Bu çalışma (CAC BY R00MH080599, NC R21 NS062313 ve NS069844) Ulusal Bilim Vakfı (hibe sayısı CAC IOS-0842701) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Biz teknik destek için James Schutt, Emily Han ve Leni Truong kabul etmek istiyorum, ve sinek hatları için Bloomington Stok merkezi olacaktır. Tüm cips Michigan Üniversitesi&#39;nde Lurie nanofabrication Tesisleri&#39;nde imal edildi.

1.. PDMS Chip yapma SU-8 kalıp bir PDMS çip yapmak için adımları 1.1-1.7 izleyin. Bir çip üzerinde-el olduğunu, ancak kullanımı için monte gerekiyorsa, 1.8 adıma atlayın. <ol><li> PDMS baz 45 g ve küçük tek kullanımlık plastik kap içinde bir PDMS kiti maddesi (10:1 oranı) kür 4.5 g karıştırın ve iyice bir plastik karıştırma sopa kullanarak karıştırın. </li><li> Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için 10 dakika boyunca bir vakum kabı (örneğin bir kurutucu) &#39;de kap yerleştirin. </li><li> Çapında plastik bir kaba 150 mm altındaki SU-8 kalıp koyun ve yavaş yavaş, kalıp üzerindeki PDMS dökün. PDMS dökerken kabarcıkları üretmek için değil dikkat edin. </li><li> 4 saat boyunca 650 ° C&#39;de bir fırında (veya inkübatör) &#39;de PDMS Cure. </li><li> Fırından tedavi PDMS/SU-8 kalıp çıkarın ve birkaç dakika boyunca soğumaya bırakın. </li><li> Bir jilet kullanarak, SU-8 kalıp kenarı boyunca tedavi PDMS kesilmiş ve SU-8 kalıp ayırmak. </li><li> PDMS levha BölBir jilet kullanarak bireysel PDMS cips içine. </li><li> Bir 21 G iğne kullanılarak dağıtma, PDMS çipin (şekil 1A&#39;da gösterilen) vakum portu bir delik sokmak. </li><li> 23 G dağıtma iğne alın ve iğne kilit göbeğinden tüyo kırmak için kendi tabanından birkaç kez iğne ucu bükün. </li><li> Boru iğnenin en azından bir milimetre kapsar, böylece polietilen boru küçük bir parça halinde 23 G iğne ucu yerleştirin. Sonra uzakta iğne aşırı boru kesmek için jilet kullanın. Bu vakum giriş noktasına yerleştirildiğinde bir yalıtım oluşturur iğnenin bir ucunun etrafına plastik bir halka oluşturur. </li><li> Bir ters mikroskop (Şekil 1 B ve 2A-B) ile birlikte kullanım için: vakumlu port deliğine 23 G iğne ucu yerleştirin. Dik bir mikroskop (Şekil 1C ve 2C-D) ile kullanmak için: bir 21 G dağılma ile PDMS çipin yanı üzerindeki bir ikinci delik açmakİğneyi nsing, bu delik taraftan ilk delik erişim sağlayacaktır. Daha sonra, yan deliğe boru halka ile 23 G iğne ucu yerleştirin. En iyi delik (Şekil 1C) mühürlemek için PDMS çipin üst üzerinde çift taraflı bant bir parça yerleştirin. </li><li> Uzunluk olarak yaklaşık 20 cm olan polietilen bir boru parça al. Vakum portuna sokulur iğne ucu için boru bir tarafı bağlayın. </li><li> (Malzeme listede &#39;&#39;3-yollu valf bakınız), 3-yollu vana bağlantı noktalarından birine borunun diğer tarafında geç </li><li> Kalan iki girişlerinden birine bir 20 ml şırınga takın. Son liman çevreye açıktır. </li></ol> 2. Canlı Görüntüleme Larva Chip kullanma <ol><li> Şeffaf yapışkan bant ile PDMS çip temizleyin. Çipin altına bir parça bant takın. Emin bant tüm PDMS yüzeye temas olun ve sonra şeridi sıyırın. </li><li> Olmadığından emin olmak için yukarıdaki adımı 2-3x tekrarlayınPDMS çip yüzeyinde (önceki deneylerden elde tutulan) partiküller ya da herhangi bir yağ vardır. PDMS çip yeniden olduğu için, bu cam PDMS yapışma etkileyen ve yeterli bir sızdırmazlık neden gibi yağlı bir tortu çıkarmak çok önemlidir. </li><li> Su içeren bir Petri 3. larva evresindeki erken (yani yağmalama) aktarın. (Toplayıcı 3 instar evre larva ziyade kültür flakon tarafı daha, gıda vardır). Kültür ortamının kaldırmak için su içinde larvaları batırın. </li><li> Temiz bir cam lamel alın ve onun merkezinde Halokarbon 700 yağ küçük bir damla koyun. </li><li> Forseps kullanarak, hafifçe pick up temiz, (larva uzunluğu ~ 3,5-4 mm olmalıdır) sudan 3 instar larva erken düzenledi. Aşırı su çıkarmak ve ardından petrol damla yerleştirmek için hafif bir mendil veya kağıt havlu üzerine kısaca hayvan yerleştirin. Damla kadar küçük larvaların trakea kaplı olmayan şekilde olmalıdır. Larva sta izin10 saniye boyunca petrol damla y. </li><li> Petrol açılan larva çıkarın ve sonra temiz bir cam lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Başka temiz bir cam lamel larva transferi. Bu adım, aşırı yağı temizler. </li><li> Larva yönüne dikkat edin. Nöral kord ve segmental sinirler görüntüleme için, larva ventral yüzü lamel oturmak gerekir. Iki boyuna trakeal tüpler ile karakterize olan dorsal yüzü, yukarı doğru bakmalıdır. Not: Bu larva doğal tercih yönlendirmedir. </li><li> Yavaşça larva üstüne PDMS çip yerleştirin. Larva vakum noktasına yönelik kuyruğu, microchamber merkezi ortasına aynı hizada olmalıdır. Larva odasının kenarlarına değmeyecek dikkatli olun. Bu ön ve arka trakeal terminalleri için özellikle önemlidir. Not: Bu adım en iyi bir stereo mikroskop altında yapılır. </li><li> Iyi bir sızdırmazlık elde etmek için cam lamel karşı PDMS çipi itin. Larva tamamen emin olunPDMS çip cam lamel dokunuyor microchamber tarafından eklenmiştir. </li><li> Şırınga bir vakum oluşturmak için (tüp yoluyla) PDMS microchamber hava çekmek için böyle üzerinde 3-yollu vanayı kapatın. </li><li> Tek bir el ile sıkıca PDMS çip / cam lamel tutun. Şırınga pistonu çekmek için diğer elinizi kullanın. Direnç vakum oluşturmak için, şırınga kolu hissedilir kadar, hava 2-2.5 ml çekin. Vakum PDMS çip, yağ ve lamel arayüzler arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşturur ve larva hareketliliğini kısıtlar. </li><li> PDMS çip şırıngadan ve çevreden izole edilir, öyle ki kapatma vanasını açın. Sonuç olarak, nispeten kararlı bir vakum seviyesi, şırınga pistonu tutulması için gerek kalmadan microchamber korunur. </li><li> Tüm hayvan vücut microchamber içine yerleştirilir, ve hayvan hareketsiz olduğundan emin olmak için Stereoskop altında larva kontrol edin. Trakea görünür olmalıdır. Geri kalanıPDMS çip lamel ile temas halinde olmalıdır. Not: doğru çip hareketsiz hayvanların örnekleri için Şekil 2E ve 2F bakınız. Bazı yanlış yönelimleri Şekiller 2G ve 2H gösterilmiştir. </li><li> Mikroskop larva çip (yonga PDMS + cam lamel) yerleştirin. Larva çip, boru ve şırınga lamel PDMS çipin ayrılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Dik bir mikroskop için, çift taraflı bant (Şekil 1C) ile mikroskop aşamasında çip &#39;üst&#39; tarafını düzeltmek. </li><li> Ilgi hayvanın yapısı (ler) bulmak ve görüntüleme gerçekleştirmek için yüksek büyütme hedefi (yağ daldırma, 40-63X tavsiye edilir) kullanın. Bazı durumlarda, daha düşük bir büyütme daha yüksek bir büyütmede geçmeden önce görüntüleme için arzu edilen bölgesini tespit etmek gerekli olabilir. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandığında, pozisyonuna geçiş valfı tarafından yapılan vakum uygulaması durdurulurbu ortama açıktır. </li><li> Lamel PDMS çipi ayırın. Larva derhal hareketli olmalıdır. </li><li> Microchamber gelen larva kaldırmak ve yavaşça toparlanma için bir üzüm suyu agar plaka üzerinde larva yerleştirmek için forseps kullanın. </li></ol> 3. Larvaların segmental sinirler bir Sinir Crush Yaralanma Inducing <ol><li> Izole etmek için yukarıdaki adımı 2.3 izleyin erken istenen genotip 3. larva evresindeki düzenledi. Adım 2.3 &#39;de açıklandığı gibi gıda kaldırmak için suda larva yıkanmak. </li><li> CO ile, standart bir sinek CO 2 Anesthetization istasyonu kullanın 2 ped larvaları bastırmak için, bir diseksiyon stereomicroscope altında tuttu. Larva 1-2 dakika için CO 2 pad üzerinde yerleştirildikten sonra immotil haline gelmelidir. </li><li> Şimdi stereomicroscope altında bir üzüm suyu agar plaka üzerine tek bir anestezi larva yerleştirin. Ventral sinir kablosu görselleştirmek ve (manikür sinirler segmental kadar hayvan ventral tarafını çevirin <strong&gt; Şekil 3). Larva tamamen immotil olduğundan emin olun. </li><li> Dumostar sayı-5 forseps kullanarak, sıkı 5-10 saniye için manikür segmental sinirler çimdik. Bu doğru yapıldığında, manikür bozulmadan kalır ve vücut duvarı deldi değildir. Not: yaralanması, ön-arka gövde ekseni boyunca farklı pozisyonlarda yapılabilir sürece ventral sinir kablosu, tükürük bezleri, bağırsakların zarar değildir. Şekil 3B &#39;de gösterildiği gibi en etkili yaralanma konumu, 3. karın segment sonuna doğru yer alır. Bu konum zararların en sinirler de yaralanma ve hayvan öldürmeden çoğaltmak kolay değildir. </li><li> Yaralanma sonrası, hayvan çevirmek aşağı üzüm plaka üzerindeki ventral yüzü o kadar. Onun kafasını taşımak ve yemek gerekir. Yaralanma başarılı olursa, o zaman larva posterior yarısı felç olacak. </li><li> 25 de üzüm suyu agar plaka üzerinde yaralı hayvanları tutmak ve# 176; C deneysel amaca göre istenilen zaman için. Motonöronlar için, proksimal güdük yaralanma 14 8-10 saat içinde filiz başlar ve distal güdük 6-8 saat 15 içinde dejenere başlar. Sınıf IV da duyusal nöronlar için, proksimal güdük yaralanma sonrası 3-4 saat içinde dejenere için 4-6 saat, ve distal güdük başlangıç ​​içinde filiz başlar. Not: Uygun Gal4 sürücüleri ve floresan gazetecilere, filizlenme ve dejenerasyon (örneğin, bakınız Şekil 6) larva çip görülebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Miller, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+demonstrates+that+Liprin-alpha+is+required+for+trafficking+of+synaptic+vesicles.">Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles.</a> Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo.">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).</li><li>Fuentes-Medel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+muscle+sculpt+neuromuscular+arbors+by+engulfing+destabilized+synaptic+boutons+and+shed+presynaptic+debris.">Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , 476-480 (2012).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance.">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 558, 489-502 (2004).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices.">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+vivo+imaging+of+cellular+responses+to+neural+injury+in+Drosophila+larvae.">Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Schmid, A., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuromuscular+junctions:+histology+and+in+vivo+imaging.">Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging.</a> Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+Low-budget+Laser+Axotomy+System+to+Study+Axon+Regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2.</a> 2, 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li><li>Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neuropeptide+expression,+transport,+and+exocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster.</a> J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130, 5385-5400 (2003).</li><li>Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+unmixing+macro+for+ImageJ.">Linear unmixing macro for ImageJ.</a> European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).</li><li>Koon, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+paracrine+control+of+synaptic+and+behavioral+plasticity+by+octopaminergic+signaling.">Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling.</a> Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).</li><li>Yarali, A., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neurogenetic+Dissociation+between+Punishment-,+Reward-,+and+Relief-Learning+in+Drosophila.">A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila.</a> Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite-specific+remodeling+of+Drosophila+sensory+neurons+requires+matrix+metalloproteases,+ubiquitin-proteasome,+and+ecdysone+signaling.">Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Microfluidic+Devices+for+in+vivo+Imaging+of+C.+elegans,+Drosophila.">Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein.">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biol. 10, (2012).</li><li>Shin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74, 1015-1022 (2012).</li><li>Watkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLK+initiates+a+transcriptional+program+that+couples+apoptotic+and+regenerative+responses+to+axonal+injury.">DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).</li><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li><li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite.">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).</li><li>Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+growth+and+function+in+Drosophila+with+an+extended+larval+stage.">Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage.</a> J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Yapma veya larva çip elde: Larva yonga, cam lamel bağlı bir PDMS bloğu (&#39;PDMS çip&#39; olarak adlandırılır) oluşur. 1. adımda protokol yapma ve larva çipleri kullanarak, bir SU-8 kalıp kullanılabilir olduğunu varsayarak için prosedür açıklanmaktadır. SU-8 kalıp photolithographically (ayrıntılar Ghannad-Rezaie vd. 12 bakınız) bir silikon yonga üzerinde bir 140 mikron kalınlığında SU-8 fotorezist tabaka desenlendirme tarafından mikrofabrike edilir. SU-8 kalıp mikroimalat özel ekipman erişimi gerektirir, biz bir mikroimalat tesisinden sipariş öneririz (örn.. Michigan 14 Üniversitesi LNF tesis), ya da onlara sağlanan yonga tasarımı göndererek dökümhaneden ek bir dosya olarak. On (farklı boyutlarda larvaları ile kullanım için, örneğin) PDMS yonga tasarımı, DXF dosya (örn. Autocad) kolları CAD yazılımı değiştirmek isterse de kullanılabilir. Bir SU-8 kalıp da Fernandes talimatı izleyerek içi yapılabilir vd. 27. Pek çok okuyucu bu elverişli sadece kendi cips imalatı önce tekniğini denemek için bir örnek PDMS çip elde etmek için bulabilirsiniz. Bu istek üzerine serbestçe sunulacaktır. Canlı görüntüleme için mikroakışkan &#39;larva çip&#39; Kullanımı: Larva chip bir hareketsizleştirme yöntemi, anestezik kullanımı önler, ve bunun yerine, hayvanın hareketi kısıtlamak için, bir vakumun uygulanması yoluyla, basınç içerir. Hayvanlar birkaç saat 12, daha kısa bir immobilizasyon bir süre (5-15 dakika) için çip immobilizasyon yaşayabilir da tavsiye edilir. Bu hücre içi kalsiyum değişikliklere veya hızlı aksonal taşıma gibi çok sayıda hücresel olayları, görüntüleme için yeterli zamanı. Bu, aynı zamanda lazer tabanlı mikrocerrahi, ağartmanın ve photoconver gibi canlı hayvan istenilen manipülasyonları için yeterli zamanısion. Uzunlamasına tek bir hayvanda daha uzun bir süre boyunca etkinliklerini inceleme için, hayvanlar dinlenme süreleri ile ayrılmış, bir kaç kez çip yerleştirilir ve görüntülenebilir. Bunlar kolay bir besin kaynağı ve nem sağlamak gibi üzüm suyu agar plakaları, görüntüleme oturumları arasında dinlenmek için idealdir. Her oturum (aşağıda, sorun giderme bölüm 2 bakınız) hayvan zarar için bazı risk taşır bu yana çoklu görüntüleme oturumları, bir dereceye kadar larva hayatta etkiler. Hayvanlar rutin olarak% 50&#39;den daha fazla hayatta kalma oranı, iki gün boyunca&gt; 5 kez görüntülenebilir. Hayvanlara anestezi olmadığı için, hemen çip vakumun serbest bırakılması sonrasında sağlıklı ve hareketli bulunmaktadır. Orada görüntüleme oturumları arasındaki geri kazanım süresine gerek bu nedenle, bu nedenle oturumları arasındaki zaman aralığı esnektir ve deney amaçları için ayarlanabilir. Sorun Giderme: En yaygın tekniklarva çip ve önerilen çözümler şunlardır ile mahkemeye verdi: (1) hayvan çok fazla hareket ediyor. Çok fazla hareketlilik görüntüleme hedefleri engelleyebilir. Larva chip bu için en yaygın nedeni a) Hayvan çip için yeterli değildir, veya b) hareketsiz hale getirme adımı sırasında uygulanan vakum basıncı tehlikeye bulunmaktadır. Erken 3. larva evresindeki sahnelenen için bu protokolü açıklanan larva çip tasarlanmıştır. Hayvan için en uygun boyutu (ön-arka ekseni boyunca) uzunluğunda 3.5-4 mm&#39;dir. Direnç kolu hissedilir kadar vakum basıncı yeterli olduğundan emin olmak için, şırınga 2-2.5 ml çekin, ya da. Vakum çalıştığından emin bir göstergesi çevre kanal küçük kabarcıklar vakum kaynağına doğru yavaşça hareket görülebilir olmasıdır. Başka bir göstergesi yonga (üstten kaldırıldığında lamel her çip ile seyahat gerektiğidir ve bu bölmeyi taşınması için önerilen bir yöntemdirlarva konumlandırılmış ve vakum) hakkında bir kez. Boru içinde çatlak varsa vakum tehlikeye olabilir veya yağ boru içinde ise. Bu kolayca (adımlarla 1,6-1,14 itibaren) iğne ucu ve polietilen-50 tüp dağıtım 23 G değiştirerek ele alınabilir. (2) Hayvan chip görüntüleme sonra ölür. Prosedür hayvana göre en az strese neden amaçlanmıştır ve vahşi tip genotip hayvanlar da çip 12 hareketsizleştirme bir saat sonra, bir&gt;% 90 hayatta kalma oranına sahip edilir. Bazı genotipleri çipin strese daha az esnek olabilir için, ilk olarak vahşi tip hayvanların (örneğin, Canton S) hareketsizleştirici teknik hayatta kontrol edin. a) öldürücülüğü için en yaygın nedeni larva yanlış konumlandırma (Şekil 2G-H bakınız). Kütikül, baş ya da trakea parça bölmenin içinde tamamen değil ise, o zaman hareketsizleştirilmesi sırasında hasar ve edebilirçip (&gt; 4 mm) için çok büyük larva hayatta kalmak için daha az olasıdır. b) öldürücülüğü için daha az yaygın nedeni çok fazla basınç veya vakum çip yükleme kullanılmasıdır. Düzgün bir chip yerleştirildikten sonra, vakum ile oluşturulan basınç iyi tolere edilir. Bununla beraber, vakum ya da hayvan konumlandırılması ilk aşamada ya da aşırı basınç, bir sorun olabilir. Bu, doğru boyutta vahşi tip larvası ile deneyler ile ampirik olarak gerekli basınç derecesini öğrenmek için en iyisidir. çok Halokarbon petrol hayvanın trakea kapakları c) Eğer hayvan potansiyel olarak uzun süreli sağkalım ile ilgili sorunlar olabilir. Bu vakumun oluşturulması, görüntüleme sırasında optik için önemlidir ve bu çip içinde kurumaya karşı koyar: Yağ çipin çeşitli önemli rol oynar. Ancak aşırı yağ kaçınılmalıdır. (Bu ayrıca vakum ödün, boru ve şırınga içinde bir yağ yol açabilir). Yağ ile larva sadece ventral yüzü önerilen protokol mont, ardından rgörüntüleme için son lamel aktarmadan önce temiz bir lamel larva yerleştirme aşırı yağı emoves. d) fototoksisitenin görüntüleme oturumu deneyimli olabilir. Herhangi bir canlı görüntüleme uygulaması olduğu gibi, iyi bir derece hassas bir kamera veya dedektör kullanılarak elde edilir, düşük yoğunluklu lazer ışığı, kısa pozlama süreleri kullanmak için idealdir. Hg ışık kaynakları tarafından oluşturulan geniş spektrumlu ışık dahil, UV ışığı ile aydınlatma en aza indirmek için deneyin. Diğer konular ve geleceğe yönelik: Bu yöntem anestezikler kullanmak olmadığından, hayvanın kalbi atmaya devam ediyor. Bu diğerlerinden daha bazı yerlerde görüntüleme etkileyen bazı kaçınılmaz hareketlilik yaratır. Burada örnekler ventral sinir kablosu, segmental sinirler ve vücut duvarı kolayca kalp atışı müdahalesi olmaksızın görüntülü olabilir göstermektedir. Kalp görüntüleme etkiler durumda, normal hareketleri bazen ile düzeltilebiliranaliz yazılımı (örneğin, ImageJ için Görüntü Sabitleyici eklentisi). Tek tek nesneler (saat dakika) hızlı bir zaman ölçeği (hızlı aksonal taşıma örneğin ~ 1 mm / sn) ya da çok yavaş bir zaman ölçeğinde hareket olduğunda bu iyi çalışıyor. Ancak, nesne (ler) hızları ve yönleri bir dizi faiz hareket, bu kalp kaynaklı hareketler düzeltmek için zor olabilir. Başka bir sorun, hayvandan hayvana ya da çip aynı hayvanın çoklu görüntüleme oturumları arasındaki optik olarak hafif bir değişkenlik. Derin ilgi konusu nesne hayvan içinde olan, daha fazla bu değişim olacaktır. Segmental sinirler ve ventral sinir kablosu çok derin düzenli bir mikroskop üzerinde görüntülü sonra hayvan içinde normal olarak. Ancak larva çip yaşanan hafif basınç çok yakın manikür ve lamel bu yapıları iter. Lamel bu yapıların kesin mesafe tr küçük varyasyonları olacakmahkemeye Ial. Nesneleri için bir varyasyonunun bu gibi duyu nöronlarının hücre gövdeleri olarak, kütikül yakın, daha azdır. Bu optik olarak değişkenlik hesaba hayvan ve bağımsız çalışmalarda çok sayıda kullanmak için, özellikle yoğunluk ölçümleri yapmak için, önemlidir. Burada gösterilen örnek nöronlar içinde işlemleri üzerine odaklanmış olsa da, bu yaklaşım mikroskop amacın odaklama derinliğinde getirilebilir hayvanda herhangi bir yapı görüntüleme için uygun olmalıdır. Bu manikür, vücut duvarı kasları ve onların NMJs içerir. Hayvanın ventral tarafında nefes borusu ve potansiyel olarak sindirim sisteminin parçaları da görüntülenebilir olabilir. Hayvan da dorsal yüzeyine yakın yapıların kısa süreli görüntüleme için lamel yönelik sırt tarafı ile konumlandırılabilir. Derin hayvan içinde görüntü yapılara yeteneği kullanılan mikroskop amacın çalışma mesafesi ile sınırlıdır. Gibi im YapılarıVajina topu diskler yüksek büyütmede (örneğin 40X) amaçları için erişilemez. Bu protokol açıklanan larva yongaları (3.5-4 mm arasında değişen büyüklüklerde) erken 3 instar aşamasında larvaları için tasarlanmıştır. Ancak birçok ilginç sorular farklı larva aşamasında görüntüleme gerektirir. Geç 3. Instars karşılamak için 2. larva evresindeki, ya da daha büyük cips karşılamak için küçük cips kolayca aynı prensibi kullanarak dizayn edilebilir. (Ek Şekil 1 değişmiş odası boyutları ile silikon kalıplar yapmak için kolayca değiştirilebilir DXF dosyasını içerir). Tersinir contanın basit prensip da C gibi diğer organizmalara uygulanabilir ana varyant odası boyutu olmak elegans veya zebra balığı. Bir yararlı gelecekteki yönü tarama amaçlı kullanmak için, aynı anda birçok hayvanların hareketsiz bir çip tasarlamaktır. Ancak, bunun için, tasarım önemli ölçüde farklı olması gerekirçip hayvan konumlandırma konuları bağımsız olarak her hayvan için ele alınması gereken mevcut cihazdan. Larva periferik sinirlerde yaralanma yanıtları incelemek için sinir ezilme deneyi: Larva segmental sinirler için burada açıklanan sinir ezilme tahlil Drosophila periferik akson bir yaralanma tanıtmak için basit bir yöntemdir. Bu yöntemin avantajları şunlardır: a) bir Drosophila laboratuvarında (stereomikroskopta CO 2 kaynak ve forseps) bulunan standart araçları ile yapmak basittir, b) yaralanma sonrası sinir tellerinin biyokimyasal analiz yapma, pek çok hayvan için hızlı bir şekilde yapılabilir 14 uygulanabilir, c) bu yaralanma için moleküler ve hücresel cevaplar 14,15,28 yüksek oranda tekrarlanabilir ve omurgalı nöron 29,30 de önemlidir işlemler keşfedilmesi için kullanılabilir. Nöronların zarar için alternatif yöntemler focu etmektirsa yüksek güç lazer, örneğin lazer mikrocerrahi 17,31-33 üzerinden bir akson sever bir darbeli-UV veya femtosecond lazer. Larva çip gibi mikrocerrahi için hayvan konumlandırma için ideal bir yöntemdir. Ancak, yukarıda tartışılan çalışmalar arasındaki optik, minör farklılıklar, lazer tabanlı yöntem özellikle larva segmental sinirler, larva çoğaltmak için daha zor olabilir. Ayrıca, lazer bazlı aksonal yaralanma, her bir hayvan konumlandırmak için daha fazla zaman gerektirir, dolayısıyla hayvanlar (çok sayıda) ile büyük ölçüde yapmak çok daha zordur. Sorun Giderme: Sinir ezmek en sık karşılaşılan teknik sorun, iç organlara hasar ölümdür. Ezmek takibi yaparken, ventral sinir kablosu, tükürük bezleri, ya da bağırsakları çimdik için önemli değildir. Bu manikür delmek için değil de önemlidir. Bu sorunlar en manikür Surfac 45 ° açıyla forseps getirerek kaçınılıre (bkz. Şekil 3). Forseps kalitesi sonradan ezmek ve hayatta kalma etkinliği üzerinde büyük bir etkisi vardır. Biz Dumostar numara 5 forseps öneririz. Onların keskinliğini korumak için, forseps, dikkatle diğer amaçlar için kullanılan değil, onlar künt ya da katlanmasını hale kez değiştirilmesi gerekir. Hayvanın boyutu da ezmek etkinliğini etkileyebilir. Küçük hayvan (uzunluğu 3 mm&#39;den az) çok daha az muhtemel yaralanma hayatta kalmak için vardır. Büyük hayvanlar ile, (3 rd Instars dolaşıp), bu sinirleri bulmak ve büyük tükürük bezleri ve bağırsakların zarar görmesini önlemek için daha zordur, ve pupa öncesi yaralanma yanıtları incelemek için daha az zaman vardır. Sinir ezilme en etkili erken 3. evre larvaları yapılır (ki ~ ön-arka eksen boyunca uzunluğu 3-4,5 mm). Hayvan üzerine yükseltilmiş gıda kaynağı etkileyebilirezmek sonra manikür ve hayatta kalma gücü. Bu standart maya-glikoz tarifi yapılan gıda hayvanları yükseltmek için tavsiye edilir. Etkili ezmek yapmak için öğrenmek için en iyi yöntem ilk birincil yaşam ulaşma hedefi (ve pupa devresi) ezmek sonra 24 saat ile, birçok hayvan üzerinde uygulama olduğunu. Yeni Başlayanlar normalde düşük bir hayatta kalma oranı (örneğin% 10) var, ama teknik öğrenilen bir kez, sağkalım oranları ~ 90% ulaşabilirsiniz. Diğer konular ve geleceğe yönelik: Ezilme tahlil yaralanma site ve akson ve yaralanma siteye uzak sinapsların dejenerasyonu akson proksimali filizlenmesini incelemek için güçlü bir yöntem sağlar. Dejenerasyon oranları farklı nöron türleri arasında farklılık olsa da, onlar yaralanma testin tekrarlanabilirliği için vasiyet sağlayan, belirli bir nöron tipi içinde son derece tekrarlanabilir. Bunun tersine, &#39;rejeneratif&#39; filizlenmeproksimal akson gözlenen yanıt çalışmasında daha zordur. Segmental sinirin tüm aksonlar (örneğin, Şekil 6 ve Şekil 3) yaralanma siteye yakın çimlenme geniş başlatabilir. Ancak filizlenme ölçüde nöron nöron değişir, ve ölçmek zordur edebilirsiniz. Küba&#39;da benzer bir derecesi ve değişkenliği bir UV pulse-dye lazer kullanılarak tanıtılan segmental sinirler tek motonöronlann daha fokal lezyonlardan sonra görülebilir. Biz filizlenme nondiscriminate yön segmental sinirler rehberlik ipuçlarının yokluğu nedeniyle olduğunu yorumlamak. Buna karşılık, yakın hücre gövdeleri için lazer tarafından yaralı duyusal nöron akson kayıp akson 34 olarak aynı yönde yeni aksonal büyüme geçmesi. Hayvanın bu bölgede Aksonlar olasılıkla yenileyici akson rehberlik daha spesifik konumsal bilgi maruz kalmaktadır. Segmental sinirler içindeki ortamı çok resemblan olması olası değildiraslında embriyo onların rehberliği sırasında navigasyon aksonlar, dolayısıyla yenileyici aksonlar rehberlik bilgi sahibi olması beklenmektedir olmadığını çevreye ce. Segmental sinir ezilme deneyi kullanılarak rejenerasyon eğitim için başka bir sınırlama yaralı duyusal ve motor nöron akson hala hayvan uğrar önce kendi hedefine ulaşmak için (0.25-1 mm) ve sınırlı bir zaman çerçevesi (&lt;3 gün) kapsayacak şekilde önemli bir mesafe olması pupa devresi. Yeni yapılan bir çalışmada 3 instar larva aşamasında 35 süresini üçe prothoraciotropic hormon reseptörünün genetik manipülasyon tespit etti. Bu manipülasyon 9 yerine 3 gün, önemli ölçüde yaralanma sonrası nöronların kurtarma ve dejenerasyon eğitim için zaman çerçevesini genişletmek olacaktır. Bu yaralanma sinaptik biten yakın neden, özellikle böyle kendi postsinaptik hedefi ile bir yaralı akson yeniden bağlanma gibi yeni olaylar, gözlemlemek için yeterince uzun olabilir.

Meyve sineği, Drosophila melanogaster, 100 yılı aşkın bir model organizma olarak kullanılmıştır, ve temel sinyalizasyon ve omurgasız insana korunmuş gelişimsel yolları tanımlayan vesile kanıtlamıştır. Spesifik hücre tiplerinde floresan etiketli proteinlerin ifade için pek çok genetik araçlar vardır, özellikle bu yana, canlı görüntüleme hücresel mekanizmaları çalışmak için önemli bir yaklaşım olduğunu ve basit vücut planı ve Drosophila larva saydam manikür canlı görüntüleme için cazip bir sistem yapar. Canlı görüntüleme teknikleri için önemli bir zorluk noninvaziv hareketsiz ve mikroskopi için bir hayvan pozisyon etmektir. Geleneksel hareketsiz yaklaşımlar hayvan öldürmek her ikisi de, diseksiyon 1,2 ya da kloroform kullanımını içerir. Anestezik eter ve 4 izofloran 5-8 de kullanılmıştır. Anestetikler birçok avantaj sağlar iken, Onlar da bu nedenle okudu sürecini etkileyen ve hayvan üzerinde stres yaratabilir, nöral aktiviteyi ve (kalp atışı dahil) önemli fizyolojisini 9-11 inhibe. Eter ve izofluoran çalışmak için insan güvenlik kaygıları da vardır. Biz &#39;larva çipi&#39; 12 dediğimiz bir tek katmanlı PDMS mikroakışkan cihaz, Drosophila larvaları kılınması için bir ilaç içermeyen bir yöntem geliştirdik. Bu protokol almak veya larva çip yapmak nasıl anlatacağım ve erken sahnelenen 3. evre larvaları canlı görüntüleme için bunu kullanmak için nasıl. Yonga, bir şırınga ile bir vakumun uygulanması üzerine, hafif bir mekanik kuvvet ile hayvan hareketsiz, bir tatlı sıkı oturan microchamber, oluşur. Immobilizasyon yöntemi, böyle bir cam lamel yakın olan sinir kablosu, segmental sinirler ve vücut duvarı kasları gibi ventral yapıları getiriyor. Bu yüksek sayısal aper böyle yapıların yüksek çözünürlüklü görüntüleme için izin verirTure (yüksek büyütme) hedefler. (I) yonga larva kullanılması anestezi yapılmamış hayvanlarda in vivo görüntüleme için izin veren, kimyasalların kullanımını yerine geçer: diğer geleneksel tekniklere göre larva çip avantajları şunlardır. (Ii) Larva hemen (izofluoran 8,13 için 2 saat iyileşme dönemi aksine) çip yayımlanmasından sonra iyileşir. Bu saat ve gün, milisaniye dakika arasında değişen geniş bir zaman ölçekleri üzerinde görüntüleme için izin verir. (Iii) bir gaz geçirgen bir madde olan PDMS, kullanılması larva vücuda çevre oksijen / hava sürekli difüzyonu olanak vermektedir. (Iv) yonga kullanımı kolay ve güvenli, ve (v) yeniden kullanılabilir, ve en az bir maliyetle imal edilebilir. Larva çipi kullanarak talimatlara ek olarak, bu protokol 3 instar larvaları nöronal olayları incelemek için kullanımı çeşitli örnekler sağlayacaktır. Bu Axona canlı görüntüleme dahill ulaşım, yaralanma kalsiyum yanıtları, ve uzun mesafeler ve zaman ölçekleri üzerinde fotoğraf-Cabrio proteinlerin kaçakçılığı time-lapse çalışmaları. Çipin diğer bir uygulaması, aksonal yaralanma nöronal yanıtları incelemektir. Bunun için ek bir prosedür bir segmental sinir izdihama periferik sinirler içinde ons yaralamaktan için (bölüm 3) tarif edilir. Bu basit deney aynı zamanda işlenecek bir çok hayvan sağlayan standart bir diseksiyon stereomikroskop altında, hem de hızlı bir şekilde ve yeniden üretilebilir yapılabilir. Yaralanma hücresel yanıtları larva çip canlı görüntüleme ile ele alınabilir.

<table><tbody><tr><td>0.5 mm Polyethylene tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>Polyethylene tubing, I.D. = 0.023 in O.D. = 0.038 in</td></tr><tr><td>1 mm Polyurethane tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>BB521-63</td><td>Polyurethane tubing, I.D. = 0.063 in&amp;nbsp; O.D. = 0.125 in</td></tr><tr><td>Barb to barb connector</td><td>Bio Rad</td><td>732-8300</td><td>0.8 mm barb to barb connector</td></tr><tr><td>3-way Stopcock valve</td><td>Bio Rad</td><td>732-8104</td><td>Screw on valve for the syringe</td></tr><tr><td>Syringe (20 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-33</td><td>Screw on 20 ml syringe for&amp;nbsp; generating vacuum</td></tr><tr><td>Dispensing needles, 23 G (0.4 mm I.D., 0.6 mm O.D.)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Needle for outlet connection</td></tr><tr><td>Dispensing needles, 21 G, (0.6 mm I.D.,&amp;nbsp; 0.8 mm O.D.)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A679</td><td>Needle for outlet connection</td></tr><tr><td>Halocarbon oil</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td>Halocarbon oil 700</td></tr><tr><td>Dumostar Number 5 Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-498</td><td>For nerve crush</td></tr><tr><td>PDMS Kit (Base and curing agent)</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-C</td><td>24 mm x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)</td></tr><tr><td>Disposable Plastic Cup (9 oz)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic coffee stirrer stick</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grape juice agar plates</td><td></td><td></td><td>See &lt;a href=&quot;http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925&quot;&gt;http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925&lt;/a&gt; for recipe</td></tr></tbody></table>

using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae

Canlı görüntüleme, ancak bu canlı hayvanlarda zor olabilir, hücre biyolojik süreçleri incelemek için önemli bir tekniktir. Drosophila larva saydam manikür canlı görüntüleme çalışmaları için çekici bir model organizma yapar. Ancak, canlı görüntüleme teknikleri için önemli bir zorluk noninvaziv hareketsiz ve mikroskop bir hayvan pozisyon etmektir. Bu protokol bir polidimetilsiloksanın biz &#39;larva çipi&#39; diyoruz (PDMS) mikroakışkan cihaz üzerinde Drosophila larvaları hareketsizleştirerek ve görüntüleme için basit ve kullanımı kolay bir yöntem sunar. Larva çip bir şırınga aracılığıyla bir vakumun uygulanması üzerine, hayvan hareketsiz ve bu sinir kablosu, segmental sinirler ve gövde olarak ventral getiren yapıları, ince bir cam lamel, eklenmiş bir rahat oturan PDMS microchamber oluşmaktadır lamel yakın mesafede duvar kasları. Bu yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar, ve daha da önemlisi, ane kullanımını önlerfizyolojik süreçleri geniş bir aralığının çalışma kolaylaştırır sthetics ve kimyasallar,. Larvalar hareketsizleştirme kolayca geri olduğundan, bunlar kolaylıkla çoklu görüntüleme oturumları tabi tutulabilir. Bu saatler gün arasında değişen bir süre boyunca uzunlamasına ders çalışmalar için izin verir. Bu protokol adım adım çip ve nasıl 3 instar larvaları nöronal olayların canlı görüntüleme için çip kullanmak için nasıl hazırlanacağını anlatır. Bu olaylar aksonlar, yaralanma kalsiyum yanıtları, ve uzun mesafeler ve zaman ölçekleri üzerinde fotoğraf-Cabrio proteinlerin kaçakçılığı time-lapse çalışmalarda organellerin hızlı taşınmasını içerir. Çipin diğer bir uygulaması, rejeneratif ve aksonal yaralanma dejeneratif yanıtları incelemek, bu nedenle bu protokolün ikinci bölümü bir segmental sinir izdihama periferik sinirler içinde ons yaralamaktan için yeni ve basit bir prosedür açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae at JoVE.com

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için &#39;larva çip&#39; olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

using-microfluidics-chips-for-live-imaging-study-injury-responses

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

15.5K Görüntüleme.  University of Michigan.  Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar. 

Video: Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Biyomühendislik

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Gelişim Biyolojisi

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biyoloji

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Nörobilim

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such as aspiration or coverslip compression have been used to mechanically stimulate whole embryos. These approaches limit experimental design as they are imprecise, require manual handling, and can process only a couple of embryos simultaneously. Microfluidic systems have great potential for automating such experimental tasks while increasing throughput and precision. This article describes a microfluidic system developed to precisely compress whole Drosophila melanogaster (fruit fly) embryos. This system features microchannels with pneumatically actuated deformable sidewalls and enables embryo alignment, immobilization, compression, and post-stimulation collection. By parallelizing these microchannels into seven lanes, steady or dynamic compression patterns can be applied to hundreds of Drosophila embryos simultaneously. Fabricating this system on a glass coverslip facilitates the simultaneous mechanical stimulation and imaging of samples with high-resolution microscopes. Moreover, the utilization of biocompatible materials, like PDMS, and the ability to flow fluid through the system make this device capable of long-term experiments with media-dependent samples. This approach also eliminates the requirement for manual mounting which mechanically stresses samples. Furthermore, the ability to quickly collect samples from the microchannels enables post-stimulation analyses, including -omics assays which require large sample numbers unattainable using traditional mechanical stimulation approaches. The geometry of this system is readily scalable to different biological systems, enabling numerous fields to benefit from the functional features described herein including high sample throughput, mechanical stimulation or immobilization, and automated alignment.

The present protocol describes the design, fabrication, and characterization of a microfluidic system capable of aligning, immobilizing, and precisely compressing hundreds of Drosophila melanogaster embryos with minimal user intervention. This system enables high-resolution imaging and recovery of samples for post-stimulation analysis and can be scaled to accommodate other multicellular biological systems.

Çok Hücreli Organizmaların Yüksek Verimli Bir Mikroakışkan Sıkıştırma Sistemi Aracılığıyla Mekanostimülasyonu

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Için basit Mikroakışkan Cihazlar

Uzun süreli Canlı Görüntüleme

Canlı görselleştirme Drosophila Glial nöromüsküler Kavşağı