Name: applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Januschke laboratuvarındaki çalışmalar Wellcome trust grants 100031/Z/12/A ve 1000032/Z/12/A tarafından desteklenmektedir. Doku görüntüleme tesisi Wellcome'dan WT101468 hibesi ile desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tüm D. melanogaster larva beyinlerinin canlı görüntülenmesi, fizyolojik bir bağlama yakın koşullarda asimetrik nöral kök hücre bölünmelerini gözlemleme fırsatı sağlar. Protokolümüzün ilk bölümü larva beyinlerinin diseksiyonu konusundaki yaklaşımımızı tanıtıyor. Daha önce belirtildiği gibi13Hazırlığın kritik bir yönü beyne zarar vermekten kaçınmaktır. Bunun en zorlu yanı, beyni aşırı çekmeden komşu hayal disklerinden ayırmaktır. "Çekmeden kesmeye" yaklaşımımız, bir çift tokanın uçlarıyla bir taşlama hareketi yapmak veya dokular arasındaki bağlantıyı tutan diğer ikips ucu boyunca bir tokmak ucu kaydırmaktır (Şekil 1A) oysa Lerit ve ark. bir diseksiyon pimi ile testere benzeri hareketleri tanımlar. Deneyciye tüm yaklaşımları denemesini ve kendileri için en uygun olanı benimsemesini tavsiye ediyoruz. Ayrıca izole edilmiş beyinleri aktarmak için diseksiyon araçları yerine BSA veya FCS kaplı pipet uçları kullanmanızı öneririz. Kaplama, dokuların plastiğe yapışmasını önler ve dokuların güvenli bir şekilde aktarılmasını sağlarken, aktarım sırasında diseksiyon aracına yapıştıkları için olası bir geçici deformasyona maruz bırakmadan her zaman tamamen daldırmalarını sağlar. Kaplanmış uçlar, aynı anda birkaç beynin transferine izin vermek için başka avantajlara sahiptir, bu da örneklerin belirli bir ortamdaki ikamet süresini kontrol etmek için kritik olduğunda özellikle yararlıdır; diğer dokuların, hatta kırılgan olanların, örneğin yağ kütlelerinin transferi için uygundurlar; daha büyük uçlar kullanarak veya ucun ekstremitesini keserek çok çeşitli farklı numune boyutlarına uyum sağlayabilirler.
Daha sonra, bu protokol, bir kültür yemeğinin kapaklarında larva beyinlerini hareketsiz hale getirmek için Fibrinojen pıhtılaşmasının kullanımını açıklar. Bir beyin bir damla kültür ortamı + Fibrinojen içinde yönlendirilir, daha sonra Trombin ilavesi ile pıhtılaşma indüklendi. Fibrin oluşumu kademelidir ve gerekirse numunenin yönünün ince ayarlanabileceği bir zaman aralığı sağlar (Şekil 2C). Örneğin hafif bir sıkıştırması gerekiyorsa - larva beyinleri durumunda karşı tavsiye ettiğimiz - ayrıca 3.4.4 ve 3.5.2 adımları sırasında pıhtıya az çok numuneye yakın bastırılarak ince bir şekilde ayarlanabilir. Bu Fibrinojen pıhtılaşmasının, beyinlerin gaz geçirgen bir zar ve bir kapak kılıfı arasına monte edildiği Lerit ve ark.'da açıklanan protokole göre pıhtılaşmasının ana avantajı, canlı görüntüleme sırasında kültür ortamını değiştirme yeteneğidir. Protokolümüz üzerinde gaz geçirgen bir membran kullanmanın olası bir avantajı, beyinler pıhtı ve bazı ortamlar tarafından havadan ayrıldığı için yaklaşımımızla daha sınırlı olabilecek numunelerin optimal bir oksijenlenmesini sağlaması olabilir. Bu nedenle, kültür çanağı içindeki kültür ortamı miktarının etkisini değerlendirmemiş olsak da, pıhtıları tamamen daldırırken pıhtıların üstündeki kültür ortamı miktarını sınırlamayı öneriyoruz.
Pıhtıların manipülasyonu deneysel olarak zor ve zaman alıcı olabileceğinden, deneycinin ilk olarak pıhtıları örneksiz manipüle etmeyi uygulamasını öneririz. Kapakta kültür ortamı + Fibrinojen damlasının hacminin modüle edilmesi, Fibrinojen konsantrasyonu veya Trombin hacmi ve konsantrasyonu, hazırlığı kolaylaştırmaya yardımcı olabilir ve protokolü diğer doku türlerine uyarlarken önemli olabilir. Pıhtıları manipüle etme konusunda yeterli deneyime sahip olan birkaç beyin, gerekirse bir pıhtıda hareketsiz hale getirilebilir, ancak oryantasyonun ince ayarını zorlaştırır. Kapakta birkaç pıhtı oluşabilir, örneğin farklı genotiplerin görüntü örneklerine izin verir. Aynı kapak üzerindeki farklı pıhtıları farklı kültür ortamlarına maruz bırakmak da mümkündür, ancak farklı pıhtıları kaplayan kültür ortamı damlalarını asla karıştırmamaya özen gösterilmelidir. Larva beyinleri hareketsiz hale geldikten ve canlı görüntülemeye hazır hale geldikten sonra, aşırı fotodamajdan kaçınmak içinLerit ve ark. Bu önerilere sadece bir sahne inkübatörü ile canlı görüntüleme sırasında beyinleri 25 °C'de tutmak için değil, aynı zamanda görüntüleme başlamadan önce bu aşamayı en az 30 dakika önceden ısıtmak için de ekliyoruz. Elimizde, bunu sistematik olarak yapmamak güçlü bir odak kaymasına neden olur.
İlişkili mikroskopi yapabilmek ve canlı görüntülemeden sonra bir örneği düzeltebilmek ve immün yetisini düzeltmek bazı bağlamlarda avantajlı olabilir. Bununla birlikte, Fibrin pıhtılarını kullanmanın bir sınırlaması, bir beyni zarar vermeden bir pıhtıdan mekanik olarak izole etmenin neredeyse imkansız olmasıdır. Bu sınırlamayı aşmanın olası bir yolu, Plasmin ile Fibrin pıhtılarını bozmak veya Fibrin polimerizasyonuna izin vermek için düğmeleri taklit eden bir peptit eklenerek pıhtı sökülmesine neden olacak yöntemler geliştirmek olabilir28. Fibrin pıhtılarını tipik olarak tek hücreden 200 μM uzun dokuya kadar değişen örneklerde kullanırız, ancak 3 mm genişliğindeki yetişkin bombus arılarından pıhtılarda ve görüntü beyinlerinde de başarılı bir şekilde hareketsiz hale gelebiliriz. Pıhtılarda hareketsiz hale getirilebilen numune boyutunun üst sınırı belirlenmeye devam etmektedir. Benzer şekilde, genellikle hareketsiz örnekleri 4 ila 5 saat boyunca görüntülesek de, nöroblastları birincil kültürde 3 güne kadar başarıyla görüntüledik, bu da pıhtının en azından daha uzun süreli canlılığa engel olmadığını gösteriyor. Aksine, pıhtılar, bu amaç için peristaltik pompalar gibi cihazlara ihtiyaç duymadan, daha uzun süreli görüntüleme için bir gereklilik olan ortamın düzenli olarak değiştirilmesini kolaylaştırabilir. Fibrin pıhtılarının geçirgenlik parametrelerini ölçmemiş olsak da, pıhtıların lifli jel benzeri doğası hücre geçirgen molekülleri tarafından penetrable gibi görünmektedir. Latrunculin A, Colcemid veya 1-NAPP1, HALO etiketli ligandların ve hücre biyolojisinde kullanılan diğer standart boyaların fibrin pıhtısındaki hücrelere sorunsuz bir şekilde ulaştığını ve şimdiye kadar pıhtı tarafından tutulacak moleküllerle karşılaşmadığını, bunun da ampirik olarak test edilmesi gereken bir olasılık olduğunu bulduk.
Sonuç olarak, Fibrin pıhtılarının kullanılması, canlı görüntüleme için canlı dokuları hareketsiz hale getirmek için güvenilir ve nispeten kolay bir uygulama yolu sağlar. Yanal sürüklenmeyi sınırlamadaki kullanışlılığının ötesinde, canlı görüntüleme sırasında kültür ortamını değiştirme yeteneği, D. melanogaster nöroblastlarının asimetrik hücre bölümünü incelemeye yönelik kimyasal genetik yaklaşımımız için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır21. Bu tekniğin, özellikle kimyasal genetik veya örneğin protein kendi kendini etiketleme29içeriyorsa, çok çeşitli farklı dokulardaki çalışmalara faydalı olacağını öngörüyoruz.
MultiHyperStackReg makromuz, ardışık çerçeveleri veya yığın dilimlerini hizalayan TurboReg ImageJ eklentisine ve dönüşümleri diğer yığınlara uygulamaya izin veren MultiStackReg ImageJ eklentisine dayanır. MultiHyperStackReg, bu dönüşümleri hipertacklara (en az dört boyutlu yığınlar) uygulamak için izin verir. MultiHyperStackReg kullanımı, açıkladığımız gibi, çok fazla eylem gerektirir ve oldukça zaman alabilir, ayrıca 6.2 ve 6.3 adımlarında açıklanan tüm adımları otomatik olarak gerçekleştiren AutoHyperStackReg makrosunu yazdık. Ancak, MultiHyperStackReg aksine, AutoHyperStackReg şu anda bu yığının bir alt bölgeye dayalı bir yığının hizalamasını hesaplama imkanından yoksundur, bulduğumuz bir seçenek bazen tatmin edici bir hizalama için çok önemlidir. AutoHyperStackReg'in başka bir sınırlaması, kullanımının TurboReg ve MultiStackReg tarafından önerilen diğer dönüşümlerle değil, çevirilerle sınırlı olmasıdır, oysa MultiHyperStackReg, kullanıcının ihtiyaç duyması durumunda herhangi bir dönüştürme türüne bir hiperstack için geçerli olabilir. Gelecekteki sürümler bu işlevleri uygulayacak ve GitHub30. Son olarak, dönen linescan makromuz, korteks zaman içinde konumunu veya yönünü değiştirse bile, kortikal sinyalleri zaman atlamalarında hızlı bir şekilde ölçmenin kolay bir yolunu sağlar. İzleme modunun veya takip etmeme modunun analiz için en uygun olup olmadığı kortikal sinyalin kalitesine ve tutarlılığına bağlıdır. Kullanıcının her zaman noktası için korteksin nerede olacağını düşünmesi gerekmediğinden ve zaman içinde büyük konum ve yönelim değişikliklerine uyum sağlayabildiğinden, izleme modunun kullanımı daha kolaydır. Bununla birlikte, kortikal sinyal tüm film boyunca algılama için yeterince güçlü kalırsa uygundur: korteksten başka bir şeyin algılanmaması (örneğin, kortekse yakın parlak bir sitoplazmik bölme) aşağıdaki her zaman noktası için algılamayı tehlikeye atabilir (örneğin, sitoplazmik bölme korteksten uzaklaşır ve kortikal çizgiler onu geri kalan süre boyunca takip edebilir). Algılama, kullanıcı tarafından başlangıçta çizilen çizgiyle sınırlı olduğundan (örneğin, parlak bir sitoplazmik bölme algılamanın birkaç zaman noktası için başarısız olmasına neden olabilir, ancak sitoplazmik bölme algılama bölgesinden uzaklaştıkça, korteksin doğru tespiti devam ederse) bu tuzak yoktur, ancak korteks konumu veya oryantasyonu zaman içinde çok değişirse iyi davranmaz. İzleme modu için geliştirilecek bir sonraki özellik (GitHub30'damevcut olacak), yalnızca belirtilen zaman noktalarını analiz etme ve algılamanın gerçekleştirileceği ve daha sonra kullanıcının en azından sorunlu zaman noktalarından kaçınmasını sağlayacak bir referans zaman noktası (ilk zaman noktası yerine) tanımlama seçeneği olacaktır.

Drosophila, çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için önemli bir model sistemi olmaya devam ediyor ve onlarca yıldır birçok disiplinde bilginin ilerletilmesinde başarılı oldu. Özellikle öne çıkmasını sağlayan bir özellik, özellikle canlı görüntüleme için çok uygun olmasıdır. Hücre altı süreçleri veya hücre ve dokuların davranışlarını gerçek zamanlı olarak izleme yeteneği, hücre ve gelişim biyolojisi ile ilgili temel kavramların üretilmesine katkıda bulunmaya devam eder. Bu tür Drosophila örneklerini canlı ve sağlıklı tutmak için farklı gruplar tarafından birçok başarılı protokol geliştirilmiştir. Hayal diskleri 1 ,2, larva beyni3,4,5,6veya yetişkin dişilerin yumurta odaları 7 ,8,9veya yetişkin bağırsak10 gibi sinekten organlar ve dokular çıkarılabilir ve zaman atlamalı mikroskopi ile görüntüleme için kültürde tutulabilir. Canlı görüntüleme için önemli bir zorluk, numunenin mekanik darbelere duyarlı olabilecek numune bütünlüğünden ödün vermeden optimum çözünürlük ve hareketsizlik için görüntüleme yüzeyine yakın tutulmasını sağlamaktır. Drosophila larva beynindeki nöroblastlar veya nöronlar olarak adlandırılan nöral kök hücreleri incelemek için, örneğin, örneklerin görüntüleme yüzeyine yakın tutulması, mühürlü görüntüleme odalarında kültür ortamı ile kaplanarak elde edilebilir11,12,13. Bununla birlikte, bu yaklaşım medya değişimine kolayca izin vermez, böylece manevra için deneysel alanı sınırlar. Alternatif olarak, numuneler hazırlanabilir ve hücrelerin yapışıklıklarını artırmak ve açık kültür yemeklerinde çok noktalı ziyaret mikroskopisine ve genişletilmiş canlı hücre görüntülemesine izin vermek için tedavi edilen kapaklara yerlenebilir, potansiyel olarak medya değişimine izin verir, ancak medya değişimi sırasında örnek sürüklenmesini veya kaybını önlemek için kolay araçlar sağlamaz14,15.
Fibrin pıhtı yöntemi başlangıçta canlı vinç-sinek spermatositleri16 meiosis incelemek için geliştirilmiştir bu sorunların üstesinden gelmek için özel olarak uygundur. Fibrinojen ilgili kültür ortamında çözülür, Thrombin eklenmeden önce bu çözeltinin bir damlasına yerleştirilen ve yönlendirilen numuneler, çözünmeyen bir Fibrin pıhtısının, cam yüzeye yapışan yapışkan lifli bir ağın ve numunelerin kültür ortamına erişimini sağlarken hızlı bir şekilde oluşmasına neden olur. Ortam daha sonra pıhtı veya numune pozisyonuna zarar vermeden değiştirilebilir. Görüntüleme sırasında kültür ortamı değişimi, örneğin, inhibitörlerin orijinal yöntemde olduğu gibi eklenmesi veya yıkama veya nabız kovalama deneyleri için veya hücreleri ve dokuları yerinde tutarken canlı hücre görüntüleme sırasında floresan boyaların eklenmesi gerektiğinde arzu edilir. Fibrin pıhtıları Drosophila dokularının yanı sıra bireysel hücrelerin görüntülenmesi için uygundur13,17. Fibrin pıhtıları, şekilleri veya diğer özellikleri nedeniyle normalde Fibrin pıhtısı içindeki örnek konumunu ve pıhtının şeklini modüle ederek istenen şekilde yönlendirilmeyecek olan örnekleri yönlendirmeye yardımcı olmak için daha fazla kullanılabilir.
Burada mevcut Fibrin pıhtı bazlı görüntüleme yöntemlerimiz hakkında bir güncelleme sunuyoruz ve segmentasyon tabanlı görüntü analizi için araçlar sağlıyoruz ve gelişmekte olan sinek beynindeki nöroblast bölünmelerini incelemek için bu yöntemin kullanımına odaklanıyoruz. Aynı kültür çanağındaki farklı pıhtılarda birden fazla örneği takip etmek için rutin olarak Fibrin pıhtı yöntemini kullanıyoruz. Bu, i) merkezkant davranış veya mRNA lokalizasyonu canlı18,19gibi hücre altı olayların görüntülenmesini sağlar, ii) çok noktalı ziyaret kullanarak aynı görüntüleme ayarları altında farklı genotiplerin farmakolojik tedavisi üzerine örneklerin davranışını izlemek mikroskopi20, iii) enzimlerin akut inhibisyonunun etkilerinin incelenmesi21 ve iv) hedeflenen lazer-ablasyon üzerine hücrelerin fizyolojik ortamlarındaki hücre bölünmesinin yöneliminde meydana gelen değişiklikleri incelemek için sürüklenmeyi en aza indirmek22. Trombin ve Fibrinojen ve Fibrin pıhtısının istenmeyen etkilerinin her örnek için ampirik olarak test edilmesi gerekirken, Bu yöntem prensip olarak canlı hücre görüntüleme ile analiz edilecek her türlü örneği hareketsiz hale getirmek için uygundur ve Drosophila'da nöroblast biyolojisinin5,19,2'ninbirden fazla yönünü incelemek için başarıyla kullanılmıştır. 0 , aynı zamanda kadın mikrop hattı kök hücrelerinin sitosensör projeksiyonlarının dinamikleri23 ve Drosophila dişi yumurta odalarının folikül hücrelerinin akut aPKC inhibisyonu üzerine polaritedeki değişiklikler21.
Zaman atlamalı floresan görüntüleme, bu nicel bilgileri ayıklamak için yöntemler gerektiren karmaşık zaman çözümlenmiş 3D veri kümelerinin üretilmesiyle sonuçlanır. Burada, Drosophila larva beyinlerinin nöroblastlarında veya birincil hücre kültüründeki bireysel nöroblastlarda kortikal proteinleri ölçmek için geliştirilen hücre korteksinde çok kanallı floresanların yarı otomatik olarak ölçülmesine izin veren hiperstacks ve özel yapım ImageJ makrolarında sürüklenmeyi düzeltmek için kullanılabilecek ImageJ tabanlı24 makronun daha da geliştirilmesini açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Albumin bovine serum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from human plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex spot plate with nine depressions</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila, çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için önemli bir model sistemidir. Sineğin farklı gelişim evrelerinden gelen imaginal diskler, yetişkin dişilerin larva beyni veya yumurta odaları veya yetişkin bağırsağı gibi çeşitli organ ve dokular çıkarılabilir ve zaman atlamalı mikroskopi ile görüntüleme için kültürde tutulabilir, bu da hücre ve gelişim biyolojisi hakkında değerli içgörüler sağlar. Burada, Drosophila larva beyinlerinin diseksiyonu için mevcut protokolümüzü ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve daha sonra Fibrin pıhtılarını kullanarak larva beyinlerini ve diğer dokuları bir cam örtü üzerinde hareketsizleştirmek ve yönlendirmek için mevcut yaklaşımımızı sunuyoruz. Bu hareketsizleştirme yöntemi sadece Fibrinojen ve Trombin'in kültür ortamına eklenmesini gerektirir. Aynı kültür çanağındaki birden fazla numunenin ters mikroskoplarında yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için uygundur, çok noktalı ziyaret mikroskopisinde mikroskop aşamasının hareketlerinden kaynaklanan yanal sürüklenmeyi en aza indirir ve görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesini ve çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, sürüklenmeyi düzeltmek ve zaman atlamalı analizden belirli nicel bilgileri ayıklamak ve işlemek için rutin olarak kullandığımız özel yapım makrolar sunuyoruz.

Drosophila dokularının Fibrin pıhtıları ile hareketsiz hale getirilmesi ve canlı görüntüleme sırasında kültür ortamı değişimi. Adım 2 ' de sunulan prosedürü takiben parçalandıktan sonra (Şekil 1) ve adım 3 ' te sunulan prosedürü takiben aynı kapaktaki Fibrin pıhtılarında hareketsiz hale geldikten sonra (Şekil 2), GFP etiketli Bazukayı (Baz::GFP) ifade eden larva beyinleri, polarite proteini Par-3'ün sinek ortezi, zaman atlamalı çok konumlu konfokal görüntülemede 30 dakika boyunca görüntülenmiştir. Baz::GFP, küçük ATP analogu 1-NAPP120'nineklenmesiyle atipik protein kinaz C'nin (aPKC) akut inhibisyonunu sağlayan bir alele olan apkcas4ile birleştirilir. 1-NAPP1 bu nedenle 4. Kinaz aPKC'nin vahşi tip bir versiyonunu taşıyan kontrol beyinleri ATP analoguna tepki vermemişken, ek olarak aPKC'nin(apkcas4) analoga duyarlı bir mutasyonu taşıyan beyinler, nöroblastlarda ve soylarında Baz'ın nöroepithelium ve parlak kümelerinde bir kasılma gösterdi (Şekil 6, Video 1). Nöroblastlar zaman atlamalı boyunca bölünmeye devam eder, bu da dokunun sağlıklı kaldığını gösterir ve beyinler kültür orta değişimine rağmen çok az sürüklenme gösterir, bu da iyi hareketsiz olduklarını gösterir. Benzer şekilde,27'de sunulan prosedürü takiben parçalandıktan sonra, Baz::GFP ifade eden ovarioles aynı kapak üzerindeki Fibrin pıhtılarında hareketsiz hale getirildi ve 8 dakika boyunca görüntülendi, daha sonra 1-NAPP1 uygulaması apkcas4 mutant foliküler hücrelerin kasılmasına neden oldu, ancak kontrollerin değil (Şekil 7, Video 2).
MultiHyperstackReg kullanılarak yanal ve odak sürüklenmesinin düzeltilmesi. Hem yanal hem de netleme sürüklenmesini gösteren bir hiperstack(Video 3, sol panel) önce yanal sürüklenme için düzeltildi (adım 6.2, Şekil 3, Video 3, orta panel), daha sonra MultiStackReg eklentisi ve MultiHyperstackReg makrosu kullanılarak odak kayması (adım 6.3, Şekil 4, Video 3 , sağ panel) orijinal hiperstack'te gözlenen hareketlerin önemli ölçüde azalmasına neden oldu.
Dönen hatlar kullanılarak kortikal sinyal ölçümü Baz::GFP (yeşil) ve kızılötesi floresan protein (CD4::mIFP, kırmızı) ile etiketlenmiş transmembran protein CD4'ü ifade eden bir nöroblast bir mitoz sırasında görüntülendi. CD4::mIFP sinyali, nöroblastın çeşitli bölgelerindeki korteksi lineskanlarla (adım 7, Şekil 5, Şekil 8A–C)tespit etmek için referans olarak kullanıldı ve Baz::GFP sinyali tespit edilen konumlarda ölçüldü Şekil 8D). Bölünmeleri sırasında, nöroblastlar farklı ve zıt kortikal alanlar oluşturarak geçici olarak polarize oldular: apikal kutup ve bazal kutup. Baz, apikal kutbu tanımlar ve sürekli olarak, Baz::GFP sinyali nöroblastın apikal kutbunda arttı ve bölme sırasında bazal kutupta azaldı (Şekil 8C,D). Korteksin konumu zaman atlamalı boyunca tatmin edici bir şekilde izlendi (Şekil 8C, Video 4). Drosophila çizgileri ve genotipleri Ek Tablo 1–2'debaşvurulmaktadır.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Şekil 6: Canlı görüntüleme sırasında hareketsiz larva beyinlerine ATP analogunun uygulanması. (A) Baz::GFP'yi ifade eden iki larva beyninin canlı görüntülenmesi aynı kapakta hareketsiz hale getirilir. Kültür ortamı, 0 dakikada 10 μM ATP analogu 1-NAPP1 konsantrasyonuna değiştirilir. Kontrol beyinleri ATP analoguna gözle görülür şekilde tepki vermezken, aPKC'nin(aPKCAS4)analog hassas mutasyonu taşıyan beyinler nöroblastlarda ve soylarında nöroepithelium (ok uçları) ve parlak Baz kümelerinin daralmasını gösterir. 23 μM derinlik için 33 dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu Ölçek çubuğu: 20 μM. (B) Nöroepithelium büyütme. Ölçek çubuğu: 10 μM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Şekil 7: Canlı görüntüleme sırasında hareketsiz yumurta odalarına ATP analogunun uygulanması. Baz::GFP'yi aynı kapak kapağında hareketsiz olarak ifade eden iki yumurta boyunun canlı görüntülenmesi. Kültür ortamı, 0 dakikada 10 μM ATP analogu 1-NAPP1 konsantrasyonuna değiştirilir. Kontrol yumurtası odaları ATP analoguna gözle görülür şekilde tepki vermezken, aPKC'nin(aPKCAS4)analog hassas mutasyonu taşıyan yumurta odaları, sonunda yapışan kavşakların belirgin bir şekilde bozulmasına yol açan epitelin (ok uçları) bir daralmasını gösterir. 27 μM derinlik için 33 dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu Ölçek çubuğu: 20 μM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Şekil 8: Dönen çizgikanlar kullanılarak kortikal sinyalin ölçümü. (A) Baz::GFP (yeşil) ve CD4::mIFP (kırmızı) ifade eden canlı D. melanogaster nöroblast. Siyan çizgileri: ilk tarama hatları, ölçmek için dik olarak çeşitli kortikal bölgelere kadar izlendi. Ölçek çubuğu: 5 μM. (B) Kortikal çizgiler kullanılarak korteksin (koyu mavi çizgi) tanımlanması ve referans kanal olarak CD4::mIFP (kırmızı). Siyan çizgisi: korteks algılamadan sonra sinyalin ölçüldüğü "Etrafında ölç" parametresi (burada, 2 piksel) ile tanımlanan alan. Ölçek çubuğu: 2 μm. (C) Siyan: referans kanal olarak CD4::mIFP (kırmızı) kullanılarak (A) görüntülenen ilk tarama çizgilerinden dönen linescans yöntemi ile nöroblast bölünmesi sırasında tanımlanan kortikal alanlar. Ölçek çubuğu: 5 μM. Ok: apikal kutup. Ok ucu: bazal direk. (D) Baz ölçümü::GFP sinyal yoğunluğu zaman içinde görüntülenen dönen linescans tarafından tanımlanan karşılık gelen iki bölgede (C). Mitoz sırasında Baz::GFP, nöroblastın apikal kutbunda geçici olarak zenginleşir ve karşı bazal kutuptan tükenir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: Canlı görüntüleme sırasında bir inhibitör eklemek için hareketsiz larva beyinlerine medya değişimi uygulaması, Şekil 6'dasunulan ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 2: Canlı görüntüleme sırasında bir inhibitör eklemek için hareketsiz yumurta odalarına medya değişimi uygulaması, Şekil 7'desunulan ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 3: MultiHyperStackReg kullanılarak yanal ve odak sürüklenmesinin düzeltilmesi. Membran probu PH::GFP'yi ifade eden bir nöroblastın canlı görüntülenmesi. Xy: tek odak düzlemi. Xz: ortogonal reslice. Sol: sürüklenmenin düzeltilmesinden önce. Orta: yanal sürüklenmenin düzeltilmesinden sonra. Sağ: Yanal ve odak sürüklenmesini düzeltdikten sonra, ölçek çubuğu: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 4: Şekil 8,ölçek çubuğu: 5 μm'de sunulan dönen çizgikanlar kullanılarak korteksin algılanmasını, <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">lütfen bu videoyu indirmek için buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Görüntülenmiş Drosophila dokularının genotipleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 2: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Kodlama Dosyası 1: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Kodlama Dosyası 2: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Kodlama Dosyası 3: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Bu protokol, Fibrin pıhtıları kullanılarak numune hareketsizleştirme uygulamalarını açıklar, sürüklenmeyi sınırlar ve canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesine ve yıkanmasına izin verir. Örnekler, bir kapak parçasının yüzeyinde kültür ortamı içeren bir fibrinojen damlasına aktarılır, daha sonra trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Görüntüleme.  University of Dundee. Bu protokol, Fibrin pıhtıları kullanılarak numune hareketsizleştirme uygulamalarını açıklar, sürüklenmeyi sınırlar ve canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesine ve yıkanmasına izin verir. Örnekler, bir kapak parçasının yüzeyinde kültür ortamı içeren bir fibrinojen damlasına aktarılır, daha sonra trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir.

Video: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Biyomühendislik

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biyoloji

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Nörobilim

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma

Canlı görselleştirme Drosophila Glial nöromüsküler Kavşağı

Hazırlanması Drosophila Embriyolar