160؛ وجهه لأسفل السماح للاتصال الجانب خلية الإعلام متزايدة على شريحة زجاجية. وضع بلطف قرص الزجاج واتركها تجف بين عشية وضحاها في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى صورة ملطخة nanopodia المناعي، أو تخزين الشرائح في مربع الشريحة في -20 درجة مئوية. ستبقى الشرائح للعرض لمدة بضعة أشهر في -20 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li><li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis.">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li><li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4SF1:+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration.">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li><li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L6,+an+IgG2a+antibody+that+reacts+with+most+human+carcinomas.">Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).</li><li>Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+and+stem+cell+research.">Molecular imaging and stem cell research.</a> Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).</li><li>Hemler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+functions+and+associated+microdomains.">Tetraspanin functions and associated microdomains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).</li><li>Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+thymosin+beta-10+by+early+passage+and+senescent+vascular+endothelium+is+modulated+by+VPF/VEGF:+evidence+for+senescent+endothelial+cells+in+vivo+at+sites+of+atherosclerosis.">Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis.</a> FASEB. 15, 458-466 (2001).</li><li>Itoh, T. J., Hotani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+and+the+regulation+by+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).</li><li>Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-jump+studies+of+microtubule+dynamic+instability.">Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability.</a> J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).</li><li>Pollice, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+paraformaldehyde+and+methanol+fixation+for+simultaneous+flow+cytometric+analysis+of+DNA,+cell+surface+proteins,+and+intracellular+proteins.">Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.</a> Cytometry. 13, 432-444 (1992).</li><li>Macarulla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+solubilization+by+the+non-ionic+detergent+triton+X-100.+A+comparative+study+including+model+and+cell+membranes.">Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes.</a> Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).</li><li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+(SECM).">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li><li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13+(aminopeptidase+N)+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells.">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li></ol>

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Nanopodia قنوات رقيقة الغشاء الخلوي أن نعلق بحزم إلى matrix خلال TMED ويمكن أن تمتد أكثر من 100 ميكرون من خلية المحمول الاستقطاب لاستشعار البيئة والتفاعلات بين الخلايا توسط 2،3. Nanopodia التمسك مصفوفة بقوة حتى يتم ترك مخلفات وراء بينما يتحرك بعيدا الخلية (الشكلان 1 و <...

خلال الاستقطاب للحركة، والخلايا الحيوانية توسيع مجموعة متنوعة من الديناميكية، نتوءات غشاء من سطوحها، بما في ذلك أرجل كاذبة خيطية، أقدام صفاحية والألياف التراجع، والكشكشة 1. تمت إضافتها مؤخرا إلى هذه القائمة كانت nanopodia، وهو نوع المعترف بها حديثا رقيقة (100-300 ميكرون في القطر)، ممدود (50-100 ميكرون تصل إلى الطويل) الغشاء الذي الإسقاط توفير قنوات الغشاء لتمديد الهياكل F-الأكتين مثل أرجل كاذبة خيطية والألياف التراجع، وأنه وصمة عار بإيجابية مع TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) في البطانية والورم الخلايا المستزرعة 2،3. TM4SF1 هو بروتين مع مثل tetraspanin طوبولوجيا التي كانت تعرف أصلا باعتبارها مستضد الخلايا السرطانية 4 قبل اكتشاف جزيء أن العلامات البيولوجية هو الخلايا البطانية التي تلعب دورا أساسيا في تكاثر الخلايا البطانية والهجرة 2،3. وكشف المناعي تلطيخ أن TM4SF1 المترجمة إلى perinucالحويصلات ولير لغشاء البلازما، ويتم تخصيبها في TM 4SF1 ه nriched omains د الدقيقة (TMED). TMED مرساة nanopodia إلى matrix والحاضر في نمط النطاقات متباعدة بصورة منتظمة من 1-3 طول TMED / ميكرون من nanopodia. Nanopodia تمتد عادة من الأمام مما يؤدي خلية وراء خلية الخلفية خلال الاستقطاب للحركة. نظرا لطبيعة ملتصقة شركة من TMED، nanopodia غير قادرين على التراجع مرة أخرى إلى الخلية وهو يتحرك بعيدا؛ وبالتالي التخلي عن بقايا nanopodia تتبع خارج مسار الحركة الخلوية. Nanopodia توفير قنوات لتمديد غشاء F-الأكتين والتراجع، والمواقع هي من التفاعلات بين الخلايا والاتصالات 2،3. هذه الخصائص يعني أن nanopodia توفير فرصة فريدة لدراسة الآليات الكامنة وراء التجمع F-الأكتين خلال الاستقطاب الخلوية، والاستشعار الخلوية للبيئة، وتحديد مسار واتجاه حركة الخلية، والتفاعلات بين الخلايا والثانية الاتصالات. نظرا لطبيعة مسعور للغاية من TMED وطبيعة الغشائي رقيقة وهشة من nanopodia، يحتاج إلى رعاية خاصة التي يتعين اتخاذها من أجل الحفاظ على TMED وnanopodia. تدمير nanopodia وإزالة TMED بالطرق المختبرية الشائعة هي الأسباب المحتملة لماذا ظهرت المنشورات ثلاث وستين فقط على TM4SF1 منذ أول اكتشاف لها في عام 1986 1 والافتقار التام إلى معرفة تخصيب TM4SF1 في 100-300 ميكرون microdomains على سطح الخلية حتى تقرير TM4SF1 في الخلايا البطانية في عام 2009 2. أساليب المناعية التقليدية عادة ما تستخدم المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، الأسيتون أو لإصلاح الخلايا واستخدام 0.1٪ أو أعلى تركيز تريتون X-100 لpermeabilize الخلايا 5. تنفيذ الدراسات وصفها هنا ثلاثة تغييرات كبيرة في الطريقة التقليدية للكشف عن TMED وnanopodia: (ط) استخدام 37 درجة مئوية 4٪ PFA وإصلاح الخلايا في 3776؛ مئوية الحاضنة، (ب) تطبيق لطيف درجة حرارة الغرفة PBS الغسيل، و (ج) استخدام أقل من 0.03٪ تريتون X-100 فقط لفترة وجيزة لpermeabilize الخلايا قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية، كما تريتون X-100 أعلى من 0.03٪ سيتم استخراج TM4SF1. جميع tetraspanins تشكيل microdomains على غشاء الخلية 6 و بعض colocalize مع TMED في البطانية وخلايا الورم 2،3. كما يتم التعبير عن tetraspanins مثل CD9، CD81، وCD151 بتواجد مطلق، وبروتوكول تلطيخ الموصوفة هنا يمكن أن تمتد إلى العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تفتقر TM4SF1 للدراسات وظيفة nanopodia.

<table><tbody><tr><td>Glass disks</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>Glass jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube with Styrofoam rack</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes</td></tr><tr><td>Sharp forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps</td></tr><tr><td>24-well Cell culture plate</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>24-well Cell Culture Plate</td></tr><tr><td>150 mm Cell culture plate</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>150 mm cell culture plate</td></tr><tr><td>19 G 1 &amp;frac12; Syringe needle</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 &amp;frac12;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2701</td><td>Decon&#039;s Pure Ethanol 200 Proof</td></tr><tr><td>Collagen solution</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0.25% Trypsin-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Solution, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyde)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement &amp;amp; Growth Factors</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.</td></tr><tr><td>Mouse anti-human TM4SF1 antibody&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MAB3127</td><td>Epitope is located in extracellular domain</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD9 antibody&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>Epitope is located in extracellular domain</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Rhodamine-conjugated Phalloidin</td></tr><tr><td>Anti-fade mounting media&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td></tr><tr><td>70% Ethanol&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>17.5 ml of ethanol (200 proof)&lt;br/&gt; 7.5 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>10x PBS (make 200 ml)</td><td></td><td></td><td>20 ml of 10x PBS&lt;br/&gt; 180 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>20% Triton X-100 (make 20 ml)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml Triton X-100&lt;br/&gt; 16 ml double-deionized water</td></tr><tr><td>4% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (make 25 ml)</td><td></td><td></td><td>1 g of NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 25 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Stock solution of 50 &amp;mu;g/ml (50 ml)&lt;br/&gt; 830 &amp;mu;l of Collagen I (3 mg)&lt;br/&gt; 50 ml PBS</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS&lt;br/&gt; 2% FBS (add 1 ml)&lt;br/&gt; 0.04% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (add 100 &amp;mu;l of 4% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)</td><td></td><td></td><td>50 ml of ICC Blocking Buffer&lt;br/&gt; 25 &amp;mu;l of 20% Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx&quot;&gt;www.lonza.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7&quot;&gt;www.atcc.org&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cell culture incubator&amp;nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Water Jacketed Incubator</td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>K&amp;amp;H Manufacturing</td><td>1020</td><td>K&amp;amp;H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (&lt;a href=&quot;http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y&quot;&gt;www.amazon.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr></tbody></table>

nanopodia - thin, fragile membrane projections with roles in cell movement and intercellular interactions

الخلايا الملتصقة في ثقافة الحفاظ على حالة الاستقطاب لدعم الحركة والتفاعلات بين الخلايا. Nanopodia هي رقيقة، ممدود، إلى حد كبير، F-الأكتين سلبية التوقعات في غشاء الخلايا البطانية والسرطان الذي يمكن تصور خلال TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) المناعي تلطيخ. مجموعات TM4SF1 في 100-300 ميكرون قطر TMED (TM 4SF1 ه nriched omains د الصغرى) التي تحتوي على 3 إلى ما يصل إلى 14 فرد TM4SF1 الجزيئات. يتم ترتيب TMED بشكل متقطع على طول nanopodia في تباعد العادية من 1-3 TMED في μ م وترسيخ nanopodia إلى المصفوفة. وهذا يتيح nanopodia تمديد أكثر من 100 μ م من قيادة الجبهة أو زائدة الجزء الخلفي من الخلايا البطانية أو ورم الاستقطاب، ويسبب بقايا الغشاء أن تترك وراءها على MATRالتاسع عندما يتحرك الخلية بعيدا. تم التغاضي TMED وnanopodia بسبب هشاشتها الشديدة والحساسية لدرجة الحرارة. غسل الروتينية وتعطيل تثبيت الهيكل. يتم الاحتفاظ Nanopodia من قبل التثبيت المباشر في بارافورمالدهيد (PFA) عند 37 درجة مئوية، تليها التعرض قصيرة إلى 0.01٪ تريتون X-100 قبل تلطيخ. Nanopodia فتح آفاقا جديدة في بيولوجيا الخلية: يعدون لإعادة تشكيل فهمنا لكيفية خلايا الشعور بيئتهم، كشف وتحديد الخلايا الأخرى على مسافة، والشروع في التفاعلات بين الخلايا في اتصال وثيق، وآليات الإشارات المشاركة في الحركة، والانتشار، والخلية الاتصالات الخلية. قد تكون الأساليب التي يتم تطويرها لدراسة nanopodia TM4SF1 المستمدة من المفيد للدراسات nanopodia التي تشكل في أنواع الخلايا الأخرى من خلال وكالة tetraspanins الكلاسيكية، ولا سيما CD9 أعرب بتواجد مطلق، CD81، وCD151.

لخطوة 1: إذا الخلايا (مثل HUVEC وPC3 المستخدمة في هذه الدراسة) هي قادرة على النمو بشكل طبيعي، وسوف نعلق على خلايا القرص المغلفة الكولاجين في غضون 30 دقيقة بعد هم المصنف، استقطاب وتصبح المحمول بعد ذلك بقليل، وتوسيع nanopodia قبل مسيرتهم الحرك?...

Watch this Scientific Journal Video about Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions at JoVE.com

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Nanopodia قنوات غشاء رقيق ولكنها هشة التي تمتد ما يصل الى 100 ميكرون من قيادة الجبهة الخلفية أو زائدة الخلية والشعور البيئة الخلوية. ويلزم تثبيت مباشرة عند 37 درجة مئوية، وغسل لطيف، وتجنب المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، أو الأسيتون وارتفاع تريتون X-100 تركيزات مراعاة هذه الهياكل الخلوية.

Nanopodia - رقيقة، غشاء التوقعات الهشة مع الأدوار في حركة التفاعلات بين الخلايا الخليوي و

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Harvard Medical School.  Nanopodia قنوات غشاء رقيق ولكنها هشة التي تمتد ما يصل الى 100 ميكرون من قيادة الجبهة الخلفية أو زائدة الخلية والشعور البيئة الخلوية. ويلزم تثبيت مباشرة عند 37 درجة مئوية، وغسل لطيف، وتجنب المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، أو الأسيتون وا...

Video: Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and provides a theoretical basis for the rational design of nano-medicine delivery. Single particle tracking (SPT) analysis could probe the position and orientation of individual nanoparticles on cell membrane, and reveal their translational and rotational states. Here, we show how to use traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on live cell membrane. We also show how to extract the location and orientation of AuNRs using ImageJ and MATLAB, and how to characterize the diffusive states of AuNRs. Statistical analysis of hundreds of particles show that single AuNRs perform Brownian motion on the surface of U87 MG cell membrane. However, individual long trajectory analysis shows that AuNRs have two distinctly different types of motion states on the membrane, namely long-range transport and limited-area confinement. Our SPT methods can be potentially used to study the surface or intracellular particle diffusion in different biological cells and can become a powerful tool for investigations of complex cellular mechanisms.

Here, we show the use of traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on cell membrane. The location and orientation of single AuNRs are detected using ImageJ and MATLAB, and the diffusive states of AuNRs are characterized by single particle tracking analysis.

تصور ديناميات الانتشار من نانورود الذهب على غشاء الخلية باستخدام جسيمات نانوية واحدة Darkfield المجهرية

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Biochemistry

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

التحليل الكمي لديناميكيات حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Protocol for Analysis and Consolidation of TrackMate Outputs for Measuring Two-Dimensional Cell Motility using Nuclear Tracking

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To understand the regulation of cell motility, we must be able to measure it easily and consistently under different conditions. Here we describe a method for measuring and quantifying single-cell and bulk motility of HaCaT keratinocytes using a nuclear stain. This method includes a MATLAB script for analyzing TrackMate output files to calculate displacements, motility rates, and trajectory angles in single cells and in bulk for an imaging site. This motility analysis script allows for quick, straightforward, and scalable analysis of cell motility rates from TrackMate data and could be broadly used to identify and study the regulation of motility in epithelial cells. We also provide a MATLAB script for reorganizing microscopy videos collected on a microscope and converting them to TIF stacks, which can be analyzed using the ImageJ TrackMate plugin in bulk. Using this methodology to explore the roles of adherens junctions and actin cytoskeletal dynamics in regulating cell motility in HaCaT keratinocytes, we demonstrate evidence that Arp2/3 activity is required for the elevated motility seen after &#945;-catenin depletion in HaCaT keratinocytes.

This protocol for high-throughput measurement of cell motility in HaCaT keratinocytes describes methods for collecting and processing images of cell nuclei and performing particle tracking using the ImageJ plugin TrackMate.

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

قياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية أثناء الانتشار باستخدام المجهر الخلوي الحي

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Types of Membrane Protrusions

The protrusion of the cell surface is an initial step for several cellular processes, including cell migration, phagocytosis, and neurite outgrowth. These membrane protrusions are a result of cytoskeletal rearrangement. The most&#160; widely observed cell protrusions include lamellipodia, pseudopodia, filopodia, microvilli, invadopodia, and podosomes. These protrusions can be of two types &#8212; static or dynamic.
The microvilli, an example of stable protrusions, are finger-like projections with a generally stable actin architecture. These brush-like extensions are found on the apical surface of epithelial cells lining internal organs, such as the intestine. They greatly increase the surface area for enhanced nutrient absorption.
Contrastingly, dynamic protrusions are primarily involved in cell migration. The majority of these structures use actin polymerization as the driving force for membrane deformation. Additionally, actin binds myosin motor proteins to form contractile bundles. The myosin motors pull on the actin filaments, thus rearranging them during migration. Based on their appearance, actin-dependent protrusions are classified as lamellipodia, pseudopodia, filopodia, and invadopodia.
Many migrating cells like keratinocytes or fibroblasts exhibit lamellipodia, which are thin, sheet-like projections at the leading edge of these cells. They are involved in the rapid migration of cells to sites of injury for repair and regeneration. Lamellipodia&#160; can extend bundled actin filaments to form finger-like projections called filopodia. For example,&#160; neurons form these outgrowths to sense environmental signals and rewire the nervous system after trauma.
Other membrane protrusions include the podosomes&#160; and invadopodia. While podosomes are transient peg-like structures developed by migrating cells like macrophages, invadopodia are projections produced by metastatic cells on the extracellular matrix. Additionally, invadopodia secrete proteolytic enzymes, degrading the extracellular matrix to break tissue architecture and metastasize into adjacent tissues. Lastly, blebs are spherical membrane projections formed due to internal hydrostatic pressure. They do not depend on the actin cytoskeleton for their enlargement. Fibroblasts and immune cells exhibit bleb formation for migration and other cellular processes such as apoptosis.

أنواع نتوءات الغشاء

The protrusion of the cell surface is an initial step for several cellular processes, including cell migration, phagocytosis, and neurite outgrowth. These ...

Education

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Cell Polarization and Migration

KEY TERMS AND CONCEPTS

Mechanism of Lamellipodia Formation

Cells migrating in response to external stimuli form lamellipodia, which are thin membrane protrusions supported by a mesh of linked, branched, or unbranched actin filaments. These actin filaments interact with myosin motor proteins, creating the dynamic actomyosin complex within the cytoskeleton. Contractility, or the ability to generate contractile stress, is inherent to the actomyosin complex. It helps cells detect the stiffness of the surrounding ECM and exert contractile force for migration.
At the leading edge, the binding of an activated Rac GTPase to the WAVE complex initiates lamellipodia formation. Subsequently, the WAVE complex changes conformation to prime actin nucleators like the Arp2/3 complex for polymerization and branching of filaments. Additionally, members of the formin family localize at the sites of lamellipodia formation, elongating the unbranched filaments. The force generated by continuous actin polymerization pushes the membrane outwards and forms the membrane protrusion. The actin mesh at the leading edge contributes to the formation of focal adhesion points on the ECM, preventing the retraction of lamellipodia.
After lamellipodia formation, the dissociation of filaments begins at the rear end of the dynamic actin meshwork. The actin monomers steadily detach from the minus ends and attach to the plus ends of filaments in the actin network, resulting in treadmilling. This cyclic assembly and disassembly causes&#160; the forward movement of the entire actin filament network even though the position of individual filaments remains stationary to the substratum.
Behind the dynamic lamellipodial meshwork lies a stable network of bundled linear actin filaments called the lamella. This actin network supports the lamellipodium by developing mature and strong adhesion sites, which resist cell compression during migration. Additionally, stable actin filaments of the lamella associate with myosin proteins and use their inherent contractibility to propel the cell forward.

آلية تشكيل Lamellipodia

Cells migrating in response to external stimuli form lamellipodia, which are thin membrane protrusions supported by a mesh of linked, branched, or ...

Mechanism of Filopodia Formation

Filopodia are thin, actin-rich cellular protrusions that play an important role in many fundamental cellular functions. They vary in their occurrence, length, and positioning in different cell types, suggesting their diverse roles.
Their main function is to guide migrating cells during normal tissue morphogenesis or cancer metastasis by recognizing and making initial contacts with the extracellular matrix. However, they can also act as stationary cell anchors or help to establish communication between two cells. For example, the formation of filopodial bridges between two adjacent endothelial or epithelial cells is important for the subsequent establishment of adherens junctions. In addition, filopodia can also help the cells to reach and internalize distant targets, such as pathogens.
Filopodia Formation and Disassembly
Actin nucleation, elongation, and bundling are critical for filopodia formation and function. The filopodia core comprises 12-20 actin filaments spaced 12 nm apart. Bundling of these filaments by fascin is crucial to give filopodia the rigidity to maintain its elongated shape.
The disassembly of actin filaments during the retraction phase involves periodic helical and rotational motion of the actin shaft and is regulated by several factors. For instance, capping proteins promote filopodial retraction by shielding the polymerizing ends of the filaments from further elongation. RhoA kinase activity also regulates actin polymerization within filopodia.

آلية تشكيل Filopodia

Filopodia are thin, actin-rich cellular protrusions that play an important role in many fundamental cellular functions. They vary in their occurrence, ...

Cancer Cell Migration through Invadopodia

Invadosome is a broad category of cell surface structures with proteolytic activity that&#160; degrades the extracellular matrix (ECM). Invadosomes are present in normal cell types, including macrophages, endothelial cells, and neurons, as well as tumor cells. Although the macrophage podosomes and tumor cell invadopodia are classified as invadosomes, they have different structures, molecular pathways, and functions. Podosomes are short structures that last for a few minutes. However, invadopodia can last for hours and are many microns in length.
In tumors, invadopodia are essential for cell intravasation and extravasation through blood vessels. They are similar to lamellipodia and filopodia, with a filamentous actin core shaped by actin nucleators and regulatory factors. The lifecycle of an invadopodium is initiated by complex processes involving various signaling cascades that remodel the cytoskeleton and cell membrane. The actin cytoskeleton is reorganized and assembled into new filaments and branches, which requires the activity of actin nucleators such as formins or the ARP2/3 complex.
The Arp2/3 complex requires nucleation-promoting factors (NPF) for optimal activity as it is slow to spontaneously initiate new actin branches. Cortactin, an NPF and scaffold protein, recruits ARP2/3 to filaments, allowing branching of the actin network. Additionally, cortactin can stabilize the newly generated branches. The formin proteins induce the elongation of unbranched actin filaments, while filament bundling is coordinated by fascin. Together these events promote actin filament polymerization and maturation of the invadopodium.&#160;
After the invadopodium stabilizes, kinesins use the neighboring microtubules as tracks to transport vesicles with proteases from the Golgi network. These vesicles release enzymes such as&#160; matrix metalloproteases, cathepsins, and serine proteases from the membrane of the invadopodia to degrade the surrounding ECM. Lastly, the actin core is disassembled to retract the invadopodium. Several proteins are implicated in the retraction pathway, but it is unclear how these proteins interact during the final stage of the invadopodium life cycle.&#160;

هجرة الخلايا السرطانية عبر Invadopodia

Invadosome is a broad category of cell surface structures with proteolytic activity that&#160; degrades the extracellular matrix (ECM). Invadosomes are ...

Cell Migration

Cell migration, the process by which cells move from one location to another, is essential for the proper development and viability of organisms throughout their life. When cells are not able to migrate properly to their ordained locations, various disorders may occur. For example, disruption in cell migration causes chronic inflammatory diseases such as arthritis.

<h4>General Mechanism</h4>

Generally, cellular migration begins when a cell, such as a fibroblast, responds to an external-polarizing-chemical signal. As a result, one end extends itself as a protrusion called the leading edge, which attaches itself to substrates via secreted adhesive compounds, in its microenvironment. The trailing edge&mdash;the area that serves as the back of the cell&mdash;also adheres to substrates to anchor the cell. After adhesion, the cell is propelled towards its destination by a sequence of contractions that are generated by cytoskeletal motility structures. Then, the adhesive attachment at the trailing edge gets released. These steps are repeated cyclically until the fibroblast reaches its destination.

<h4>Polarization</h4>

There is a diversity in the different types of signaling molecules that initiate cell migration. They illicit two types of responses: chemokinetic and chemotactic. Chemokinesis refers to movement that occurs when signaling molecules either symmetrically or asymmetrically stimulate cell migration without dictating the directionality of the resultant movement. Chemotaxis refers to a movement where a gradient of soluble (chemotactic) or substrate-bound (haptotactic) signaling molecules dictates the directionality of cellular movement.

Membrane receptors such as G-protein coupled receptors (GPCR) and receptor tyrosine kinase receptors (RTK) detect external signaling molecules and cause an accumulation of phosphatidylinositol (3,4,5) triphosphate (PIP3) at the leading edge. The accumulation of PIP3 then leads to the activation of Rho-family Ras-like small proteins called Rac, Cdc42, and Rho. Rac and/or Cdc42 cause cytoskeletal changes such as actin polymerization at the leading edge while Rho causes actin-myosin contractions at the trailing edge. As a result of actin polymerization, protrusions are generated at the leading edge.

<h4>Types of Protrusions</h4>

Actin serves as a physical scaffold for protrusions. Consequently, the shape of protrusion structures varies depending on how actin is assembled. Two commonly studied types of protrusions are lamellipodia and filopodia. Lamellipodia are broad, sheet-like protrusions that contain a branched network of thin, short actin filaments. When lamellipodia lift away from the substrate and move backward, a notably distinct ruffling movement occurs. Lamellipodia protrusions can be found in cells like fibroblasts, immune cells, and neurons. Filopodia are thin-finger-like protrusions that emanate from cell membranes. They are often observed in cells, such as neurons, working in tandem with lamellipodia during migration.