Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (MCB 1021831, JM) ve J. &amp; E. Biyomedikal Araştırma Programı (Sağlık Florida Bölümü, JM) tarafından desteklenmiştir.

1.. Örnek Hazırlık <ol><li> Numune hazırlama ve istenmeyen uncaging önlemek için karanlık bir odada bütün numune manipülasyonlar yürütmek. </li><li> 50 mM HEPES içinde N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(oksi-karbonil) metil] -1,2-etandiamin) - (2-nitro-4 ,5-dimetoksi-fenil) - DM-nitrophen ((1 çözünürleştirilir tampon, 100 mM KCI, 400 uM&#39;lik nihai konsantrasyona kadar pH 7.0 (350m ε = 4330 M-1cm-1 9). </li><li> [DM-nitrophen]: [Ca2 +] arzu edilen bir oran elde etmek için 0.1 M stok çözeltiden CaCl 2 ekleyin. 10 uM &#39;den büyük Ca 2 + ilişkisi için Kd ile proteinleri için, [Ca2 +] oranı: 1:1 [DM-nitrophen] Uncaged DM-nitrophen fotoğraf-serbest Ca2 + bağlanmasını önlemek için tercih edilir, . Gerçekten de, bir kalsiyum bağlayıcı proteinin% 90 ~ 10 nM ve 400 mM olmak DM-nitrophen ve Ca2 + toplam konsantrasyonu olduğu DM-nitrophen için Kd değeri dikkate alınarakK d = 10 uM apoform olacaktır. Öte yandan, Kd &lt;10 uM olan proteinlere bağlanarak Ca 2 + çalışması için, bu, [Ca2 +] azaltmak için tercih edilir: Ca2 + kompleksleşmesini önlemek için 0.95 [DM-nitrophen] oranını apo- protein kafes fotoğraf ayrışma önce. </li><li> Referans bileşiği, K 3 çözünürleştirilir [Fe (III) (CN) 6], ya da numune ile aynı tampon maddesi içinde Na 2 CrO 4,. </li></ol> 2. Deney ayarlama <ol><li> Temel deneysel konfigürasyon Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. </li><li> 1 mm prob kirişin çapı (He-Ne lazerinin 632 nm çıkışı, ~ 5 mW lazer gücü) ayarlamak ve bir sıcaklığa yerleştirilmiş bir hücrenin merkezi aracılığıyla prob demeti yaymak için bir pim deliği (P 2) kullanarak Bir M 1 ayna kullanarak hücre tutucu kontrollü. </li><li> Sonda kiriş ortalamak için örnek arkasına bir ayna (2 M) kullanarakpozisyon duyarlı dedektör merkezi üzerinde. </li><li> En iyi iki diyotlar ve alt iki diyot gibi, dedektörün sağ ve sol tarafında, iki diyot arasındaki voltaj farkı arasındaki gerilim farkıdır ki bu şekilde detektör ortasına sonda kiriş Odak sıfır. </li><li> YAG lazer FWHM 5 nsn) ile nano iki 355 nm lazer ayna arasına yerleştirilmiş bir 3 mm iğne deliği (P 1) kullanılarak: Daha sonra, pompa demetinin çapı, Q-anahtarlı Nd bir 355 nm çıkış şekli. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi küvet merkezinden pompa ışını Copropagate. Her iki lazer ışınları, ölçülebilir bir sapma açısı ve PBD sinyalin böylece yüksek amplitüdü elde etmek için, yaklaşık eş doğrusal bir şekilde optik hücrenin merkezine doğru yayılır önemlidir. Deneysel koşullar altında, prob ve pompa kiriş kesişme açısı en az 15 ° &#39;dir. </li><li> Prob ve pompayı hizalamak için bir referans bileşik kullanınuzun zaman ölçeklerinde (~ 100 msn) üzerinde iyi bir S / N oranı ve istikrarlı PBD genlik, yani tatmin edici bir PBD sinyal elde etmek için ışın. </li><li> 355 nm lazer aynası artımlı ayarlanması ile prob huzmesine nisbetle pompa kirişin konumunu ayarlayın. </li><li> Pozisyon hassas detektörü, iki üst ve alt fotodiyotlar arasında bir fark olarak PBD referans sinyalinin genliğini ölçün. PBD sinyali hızlı bir zaman ölçekli (&lt;10 mikro-saniye) üzerinde genlik hızlı bir artış gösterir ve Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi, 100 milisaniye ölçeğinde stabil kalmalıdır. PDB genlik vurdu değişkenliği atış sinyal genliğinin% 5 içinde ve sinyal uyarlık esas titreşimlerden etkilenir. </li><li> Emilen uyarım lazer gücü ve Einsteins sayısına PBD sinyalinin doğrusal bağımlılığı, E a ölçerek çıkan ısı enerjisi ile ilgili olarak PBD sinyal amplitüdünün doğrusallığını kontrol= A uyarım dalga boyunda, referans absorbans karşılık gelen (1-10-A). </li><li> Lazer gücü altında, yaklaşık 1000 μJ ve multiphoton emme ve sırasıyla pompa ışını güç azalmayı önlemek için uyarım dalga boyu en az 0.5 &#39;de örnek / referans bileşiği absorbans tutun ve PBD sinyalinin doğrusallığını sağlar. </li></ol> 3. PBD Ölçümler <ol><li> Referans için PBD izlerin ölçümü ile başlayın. Bir 1.0 cm x 1.0 cm ve 1.0 cm x 0.5 cm kuvars hücrede referans bileşiği çözeltisi yerleştirin ve ısı kontrollü tutucu hücreyi yerleştirin. Her iki yol uzunlukları karşılaştırılabilir PBD genlik sağlar. </li><li> 3 ° C sıcaklık artışı ile 16-35 ° C sıcaklık aralığı içinde, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak referans PBD sinyalini algılar </li><li> Her sıcaklık değişimi üzerine, pozisyon duyarlı dedektör prob ışınının pozisyonunu kontrol edin ve yenidenGerekirse, dedektörün merkezine konumunu ayarlamak. </li><li> Denklem 2&#39;ye göre bir fonksiyonu olarak [(dn / dt) / C p ρ] terimi PBD sinyalinin doğrusallığını kontrol edin. </li><li> Referans ölçümü için optik hücrenin aynı yönde tutmak referans bileşiği için olan ile aynı optik hücre içindeki örnek çözeltisi yerleştirin. </li><li> Referans için aynı sıcaklık aralığında, örnek PBD izleri tespit eder ve [(dn / dt) / C p ρ] terimi ile ilgili olarak örnek PBD genlik doğrusallığını kontrol edin. </li></ol> 4. Veri Analizi Sapmanın büyüklüğü nedeniyle Denklem 1&#39;e göre numune ısıtma (ΔV inci) ve ısısal olmayan hacim değişikliği (ΔV nonth) için hacim değişikliği ile doğrudan orantılıdır: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> Numunenin (A S genliği) Ve referans (A r) PBD sinyal sırasıyla Denklemler 2 ve 3 kullanılarak tarif edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Denklem 3" /> PBD sinyali gösterge yanıt parametre (K) ile doğrudan orantılıdır ve Einsteins sayısının emilen (E a). Denklem 2&#39;de ilk terim, (dn / dt) (1/ρC p) Q, bağlı çözücü bırakılan ısı, sinyal değişiklik karşılık gelir. Dn / dt vadeli kırılma endeksinin sıcaklığa bağlı değişimi temsil, ρ çözücü yoğunluğu, C p ısı kapasitesi. Tüm parametreler, damıtılmış su ile tanınırlar ve damıtılmış su içinde ve uygun bir tamponda, referans bileşik için bir PBD sinyalinin karşılaştırılması ile bir tampon çözeltisi için belirlenebilir. Q ısı returne miktarıdırçözücüye d. Ρ (dn / d ρ) terimi, 10-40 ° C&#39;de 10 arasındaki sıcaklık aralığında, sıcaklık-bağımsız olan bir birim daha sabittir. Δn abs terimi nedeniyle çözeltide emici türlerin varlığı kırılma indeksi değişimine karşılık gelen ve sonda ışınının dalga boyu çözelti içinde herhangi bir türün absorpsiyon spektrumları göre kaydırılır eğer bulunuyor ihmal edilebilir. Referans bileşik (A r) kaynaklanan sinyal E h ν, uyarma dalga boyunda foton enerjisi Denklem 3 ile ifade edilir E h ν = 80.5 kcal / mol 355 nm uyarma için. <ol><li> Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi Ön tetikleme ve sonrası PBD tetikleme sinyali arasındaki fark olarak referans PBD sinyalinin genliğini al. Benzer bir şekilde, hızlı (A s hızlı) genliğini belirlemek ve yavaş faz (A s yavaş) Numune PBD sinyalinin. </li><li> , Alet tepki parametresi K ortadan referans için PBD sinyalinin genliği ile numune PBD sinyalinin genliğini ölçeklemek için. Referans sinyalin numune sinyalinin oranı Denklem 4 verir ve benzeri gibi yazılabilir: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Denklem 4" /> </li><li> Bu denklemi kullanılarak, çözeltinin (Q) ve termal olmayan bir hacim değişikliği [bir arsa sırasıyla eğim ve kesişim noktası, bir foto-başlatılan reaksiyon ile bağlantılı (ΔV nonth) (A s / A r) E bırakılan ısıyı tespit h ν] sıcaklık bağımlı vadeli [(dn / dt) (1/ρCp)] karşı terim. </li><li> , Reaksiyon hacmi ve hızlı ve yavaş bir süreç için entalpi değişimlerini belirlemek Denklem 5-7 göre uygun kuantum verimi gözlenen hacim ve entalpi değişimi büyütmek için. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = &quot;Denklem 5&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Denklem 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Denklem 7" /> Kinetik 10 mikro saniye olduğu ~ 200 milisaniye arasındaki bir zaman ölçeğinde meydana gelen bir çok aşamalı bir işlem için, hacmi ve reaksiyonun tek tek adımlarla bağlantılı entalpi değişiklikleri tespit edilebilir. Tek tek aşamalar için yayılmalar ve yaşam süreleri hacmi ve entalpi değişiklikleri zaman profilini açıklayan fonksiyon f (t) için veri uyması yolu ile analiz edilir. <img alt="Denklem 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> α 0 A s, hızlı karşılık gelir ve bir s yavaş her bir işlem için karşılık gelen ve α τ burada i bireysel reaksiyon adımlarının ömrü vardır. Fo oranı sabitinin sıcaklık bağımlılığındanr süreçleri tek tek aktivasyon entalpi ve entropi parametreler kolaylıkla Eyring araziler kullanılarak belirlenebilir (i i = 1 / τ k). </li></ol>

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Fototermal yöntemleri geride fiziksel prensibi bir fotoğraf heyecanlı molekülü çevreleyen çözücü 1,12 termal ısıtma sonuçlanan, zemin durumuna titreşim rahatlama yoluyla fazla enerjiyi dağıtacağını olmasıdır. Örneğin su gibi çözücü maddeler, bu hızlı bir hacim genişlemesi (ΔV th) üretir. Uyarılmış hal moleküller de bağlı bağı kırma / formasyonu ve / veya molekül (ler) i (van der yani değişiklikler moleküler boyutları değiştirebilir molekül y...

Böyle foto akustik kalorimetrisine, fototermal ışın saptırma (PDB) ve nanosaniye lazer uyarma ile birlikte geçici mazgal gibi foto-termal yöntemler kısa ömürlü ara 1,2 zaman çözüme çalışmaları için optik spectroscopiesle geçici güçlü bir alternatif temsil eder. Bu tür geçici emme ve IR spektroskopisi gibi optik teknikler, aksine, bu çevreleyen kromofor soğurma değişimlerin zaman profilini izlemek, fototermal teknikleri optik zaman profilleri araştırılması için değerli araçlar ısı / hacim değişikliklerini gösteren bir zaman-bağımlılığı tespit etmek ve bu nedenle &quot;sessiz&quot; süreçleri. Şimdiye kadar, foto akustik kalorimetri ve geçici ızgara başarılı globinlerine 3,4, oksijen sensörü protein ile ligand etkileşimlerine atomlu ligand göçü de dahil olmak üzere foto-neden olduğu işlemlerin yapısal dinamiklerini incelemek için uygulanmış FixL 5, 6 oksidazlar elektron ve hem-bakır proton nakliye Birnd fotosistem II olarak rodopsin 7 ve 8 kriptokrom konformasyonel dinamiğinde verilmedi-izomerizasyon. Bir iç kromofor ve / veya flüorofor eksik biyolojik sistemlere fototermal tekniklerinin kullanılmasını genişletmek için, PBD teknik olarak, foto-tetikleyiciye kafesli bileşiğinin kullanılması birkaç mikrosaniye olan ligand / alt-tabaka konsantrasyonunda bir artış ile ya da daha hızlı birleştirildi kafesli bileşik üzerinde. Bu yaklaşım sağlar ligand / substrat bir iç flüoroforu veya kromofora eksik olan proteinler ve ticari stop akış araçlar tarafından erişilebilir olmayan zaman-ölçeğinde bağlama ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjilerin izlenmesi. Burada kafes bileşiğin, Ca 2 + termodinamik DM-nitrophen, foto-yarılma hem de nöronal kalsiyum sensörünün C-terminal alanına Ca2 + Birliği için kinetik aşağı izlemek için PBD bir uygulamadere Düzenleyici Eleman rakip Modülatör (DÜŞ) sunulmuştur. Ca 2 + 10 mikro-saniye içinde foto-serbest Ca 2 + DM-nitrophen ve ~ 300 mikro saniye bir zaman sabiti ile bir unphotolysed kafesine rebinds. Diğer taraftan, apoDREAM mevcudiyetinde milisaniye ölçekte oluşan ek bir kinetik gözlenen ve proteine ​​bağlanma ligandı yansıtmaktadır. Biyolojik sistemlerde konformasyonel geçişler araştırmak üzere PBD uygulama bir şekilde etkili zorluklar nedeniyle sınırlıdır; güçlü ve yeniden üretilebilir bir PBD sinyal elde etmek için prob ve pompa ışınının, örneğin zorlu bir hizalama. Ancak, alet set-up titiz bir tasarım, sıcaklığın bir hassas kontrolü, ve prob ve pompa ışın dikkatli bir hizalama geniş bir zaman içinde çözünen hacmi ve entalpi değişiklikleri izlenmesine olanak sağlar tutarlı ve sağlam PBD sinyalini sağlamak 10 mikro saniye olduğu yaklaşık 200 msn den zaman ölçeği. Buna ek olarak, modific Invb aynı sıcaklık, tampon bileşimi, optik hücre yönelim, lazer gücü altında örnek ve referans izleri tespit sağlamak için deneysel işlemin ations anlamlı ölçülen reaksiyon hacimleri ve entalpilerinin yılında deneysel hatayı azaltır.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#039;,N&amp;#039;&lt;/em&gt;-Tetraacetic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(2-Hydroxyethyl)piperazine-&lt;em&gt;N&amp;prime;&lt;/em&gt;-(2-ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>HEPES buffer</td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>reference compound for PBD measurements</td></tr><tr><td>Sodium chromate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>reference compound for PBD measurements</td></tr><tr><td>He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>use as a probe beam for PBD measurements</td></tr><tr><td>Oscilloscope,&amp;nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz bandwith</td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>pump beam for PBD measurements</td></tr><tr><td>M&lt;sub&gt;355&lt;/sub&gt;; Nd:YAG laser mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>laser mirror for 355 nm laser line</td></tr><tr><td>M&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; and M&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Laser diode mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td></tr><tr><td>P&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; and P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Iris Diaphragm</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>pin hole to shape the probe and pum beams</td></tr><tr><td>L&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;; bi-convex lens</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm</td></tr><tr><td>DM, dichroic mirror</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td></tr><tr><td>F&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;; Edge filter</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td></tr><tr><td>Temperature-controlled cuvette holder</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Birlikte fotoğraf-akustik kalorimetrisinden ve termal mazgal Fototermal ışın saptırma geleneksel Dur kullanarak erişilebilir değil zaman ölçekler milisaniye mikrosaniye proteinlerin yapısal değişimlere neden ışığın zaman profil hacim ve entalpi değişimleri izlemek fototermal yöntemleri ailesine ait -akış aletleri. Hacim ve / veya genel entalpi değişiklikleri sondalandı Ek olarak, bu teknikler, bir florofor ve bir kromofor veya etiket protein eksikliği ve diğer biomacromolecules uygulanabilir. Ca 2 ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjikliğin izlemek için + kalsiyum dönüştürücüler gibi nöronal kalsiyum sensörler, kafesli bir kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen, fotoğraf-tetik serbest kalsiyum hızlı bir (τ &lt;20 mikro-saniye) artışı istihdam edilmektedir bağlanma konsantrasyon ve bununla bağlantılı ve entalpi değişiklikleri fototermal ışın saptırma tekniği kullanılarak sondalandı.

PBD temsili bir örneği, Ca 2 + DM-nitrophen Ca 2 + verilmedi-serbest bırakılması için izleri, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Yavaş faz Ca 2 + nonphotolysed kafese bağlanmasını gösterir ise, hızlı faz, Ca 2 + DM-nitrophen ve Ca 2 + kurtuluş foto-bölünmeye karşı gelmektedir. Sıcaklık bağlı faktör [C p ρ / (dn / dt)] bir fonksiyonu olarak referans bileşiğinin genliğine ölçekli hızlı ve yavaş bir faz için ...

Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

Proteinlerdeki Milisaniyenin Altındaki Konformasyonel Değişiklikler Fototermal Işın Sapması ile Çözüldü | Kimya | Video

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Burada mikrosaniye ve milisaniyelik dinamikleri ve nöronal kalsiyum sensör, aşağı akış düzenleyici öğe Antagonist modülatörüne kalsiyum bağlanma kapasitesi ile bağlandığı yapısal değişikliklerin enerjileri izlemek için bir kafesli kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen ile kombinasyon halinde fototermal ışın saptırma tekniğin bir uygulama rapor .

Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Physics

Fundamentals

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Görüntüleme.  Florida International University.  Burada mikrosaniye ve milisaniyelik dinamikleri ve nöronal kalsiyum sensör, aşağı akış düzenleyici öğe Antagonist modülatörüne kalsiyum bağlanma kapasitesi ile bağlandığı yapısal değişikliklerin enerjileri izlemek için bir kafesli kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen ile kombinasyon halinde fototermal ışın saptırma tekniğin bir uygulama rapor . 

Video: Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold molecular beams. However, these beams often contain multiple conformers and clusters, even at low rotational temperatures. We present an experimental methodology that allows the spatial separation of these constituent parts of a molecular beam expansion. Using an electric deflector the beam is separated by its mass-to-dipole moment ratio, analogous to a bender or an electric sector mass spectrometer spatially dispersing charged molecules on the basis of their mass-to-charge ratio. This deflector exploits the Stark effect in an inhomogeneous electric field and allows the separation of individual species of polar neutral molecules and clusters. It furthermore allows the selection of the coldest part of a molecular beam, as low-energy rotational quantum states generally experience the largest deflection. Different structural isomers (conformers) of a species can be separated due to the different arrangement of functional groups, which leads to distinct dipole moments. These are exploited by the electrostatic deflector for the production of a conformationally pure sample from a molecular beam. Similarly, specific cluster stoichiometries can be selected, as the mass and dipole moment of a given cluster depends on the degree of solvation around the parent molecule. This allows experiments on specific cluster sizes and structures, enabling the systematic study of solvation of neutral molecules.

We present a technique that allows the spatial separation of different conformers or clusters present in a molecular beam. An electrostatic deflector is used to separate species by their mass-to-dipole moment ratio, leading to the production of gas-phase ensembles of a single conformer or cluster stoichiometry.

Moleküler Konformatörlerin ve Kümelerin Mekansal Ayrımı

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Mühendislik

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards understanding its mechanism. Protonation and conformational changes affect the vibration pattern of amino acid side chains and of the peptide bond, respectively, both of which can be probed by infrared (IR) difference spectroscopy. For proteins whose function can be repetitively and reproducibly triggered by light, it is possible to obtain infrared difference spectra with (sub)microsecond resolution over a broad spectral range using the step-scan Fourier transform infrared technique. With ~102-103 repetitions of the photoreaction, the minimum number to complete a scan at reasonable spectral resolution and bandwidth, the noise level in the absorption difference spectra can be as low as ~10-4, sufficient to follow the kinetics of protonation changes from a single amino acid. Lower noise levels can be accomplished by more data averaging and/or mathematical processing. The amount of protein required for optimal results is between 5-100 &#181;g, depending on the sampling technique used. Regarding additional requirements, the protein needs to be first concentrated in a low ionic strength buffer and then dried to form a film. The protein film is hydrated prior to the experiment, either with little droplets of water or under controlled atmospheric humidity. The attained hydration level (g of water / g of protein) is gauged from an IR absorption spectrum. To showcase the technique, we studied the photocycle of the light-driven proton-pump bacteriorhodopsin in its native purple membrane environment, and of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 solubilized in detergent.

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

Tarafından Işığa Proteinler Proton Transferi ve Protein Konformasyon Dynamics Zamanda çözülmüş kızılötesi spektroskopi Fourier-dönüşümü Step-tarama

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

Direct Imaging of Laser-driven Ultrafast Molecular Rotation

We present a method for visualizing laser-induced, ultrafast molecular rotational wave packet dynamics. We have developed a new 2-dimensional Coulomb explosion imaging setup in which a hitherto-impractical camera angle is realized. In our imaging technique, diatomic molecules are irradiated with a circularly polarized strong laser pulse. The ejected atomic ions are accelerated perpendicularly to the laser propagation. The ions lying in the laser polarization plane are selected through the use of a mechanical slit and imaged with a high-throughput, 2-dimensional detector installed parallel to the polarization plane. Because a circularly polarized (isotropic) Coulomb exploding pulse is used, the observed angular distribution of the ejected ions directly corresponds to the squared rotational wave function at the time of the pulse irradiation. To create a real-time movie of molecular rotation, the present imaging technique is combined with a femtosecond pump-probe optical setup in which the pump pulses create unidirectionally rotating molecular ensembles. Due to the high image throughput of our detection system, the pump-probe experimental condition can be easily optimized by monitoring a real-time snapshot. As a result, the quality of the observed movie is sufficiently high for visualizing the detailed wave nature of motion. We also note that the present technique can be implemented in existing standard ion imaging setups, offering a new camera angle or viewpoint for the molecular systems without the need for extensive modification.

We present a protocol for creating a real-time movie of a molecular rotational wave packet using a high-resolution Coulomb explosion imaging setup.

Lazer güdümlü Ultrafast Moleküler Rotasyon Doğrudan Görüntüleme

We present a method for visualizing laser-induced, ultrafast molecular rotational wave packet dynamics. We have developed a new 2-dimensional Coulomb ...

Kimya

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Yapısal Photoresponsive sıvı kristaller dinamikleri gözlemlemek için yeni teknikleri

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is presented with detailed step-by-step instructions, figures, and videos for smooth data collection.

We present a comprehensive guide to fixed target sample preparation, data collection, and data processing for serial synchrotron crystallography at Diamond beamline I24.

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Biyokimya

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Monitoring Conformational Dynamics of Single Unmodified Proteins using Plasmonic Nanotweezers

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes can alter protein biophysics and reduce the usefulness of the data acquired. Plasmonic nanotweezers is a technique that uses localized surface plasmon resonance (LSPR) on gold nanostructures to enhance the electric field within a confined hotspot region. This field enhancement allows for the use of low laser powers to trap single nanoparticles far smaller than conventional optical tweezers, down to only a few nanometers in diameter, such as single proteins. Trapping of single protein molecules within the hotspot region induces a shift in the local refractive index (nprotein &#62; nwater), altering light scattering as a product of the molecule&#39;s polarisability, which is affected by its volume, shape anisotropy, and refractive index. An avalanche photodiode (APD) collects the subsequent changes in light scattering. These alterations can then be analyzed to determine changes in the trapped molecule, including its size, global conformation, and dynamics of conformational change over time. The incorporation of microfluidics within the system allows for controlled environmental changes and real-time monitoring of their subsequent effects on the molecule. In this protocol, we demonstrate the steps to trap single protein molecules, alter their environmental solution conditions, and monitor their corresponding conformational changes using a plasmonic nanotweezers system.

Plasmonic nanotweezers use localized surface plasmon resonance in gold nanostructures to trap single nanoparticles, including proteins, within a nanometer-scale optical field. Changes in the scattered signal reveal protein presence and conformational dynamics, enabling monitoring without fluorophore modifications or surface tethering.

Plazmonik Nanotcımbız Kullanarak Tek Değiştirilmemiş Proteinlerin Konformasyonel Dinamiğinin İzlenmesi

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...