Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (MCB 1021831, JM) und J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM) unterstützt.

1. Probenvorbereitungen <ol><li> Führen Sie die Probenvorbereitung und Proben alle Manipulationen in einem dunklen Raum eine unerwünschte Uncaging verhindern. </li><li> Solubilisierung DM-Nitrophen ((1 - (2-Nitro-4 ,5-dimethoxyphenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-Tetrakis [(oxy-carbonyl)-methyl] -1,2-ethandiamin) in 50 mM HEPES Puffer, 100 mM KCl, pH 7,0, auf eine Endkonzentration von 400 &amp;mgr; m (350 nm ε = 4330 M -1 cm -1, 9). </li><li> In CaCl 2 aus dem 0,1 M Stammlösung, um eine gewünschte Verhältnis von [Ca 2 +] zu erreichen: [DM-Nitrophen]. Für Proteine ​​mit Kd für Ca 2 + Verband mehr als 10 um, das Verhältnis von [Ca 2 +]: ist [DM-Nitrophen] von 1:1 bevorzugt, verhindern die Bindung von Photo freigegeben Ca 2 + zu uncaged DM-Nitrophen . Tatsächlich, unter Berücksichtigung der K d-Wert für DM-Nitrophen bis 10 nm und die Gesamtkonzentration der DM-Nitrophen und Ca 2 + zu 400 mm betragen, ~ 90% eines Calcium-bindenden ProteinsK d = 10 &amp;mgr; M wird in der apoform sein. Auf der anderen Seite, für das Studium der Ca 2 +-bindende Proteine ​​mit K d &lt;10 &amp;mgr; m, ist es bevorzugt, die [Ca 2 +] i zu verringern: [DM-Nitrophen]-Verhältnis 0,95 zu Ca 2 + Komplexierung mit dem verhindert Apo- Protein vor dem Käfig Foto-Dissoziation. </li><li> Solubilisierung des Referenzverbindung, K 3 [Fe (III) (CN) 6] oder Na 2 CrO 4, in dem gleichen Puffer wie für die Probe. </li></ol> 2. Einrichten des Experiment <ol><li> Die grundlegende experimentelle Aufbau ist in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Verwenden ein Nadelloch (P 2), um den Durchmesser des Sondenstrahls (632 nm Ausgang des He-Ne-Laser, ~ 5 mW Laserleistung) bis 1 mm einzustellen und Propagation der Sondenstrahl durch die Mitte einer Zelle in einem Temperatur platziert kontrollierten Zellhalter mit einem M ein Spiegel. </li><li> Verwenden einen Spiegel (M 2) hinter der Probe, um die Sondenstrahlmitteauf ein Zentrum der positionsempfindlichen Detektor. </li><li> Fokussieren des Sondenstrahls auf die Mitte des Detektors in einer solchen Weise, dass die Differenz in der Spannung zwischen den beiden oberen und unteren zwei Dioden Dioden sowie den Unterschied in der Spannung zwischen den zwei Dioden auf der linken und rechten Seite des Detektors Null. </li><li> Anschließend Form einen Durchmesser des Pumpstrahls, eine 355 nm Ausgang des Q-switched Nd: YAG-Laser, Halbwertsbreite 5 ns) mit einem 3 mm Lochblende (P 1) zwischen zwei 355 nm Laserspiegeln angeordnet. </li><li> Copropagate den Pumpstrahl durch das Zentrum der Küvette, wie in Fig. 2 gezeigt. Es ist wichtig, dass beide Laserstrahlen werden durch die Mitte der optischen Zelle in fast kolinearen Weise vermehrt, um eine messbare Ablenkwinkel und damit eine hohe Amplitude der PBD-Signal zu erhalten. Unter Versuchsbedingungen, der Winkel der Schnittpunkt der Sonde und der Pumpstrahlen weniger als 15 °. </li><li> Verwenden Sie eine Referenzverbindung, um die Sonde und Pumpe ausrichtenStrahls, um ein zufriedenstell PBD Signal zu erreichen, dh einen guten S / N-Verhältnis und stabile PBD Amplitude auf längeren Zeitskalen (~ 100 ms). </li><li> Einstellen der Position des Pumpstrahls in Bezug auf den Sondenstrahl durch eine schrittweise Einstellung von 355 nm Laserspiegel. </li><li> Messung der Amplitude des PBD Referenzsignal als eine Differenz zwischen zwei oberen und unteren Photodioden auf dem positionsempfindlichen Detektor. Das PBD Signal sollte eine rasche Zunahme in der Amplitude auf einem schnellen Zeitskala (&lt;10 &amp;mgr; s) aufweisen und bleiben auf 100 ms Zeitrahmen stabil wie in Fig. 3 gezeigt. Der Schuss zu Schuss Variabilität des HVE Amplitude innerhalb von 5% der Signalamplitude und der Signal Reproduzierbarkeit wird hauptsächlich durch Schwingungen beeinflusst. </li><li> Überprüfen Sie die Linearität in der PBD Signalamplitude in Bezug auf die Freigabe von Wärmeenergie durch Messen der linearen Abhängigkeit der PBD-Signal von der Anregungslaserleistung und der Anzahl von Einst absorbiert, E a= (1-10 A), wobei A dem Referenz Absorption bei der Anregungswellenlänge. </li><li> Halten der Laserleistung unter etwa 1,000 &amp;mgr; J und Absorption der Probe / Referenzverbindung bei der Anregungswellenlänge von weniger als 0,5 auf Mehrphotonenabsorption und Verringerung der Pumpstrahlleistung bzw. zu verhindern und sicherzustellen, Linearität der PBD-Signal. </li></ol> 3. PBD Messungen <ol><li> Beginnen Sie mit der Messung der PBD Spuren für den Hinweis. Legen Sie die Lösung der Referenzverbindung in einem 1,0 cm x 1,0 cm oder 1,0 cm x 0,5 cm Quarzzelle und die Position der Zelle in der Temperatur gesteuert Halter. Beide Weglängen vergleichbare PBD Amplitude. </li><li> Erfassen die PBD Referenzsignals als eine Funktion der Temperatur in dem Temperaturbereich von 16 bis 35 ° C mit der Temperaturerhöhung von 3 ° C </li><li> Bei jeder Temperaturänderung, überprüfen Sie die Position der Sonde Strahl auf dem positionsempfindlichen Detektor und neuEinstellen der Position in der Mitte des Detektors, wenn nötig. </li><li> Überprüfen Sie die Linearität des PBD Signal als Funktion der [(dn / dt) / C p ρ] Begriff gemäß Gleichung 2. </li><li> Platzieren der Probenlösung in der gleichen optischen Zelle für die Referenzverbindung halten die gleiche Orientierung der optischen Zelle für die Referenzmessung. </li><li> Erkennen Sie die Beispiel PBD Spuren im gleichen Temperaturbereich wie für die Referenz und überprüfen Sie die Linearität der Probe PBD Amplitude in Bezug auf den [(dn / dt) / C p ρ] Begriff. </li></ol> 4. Datenanalyse Die Größe der Auslenkung direkt proportional zum Volumenänderung aufgrund der Erwärmung der Probe (&amp;Dgr; V th) und nicht-thermische Volumenänderung (&amp;Dgr; V nonth) gemäß Gleichung 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> Die Amplitude der Probe (A S) Und Referenz-(A r) PBD-Signal kann unter Verwendung der Gleichungen 2 bzw. 3 beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Gleichung 3" /> PBD-Signal ist direkt proportional zu der Instrumentenantwortparameter (K) und die Anzahl der Einst absorbiert (E a). Der erste Term in Gleichung 2 (dn / dt) (1/ρC p) Q, entspricht der Signaländerung aufgrund der Wärme zu dem Lösungsmittel befreit. Die dn / dt Term stellt die temperaturabhängige Änderung des Brechungsindex, ist ρ die Dichte des Lösungsmittels ist, C p die Wärmekapazität. Alle Parameter werden für das destillierte Wasser bekannt und kann für eine Pufferlösung, indem eine PBD Signal für die Referenzverbindung in destilliertem Wasser und in einem geeigneten Puffer bestimmt. Q die Wärmemenge returned zu dem Lösungsmittel. Die ρ (dn / d ρ) Begriff ist eine Einheit lose Konstante, die temperaturunabhängig ist im Temperaturbereich von 10-40 ° C 10. &amp;Dgr; N abs Term entspricht der Änderung des Brechungsindex aufgrund der Anwesenheit von absorbierenden Spezies in der Lösung, und es ist unerheblich, ob die Wellenlänge des Meßstrahls relativ zu den Absorptionsspektren jeder Spezies in der Lösung verschoben ist. Das Signal aus der Vergleichsverbindung (A r) wird durch Gleichung 3 wobei E h ν ist die Photonenenergie bei der Anregungswellenlänge, ausgedrückt E h ν = 80,5 kcal / mol für 355 nm-Anregung. <ol><li> Nehmen Sie die Amplitude des Referenzsignals PBD als die Differenz zwischen dem Pre-Trigger-und Post-Trigger-PBD-Signal wie in Abbildung 3 gezeigt. In ähnlicher Weise, bestimmen die Amplitude der schnellen (A s schnell) und langsamen Phase (A s langsam) Der Probe PBD-Signal. </li><li> Um die Antwortparameter Instrument, K eliminieren, skaliert die Amplitude der Probe PBD Signal mit der Amplitude des PBD-Signal für den Referenz. Das Verhältnis des Probensignals mit dem Referenzsignal ergibt Gleichung 4 und kann geschrieben werden als: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Gleichung 4" /> </li><li> Unter Verwendung dieser Gleichung bestimmen die Wärme an die Lösung (Q) und nicht-thermischen Volumenänderung (AV nonth) mit einem Foto-initiierte Reaktion von der Steigung und Achsenabschnitt jeweils von einem Grundstück von [assoziiert (A s / A r) E veröffentlicht h ν] tige Abhängigkeit von der Temperatur abhängige Term [(dn / dt) (1/ρCp)]. </li><li> Zur Bestimmung des Reaktionsvolumens und Enthalpieänderung für die schnelle und die langsame Verfahren skalieren Beobachtungsvolumen und Enthalpieänderung dem entsprechenden Quantenausbeute nach den Gleichungen 5-7. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = &quot;Gleichung 5&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Gleichung 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Gleichung 7" /> Für einen mehrstufigen Prozeß mit Kinetik auf der Zeitskala zwischen 10 usec ~ 200 ms auftritt, kann das Volumen und die Enthalpie Veränderungen bei den einzelnen Reaktionsschritten zugeordnet ermittelt werden. Die Amplituden und Laufzeiten der einzelnen Schritte werden durch Anpassung der Daten an die Funktion F (t), die den zeitlichen Verlauf des Volumenänderungen und Enthalpie beschreibt, analysiert. <img alt="Gleichung 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> wobei α 0 der A s schnell und α i entspricht einem s langsam für jeden einzelnen Prozess und τ i ist die Lebensdauer der einzelnen Reaktionsschritte. Aus der Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante for einzelne Prozesse (k i = 1 / τ i) die Aktivierung und-entropie Parameter können leicht unter Verwendung Eyring-Plots. </li></ol>

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	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das physikalische Prinzip hinter photothermischen Verfahren ist, dass ein Foto-angeregten Molekül leitet überschüssige Energie über Schwingungsrelaxation in den Grundzustand, was zu einer thermischen Erwärmung des umgebenden Lösungsmittel 1,12. Für Lösungsmittel, wie Wasser, ergibt sich eine schnelle Volumenexpansion (&amp;Dgr; V th). Excited-State-Moleküle können auch photochemische Prozesse, die in nicht-thermische Volumenänderungen (AV nonth) führen durch Bindungsspaltung ...

Foto-thermischen Methoden wie photoakustische Kalorimetrie, photothermischen Strahlablenkung (PDB) und transiente Gitter verbunden mit Nanosekunden-Laseranregung stellen eine leistungsstarke Alternative zu optischen Spektroskopie für die zeitaufgelöste Untersuchungen von kurzlebigen Zwischenprodukte 1,2 vorübergehend. Im Gegensatz zu optischen Techniken, wie transiente Absorption und IR-Spektroskopie, daß der zeitliche Verlauf der Absorptionsänderungen in dem Chromophor Umgebung zu überwachen; photothermische Techniken erfassen die Zeitabhängigkeit der Wärme-/ Volumenänderungen und sind daher wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung von Zeitverläufen von optisch &quot;stille&quot; Prozesse. Bisher hat photoakustische Kalorimetrie und vorübergehende Gitter erfolgreich angewendet, um Konformationsdynamik der photoinduzierten Prozesse, einschließlich zweiatomigen Liganden Migration in Globinen 3,4, Liganden-Interaktionen mit Sauerstoff-Sensor-Protein studieren FixL 5, Elektronen-und Protonentransport in Häm-Kupfer-Oxidasen 6 einnd Photosystem II sowie Foto-Isomerisierung in Rhodopsin 7 und Konformationsdynamik von Cryptochrom 8. Die Anwendung der photothermischen Verfahren auf biologische Systeme, fehlt eine interne Chromophor und / oder Fluorophor zu erweitern wurde der PBD-Technik unter Verwendung der photoaktivierbaren Verbindung zur Photo zu einem Anstieg der Ligand / Substrat-Konzentration innerhalb von wenigen Mikrosekunden oder schneller kombiniert, je auf dem Käfig Verbindung. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung von Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit der Ligand / Substrat-Bindung an Proteine, die fehlt, ist eine interne Fluorophor oder Chromophor sind und auf Zeitskala, die nicht von kommerziellen Stop-Flow-Instrumente zugänglich sind verbunden. Hier ist ein Einsatz von PBD die Thermodynamik der Käfigverbindung, Ca 2 + DM-Nitrophen Photospaltung sowie die Kinetik der Ca 2 +-Assoziation mit dem C-terminalen Domäne des neuronalen Kalziumsensor überwachen untenStrom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wird vorgestellt. Die Ca 2 +-Foto veröffentlicht von Ca 2 + DM-Nitrophen innerhalb von 10 Mikrosekunden und erneuten Bindungen zu einer unphotolysed Käfig mit einer Zeitkonstante von ~ 300 us. Auf der anderen Seite, in Gegenwart apoDREAM eine zusätzliche kinetische auf der Millisekunden-Zeitskala auftritt, beobachtet und reflektiert die Ligandenbindung an das Protein. Die Anwendung von PBD zu Konformationsänderungen in biologischen Systemen zu untersuchen wurde irgendwie durch den instrumentalen Schwierigkeiten beschränkt, zB beschwerliche Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl, eine starke und reproduzierbare PBD-Signal zu erreichen. , Eine sorgfältige Gestaltung eines Instrumentenaufbau, eine präzise Steuerung der Temperatur und eine sorgfältige Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl bieten jedoch eine konsistente und robuste PBD-Signal, das die Überwachung der zeitaufgelösten Volumen-und Enthalpie-Änderungen können auf eine breite Zeitskala von 10 Mikrosekunden auf etwa 200 msec. Außerdem modificErwartungen über die experimentellen Verfahren, um die Detektion von Proben-und Referenzspuren unter identischen Temperatur, Pufferzusammensetzung, optische Zelle Orientierung, Laserleistung, usw. gewährleisten die experimentellen Fehler in der gemessenen Reaktionsvolumina und Enthalpien reduziert.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#039;,N&amp;#039;&lt;/em&gt;-Tetraacetic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(2-Hydroxyethyl)piperazine-&lt;em&gt;N&amp;prime;&lt;/em&gt;-(2-ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>HEPES buffer</td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>reference compound for PBD measurements</td></tr><tr><td>Sodium chromate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>reference compound for PBD measurements</td></tr><tr><td>He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>use as a probe beam for PBD measurements</td></tr><tr><td>Oscilloscope,&amp;nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz bandwith</td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>pump beam for PBD measurements</td></tr><tr><td>M&lt;sub&gt;355&lt;/sub&gt;; Nd:YAG laser mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>laser mirror for 355 nm laser line</td></tr><tr><td>M&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; and M&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Laser diode mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td></tr><tr><td>P&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; and P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Iris Diaphragm</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>pin hole to shape the probe and pum beams</td></tr><tr><td>L&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;; bi-convex lens</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm</td></tr><tr><td>DM, dichroic mirror</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td></tr><tr><td>F&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;; Edge filter</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td></tr><tr><td>Temperature-controlled cuvette holder</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

Photothermische Strahlablenkung zusammen mit photoakustischen Kalorimetrie und thermische Gitter gehört zu der Familie der photothermischen Methoden, die die Zeit-Profil Volumen und Enthalpie Veränderungen von Licht induzierten Konformationsänderungen in Proteinen auf Mikrosekunde bis zu Zeitskalen, die nicht zugänglich sind Millisekunden mit traditionellen Stop überwachen Flussinstrumenten. Da außerdem Gesamtänderungen und / oder die Enthalpie sondiert werden, diese Techniken zu Proteinen und anderen Biomakromolekülen, die einen Fluorophor oder ein Chromophor Markierung fehlen angewendet werden. Um Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen verbunden mit Ca 2 +-Bindung zu überwachen, um Kalzium Wandler, wie neuronale Calcium-Sensoren, einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen ist auf Foto-Abzug eine schnelle (τ &lt;20 us) Anstieg der freien Kalzium beschäftigt Konzentration und das zugehörige Volumen und Enthalpie Änderungen werden mit photothermischen Strahlablenkung Technik sondiert.

Ein repräsentatives Beispiel für PBD Spuren für Ca 2 + Foto-Freisetzung aus Ca 2 + DM-Nitrophen ist in Abbildung 3 dargestellt. Die schnelle Phase entspricht der Photospaltung von Ca 2 + DM-Nitrophen und Ca 2 +-Freisetzung, während die langsame Phase reflektiert Ca 2 +-Bindung an den nonphotolysed Käfig. Die Handlung der Probe PBD Amplitude für die auf die Amplitude der Referenzverbindung als Funktion der Temperatur abhängig Faktor [C p<...

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Submillisekunden-Konformationsänderungen in Proteinen, aufgelöst durch photothermische Strahlablenkung | Chemie | Video

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Eine Anwendung der photothermischen Strahlablenkung Technik in Kombination mit einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen zu Mikrosekunde und Millisekunde Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit dem Calcium-Verband zu einer neuronalen Kalziumsensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator verbunden überwachen Hier berichten wir .

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

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Serie: Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold molecular beams. However, these beams often contain multiple conformers and clusters, even at low rotational temperatures. We present an experimental methodology that allows the spatial separation of these constituent parts of a molecular beam expansion. Using an electric deflector the beam is separated by its mass-to-dipole moment ratio, analogous to a bender or an electric sector mass spectrometer spatially dispersing charged molecules on the basis of their mass-to-charge ratio. This deflector exploits the Stark effect in an inhomogeneous electric field and allows the separation of individual species of polar neutral molecules and clusters. It furthermore allows the selection of the coldest part of a molecular beam, as low-energy rotational quantum states generally experience the largest deflection. Different structural isomers (conformers) of a species can be separated due to the different arrangement of functional groups, which leads to distinct dipole moments. These are exploited by the electrostatic deflector for the production of a conformationally pure sample from a molecular beam. Similarly, specific cluster stoichiometries can be selected, as the mass and dipole moment of a given cluster depends on the degree of solvation around the parent molecule. This allows experiments on specific cluster sizes and structures, enabling the systematic study of solvation of neutral molecules.

We present a technique that allows the spatial separation of different conformers or clusters present in a molecular beam. An electrostatic deflector is used to separate species by their mass-to-dipole moment ratio, leading to the production of gas-phase ensembles of a single conformer or cluster stoichiometry.

Räumliche Trennung von molekularen Konformen und Clustern

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Forschung

Ingenieurwesen

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards understanding its mechanism. Protonation and conformational changes affect the vibration pattern of amino acid side chains and of the peptide bond, respectively, both of which can be probed by infrared (IR) difference spectroscopy. For proteins whose function can be repetitively and reproducibly triggered by light, it is possible to obtain infrared difference spectra with (sub)microsecond resolution over a broad spectral range using the step-scan Fourier transform infrared technique. With ~102-103 repetitions of the photoreaction, the minimum number to complete a scan at reasonable spectral resolution and bandwidth, the noise level in the absorption difference spectra can be as low as ~10-4, sufficient to follow the kinetics of protonation changes from a single amino acid. Lower noise levels can be accomplished by more data averaging and/or mathematical processing. The amount of protein required for optimal results is between 5-100 &#181;g, depending on the sampling technique used. Regarding additional requirements, the protein needs to be first concentrated in a low ionic strength buffer and then dried to form a film. The protein film is hydrated prior to the experiment, either with little droplets of water or under controlled atmospheric humidity. The attained hydration level (g of water / g of protein) is gauged from an IR absorption spectrum. To showcase the technique, we studied the photocycle of the light-driven proton-pump bacteriorhodopsin in its native purple membrane environment, and of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 solubilized in detergent.

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

Protonen-Transfer und Protein-Zustände Dynamics in Lichtempfindliche Proteine, die durch zeitaufgelöste Step-Scan Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

Direct Imaging of Laser-driven Ultrafast Molecular Rotation

We present a method for visualizing laser-induced, ultrafast molecular rotational wave packet dynamics. We have developed a new 2-dimensional Coulomb explosion imaging setup in which a hitherto-impractical camera angle is realized. In our imaging technique, diatomic molecules are irradiated with a circularly polarized strong laser pulse. The ejected atomic ions are accelerated perpendicularly to the laser propagation. The ions lying in the laser polarization plane are selected through the use of a mechanical slit and imaged with a high-throughput, 2-dimensional detector installed parallel to the polarization plane. Because a circularly polarized (isotropic) Coulomb exploding pulse is used, the observed angular distribution of the ejected ions directly corresponds to the squared rotational wave function at the time of the pulse irradiation. To create a real-time movie of molecular rotation, the present imaging technique is combined with a femtosecond pump-probe optical setup in which the pump pulses create unidirectionally rotating molecular ensembles. Due to the high image throughput of our detection system, the pump-probe experimental condition can be easily optimized by monitoring a real-time snapshot. As a result, the quality of the observed movie is sufficiently high for visualizing the detailed wave nature of motion. We also note that the present technique can be implemented in existing standard ion imaging setups, offering a new camera angle or viewpoint for the molecular systems without the need for extensive modification.

We present a protocol for creating a real-time movie of a molecular rotational wave packet using a high-resolution Coulomb explosion imaging setup.

Direct Imaging von lasergetriebenen Ultrakurz Molecular Rotation

We present a method for visualizing laser-induced, ultrafast molecular rotational wave packet dynamics. We have developed a new 2-dimensional Coulomb ...

Chemie

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Neuartige Techniken zur Beobachtung von Strukturdynamik von Photoresponsive Flüssigkristallen

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is presented with detailed step-by-step instructions, figures, and videos for smooth data collection.

We present a comprehensive guide to fixed target sample preparation, data collection, and data processing for serial synchrotron crystallography at Diamond beamline I24.

Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Biochemie

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Monitoring Conformational Dynamics of Single Unmodified Proteins using Plasmonic Nanotweezers

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes can alter protein biophysics and reduce the usefulness of the data acquired. Plasmonic nanotweezers is a technique that uses localized surface plasmon resonance (LSPR) on gold nanostructures to enhance the electric field within a confined hotspot region. This field enhancement allows for the use of low laser powers to trap single nanoparticles far smaller than conventional optical tweezers, down to only a few nanometers in diameter, such as single proteins. Trapping of single protein molecules within the hotspot region induces a shift in the local refractive index (nprotein &#62; nwater), altering light scattering as a product of the molecule&#39;s polarisability, which is affected by its volume, shape anisotropy, and refractive index. An avalanche photodiode (APD) collects the subsequent changes in light scattering. These alterations can then be analyzed to determine changes in the trapped molecule, including its size, global conformation, and dynamics of conformational change over time. The incorporation of microfluidics within the system allows for controlled environmental changes and real-time monitoring of their subsequent effects on the molecule. In this protocol, we demonstrate the steps to trap single protein molecules, alter their environmental solution conditions, and monitor their corresponding conformational changes using a plasmonic nanotweezers system.

Plasmonic nanotweezers use localized surface plasmon resonance in gold nanostructures to trap single nanoparticles, including proteins, within a nanometer-scale optical field. Changes in the scattered signal reveal protein presence and conformational dynamics, enabling monitoring without fluorophore modifications or surface tethering.

Überwachung der Konformationsdynamik einzelner unmodifizierter Proteine mit einer plasmonischen Nanopinzette

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...