이 작품은 국립 과학 재단 (MCB 1,021,831, JM)와 J. &amp; E. 바이오 메디컬 연구 프로그램 (건강의 플로리다학과, JM)에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비 <ol><li> 샘플 준비하고 원하지 않는 uncaging을 방지하기 위해 어두운 방에있는 모든 샘플 조작을 수행하십시오. </li><li> 50 mM의 HEPES에 N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 키스 [(옥시 카르 보닐) 메틸] -1,2 - 에탄 디아민) - (2 - 니트로 -4,5 - 디메 톡시 페닐) - DM-nitrophen ((1 가용화 버퍼, 100 ㎜의 KCl, 400 μM의 최종 농도로 pH를 7.0 (= 350 ㎚ ε 4,330 M -1 cm -1 9). </li><li> [DM-nitrophen] : [칼슘 2 +]의 바람직한 비율을 달성하기 위해 0.1 M 주식 솔루션에서 염화칼슘을 추가합니다. 10 μM보다 큰 칼슘 2 + 협회 K d의 단백질, [칼슘 2 +]의 비율 : 1:1 [DM-nitrophen는] uncaged DM-nitrophen에 사진 출시 칼슘 2 +의 바인딩을 방지하는 것이 바람직하다 . 사실, 칼슘의 90 %는 결합 단백질 ~ 10 ㎚ 및 400 ㎜로 DM-nitrophen 및 CA 2 +의 총 농도로 DM-nitrophen의 K의 D 값을 고려K d (으)로 = 10 μM은 apoform에있을 것입니다. 한편, K의 D &lt;10 μM과 단백질에 결합하는 칼슘 2 +의 연구를 위해, 그것은 [칼슘 2 +] 감소하는 것이 바람직의 :과 칼슘 2 + 착물을 방지하기 위해 0.95 [DM-nitrophen] 비를 APO- 단백질 케이지 사진 해리 사전. </li><li> 기준 화합물 K 3 가용화 [철 (III) (CN)를 6] 또는 샘플과 동일한 버퍼 나 2 CRO 4. </li></ol> 2. 실험 설정하기 <ol><li> 기본적인 실험 구성은도 2에 도시된다. </li><li> 1mm로 프로브 빔의 직경 (HE-Ne 레이저의 632 nm의 출력, ~ 5 mW의 레이저 파워)를 조정하고 온도에 배치 셀의 중심을 통해 프로브 빔을 전파하는 핀홀 (P 2)를 사용 M 1 거울을 사용하여 셀 홀더를 통제했다. </li><li> 프로브 빔의 중심을 샘플 뒤에 거울 (M 2)를 사용하여위치에 민감한 검출기의 중심에. </li><li> 베스트 개의 다이오드와 바닥이 다이오드뿐만 아니라 감지기의 좌측 및 우측에서 두 개의 다이오드 사이의 전압 차 사이의 전압의 차이가 있음을 이러한 방식으로, 검출기의 중심에서 프로브 빔을 초점 제로. </li><li> YAG 레이저, FWHM 5 NSEC)이 355 nm의 레이저 거울 사이에 3mm의 핀홀 (P 1)를 사용 :이어서, 펌프 빔의 직경, Q-스위치의 Nd 355 nm의 출력을 형성. </li><li> 도 2에서와 같이 큐벳의 중심을 통해 펌프 빔 Copropagate. 그것은 두 개의 레이저 빔이 측정 가능한 편향 각 및 PBD 신호 따라서 높은 진폭을 구하는 것이 거의 동일 직선 방식으로 광학 셀의 중심을 통해 전파되는 것이 중요하다. 실험 조건 하에서, 프로브 및 펌프 빔의 교차 각도가 15 ° 미만이다. </li><li> 프로브 및 펌프를 정렬 기준 화합물을 사용하여더 긴 시간 척도 (~ 100 밀리 초)에서 양호한 S / N 비와 안정 PBD 진폭, 즉 만족 PBD 신호를 달성하기 위해 빔. </li><li> 355 nm의 레이저 미러의 증분 조정하여 프로브 빔에 대하여 펌프 빔의 위치를​​ 조정한다. </li><li> 위치 검출기에 민감한이 상하 포토 다이오드 사이의 차이로서 PBD 기준 신호의 진폭을 측정한다. PBD 신호는 빠른 시간 규모 (&lt;10 마이크로 초)에 진폭의 급격한 증가를 나타내고 그림 3에서와 같이 100 밀리 초 척도에서 안정적으로 유지해야합니다. PDB 진폭의 총 변동성에 슛은 신호 진폭의 5 % 내에서하고 신호 재현성는 주로 진동에 의해 영향을받습니다. </li><li> 흡수 된 여기 레이저 파워 온 아인슈타인의 개수에 PBD 신호의 선형 의존성, E의 측정에 의해 방출 열 에너지에 대하여 PBD 신호 진폭의 선형성을 확인= A는 여기 파장에서의 흡광도 기준에 대응한다 (1-10-A). </li><li> 레이저 아래 전력 약 1,000 μJ 및 다 광자 흡수와 각각 펌프 빔 전력의 감소를 방지하기 위해 여기 파장 0.5 미만에서 샘플 / 기준 화합물의 흡광도를 유지하고, PBD 신호의 선형성을 보장한다. </li></ol> 3. PBD 측정 <ol><li> 참조를 위해 PBD 추적의 측정으로 시작합니다. × 1.0 cm 1.0 cm 또는 1.0 cm × 0.5 cm 석영 셀에 참조 화합물의 솔루션을 배치하고 온도 조절 홀더에 셀을 배치합니다. 두 경로의 길이는 비교 PBD의 진폭을 제공한다. </li><li> 3 ° C.의 온도 증가와 함께 16-35 ° C의 온도 범위에서 온도의 함수로서 상기 기준 PBD 신호를 검출 </li><li> 각 온도 변화에 따라, 위치에 민감한 검출기에 프로브 빔의 위치를​​ 확인하고 다시필요한 경우, 검출기의 중심 위치를 조정한다. </li><li> 식 2에 따른 함수로 [(DN / DT) / C의 P의 ρ] 용어를 PBD 신호의 선형성을 확인합니다. </li><li> 참고 측량 등의 광학 셀의 동일한 방향을 유지하는 기준 화합물과 동일한 광학 셀에 시료 용액을 배치. </li><li> 참고 용으로 동일한 온도 범위 내에서 샘플 PBD 트레이스를 감지하고 [(DN / DT) / C의 P의 ρ] 용어에 대하여 샘플 PBD 진폭의 선형성을 확인. </li></ol> 4. 데이터 분석 편향의 크기 때문에 수학 식 1에 따라 샘플 가열 (ΔV 번째) 및 비열 적 부피 변화 (ΔV의 nonth)에 체적 변화에 정비례한다 : <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="식 (1)" /> 샘플 (S의 진폭) 및 기준 (r)로 PBD 신호는 각각 수학 식 2 및 3을 사용하여 설명 될 수있다. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="식 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="식 3" /> PBD 신호 장비 응답 매개 변수 (K)에 비례하고 아인슈타인의 수는 흡수 된 (E). 식 2의 첫 번째 항은, (DN / DT) (1/ρC의 P) Q 인해 용매에 공개 열에 신호 변화에 해당한다. DN / DT 용어 굴절률의 온도 의존성의 변화를 나타내고, ρ는 용매의 밀도이며, C는 P의 열용량이다. 모든 파라미터 증류수 알려져있다 증류수 및 적절한 버퍼 기준 화합물에 대한 PBD 신호를 비교하여 완충액에 대해 결정될 수있다. Q 열 returne의 양용매 D. ρ (DN / D ρ) 기간은 10 ~ 40 °의 C (10)로부터의 온도 범위에서 온도에 독립적 인 단위가없는 상수이다. Δn ABS 용어 인해 용액의 흡수 종의 존재에 굴절율의 변화에 대응하고, 프로브 광의 파장이 용액 중의 어떤 종의 흡수 스펙트럼에 상대적으로 시프트 된 경우에는 무시할 수이다. 기준 화합물 (R)에서 발생하는 신호는 E H는 ν는 여기 파장에서 광자 에너지 식 3으로 표현된다 E H는 ν = 80.5 만 kcal / 몰 355 nm의 여기를위한. <ol><li> 도 3에서와 같이 사전 트리거 및 포스트 트리거 PBD 신호 간의 차이로서 PBD 기준 신호의 진폭을 가지고 간다. 유사한 방식으로, 고속 (A 발 빠르게)의 진폭을 결정하고 느린 단계 (A 발 느린) 샘플 PBD 신호. </li><li> 악기 응답 매개 변수, K를 제거 기준에 대한 PBD 신호의 진폭에 의해 샘플 PBD 신호의 진폭을 확장하십시오. 기준 신호에 대한 샘플 신호의 비율은 수학 식 4를 부여하고 같이 쓸 수있다 : <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="식 4" /> </li><li> 이 방정식을 사용하여 솔루션 (Q)과 비열 부피 변화 [의 플롯의 각각 기울기와 절편,에서 사진 개시 반응과 관련된 (ΔV의 nonth) (S / R) E에 출시 된 열을 결정 H의 ν] 온도에 따라 기간 [(DN / DT) (1/ρCp)] 대 용어. </li><li> 반응 볼륨과 빠르고 느린 과정에 대한 엔탈피의 변화를 결정하는 식 5-7에 따라 적절한 양자 수율에 관찰 된 볼륨과 엔탈피 변화를 확장하려면. <img sRC = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot;고도 = &quot;식 5&quot;/&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="식 (6)" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="식 (7)" /> 동력학은 10 마이크로 초 ~ 200 밀리 초 사이의 시간 스케일로 발생으로 다단계 공정의 경우, 양 및 반응의 각 단계와 관련된 엔탈피 변화가 결정될 수있다. 각 단계에 대한 진폭 및 수명은 볼륨 및 엔탈피 변화의 시간 프로파일을 설명하는 함수 F (t)에 데이터를 피팅에 의해 분석된다. <img alt="식 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> α 0의 빠른에 해당하고 난의 느린 각각의 프로세스에 해당하는 α와 τ는 어디에서 각 반응 단계의 수명입니다. FO 속도 상수의 온도 의존성 가입일R 개별 프로세스가 활성화 엔탈피 및 엔트로피 매개 변수를 쉽게 아 이어링 플롯을 사용하여 측정 할 수있다 (내가 = 1 / τ K). </li></ol>

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	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

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광열 방법 뒤에 물리적 원리는 광 여기 분자 주위 용매 1,12 열적 가열의 결과, 바닥 상태로 이완 진동을 통해 과량의 에너지를 소산이다. 물과 같은 용매, 이것은 급격한 체적 팽창 (ΔV 번째)를 생성한다. 여기 상태의 분자 인해 결합 벽개 / 형성 및 / 또는 분자 (들) (반 데르 소재 즉 변화의 분자 크기를 변경할 수있는 분자 구조의 변화에 비열 부피 변화 (ΔV의 nonth) 발...

이러한 광 음향 열량, 광열 빔 편향 (PDB) 및 나노초 레이저 여기와 결합 과도 격자로 광열 방법은 일시적인 중간체 1,2의 시간 분해 연구를위한 광학 분광기를 과도 할 수있는 강력한 대안을 나타냅니다. 이러한 과도 흡수 및 IR 분광법 등의 광학 기법과 대조적으로, 그 주위의 발색단의 흡수 변화의 시간 프로파일을 모니터링; 광열 기술은 광학적으로의 시간 프로파일을 조사 할 가치있는 도구를 히트 / 부피 변화의 시간 의존성을 감지하고, 따라서 아르 &quot;침묵&quot;처리합니다. 지금까지, 광 음향 열량 과도 격자가 성공적으로 글로빈 3,4, 산소 센서 단백질과 리간드의 상호 작용에 이원자 리간드의 마이그레이션을 포함하여 사진에 의한 프로세스의 구조적 역학을 연구하기 위해 적용되었습니다 FixL 5, 6 산화 효소 전자와 헴 - 구리의 양자 전송차 광계 II뿐만 아니라 로돕신 7 크립토 8 구조적 역학의 광 이성화. 내부 발색단 및 / 또는 형광 물질이 결여되어 생물학적 시스템에 광열 기술의 애플리케이션을 확장, PBD 기법 따라 광 트리거 갇힌 화합물의 용도 몇 마이크로 초 내에 리간드 / 기질 농도의 증가와 함께 또는 빠른 결합시켰다 갇힌 화합물에. 이 방법은 수있는 리간드 / 기판 내부 형광 또는 발색단 부족한 단백질 및 상업 정지 흐름 악기로 액세스 할 수없는 시간 규모에 바인딩과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문의 모니터링. 여기 케이지 화합물, 칼슘의 열역학 2 + DM-nitrophen, 사진 - 분열뿐만 아니라 신경 세포의 칼슘 센서의 C-말단 도메인에 칼슘 2 + 협회에 대한 반응 속도 아래로 모니터링 할 PBD의 응용 프로그램스트림 규제 요소 길항제 변조기 (DREAM)가 제공됩니다. CA는 2 +는 10 마이크로 초 이내에 사진 출시 된 CA로부터 2 + DM-nitrophen하고 ~ 300 마이크로 초의 시간 상수 unphotolysed 케이지에 다시 바인딩합니다. 한편, apoDREAM의 존재 밀리 초의 시간 단위로 발생하는 추가적인 운동은 관찰하고 단백질에 결합하는 리간드를 반영한​​다. 생물학적 시스템의 구조적 전환을 조사하는 PBD의 응용 프로그램은 어떻게 든 수단의 어려움으로 인해 제한되었습니다; 강력하고 재현 PBD 신호를 달성하기 위해 프로브와 펌프 빔의 예를 들어 힘든 정렬. 그러나, 계측 셋업의 세심한 디자인, 온도의 정확한 제어, 및 프로브 및 펌프 광의 조심 배향 광범위에 시분 볼륨 및 엔탈피 변화의 모니터링을 허용 일관되고 견고한 PBD 신호를 제공 10 마이크로 초 약 200 밀리 초까지 시간 규모. 또한, modific에서등 동일한 온도, 버퍼 구성, 광 셀 방향, 레이저 파워, 아래 샘플과 참조 흔적의 검출을 보장하기 위해 실험 절차의 관리 포인트는 크게 측정 반응 볼륨과 열량의 실험 오차를 줄일 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#039;,N&amp;#039;&lt;/em&gt;-Tetraacetic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(2-Hydroxyethyl)piperazine-&lt;em&gt;N&amp;prime;&lt;/em&gt;-(2-ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>HEPES buffer</td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>reference compound for PBD measurements</td></tr><tr><td>Sodium chromate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>reference compound for PBD measurements</td></tr><tr><td>He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>use as a probe beam for PBD measurements</td></tr><tr><td>Oscilloscope,&amp;nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz bandwith</td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>pump beam for PBD measurements</td></tr><tr><td>M&lt;sub&gt;355&lt;/sub&gt;; Nd:YAG laser mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>laser mirror for 355 nm laser line</td></tr><tr><td>M&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; and M&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Laser diode mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td></tr><tr><td>P&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; and P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Iris Diaphragm</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>pin hole to shape the probe and pum beams</td></tr><tr><td>L&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;; bi-convex lens</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm</td></tr><tr><td>DM, dichroic mirror</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td></tr><tr><td>F&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;; Edge filter</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td></tr><tr><td>Temperature-controlled cuvette holder</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

함께 사진 음향 열량 및 열 격자와 광열 빔 편향은 기존의 정지를 사용하여 액세스 할 수없는 시간 규모를 밀리 초 단위로 마이크로에 단백질의 구조적 변화를 유도 빛의 시간 프로파일 볼륨과 엔탈피 변화를 모니터링 광열 방법의 가족에 속한다 흐름 악기. 양 및 / 또는 전체적인 엔탈피 변화가 프로빙 때문에 또한, 이들 기술은 형광 물질과 또는 발색단 라벨 부족한 단백질 및 다른 생체 고분자에 적용 할 수있다. 칼슘과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문을 모니터링하려면 + 칼슘 트랜스 듀서, 이러한 신경 세포의 칼슘 센서, 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen, 사진 트리거에게 무료로 칼슘의 빠른 (τ &lt;20 마이크로 초) 증가 채용에 바인딩 농도와 연관된 부피 및 엔탈피 변화는 광열 편향 빔 기술을 이용하여 조사됩니다.

PBD의 대표적인 예는 칼슘 2 +의 DM-nitrophen에서 칼슘 2 + 사진 방출에 대한 추적은 그림 3에서 볼 수 있습니다. 느린 단계는 칼슘 2 + nonphotolysed 케이지에 바인딩을 반영하는 반면, 빠른 단계는 칼슘 2 +의 DM-nitrophen 및 CA 2 + 해방의 사진 - 분열에 해당합니다. 온도 의존 인자 [C의 P의 ρ / (DN / DT)]의 함수로서 기준 화합물의 진폭을 확장 빠르고...

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Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .

광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

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8.9K 조회수.  Florida International University.  여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 . 

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Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold molecular beams. However, these beams often contain multiple conformers and clusters, even at low rotational temperatures. We present an experimental methodology that allows the spatial separation of these constituent parts of a molecular beam expansion. Using an electric deflector the beam is separated by its mass-to-dipole moment ratio, analogous to a bender or an electric sector mass spectrometer spatially dispersing charged molecules on the basis of their mass-to-charge ratio. This deflector exploits the Stark effect in an inhomogeneous electric field and allows the separation of individual species of polar neutral molecules and clusters. It furthermore allows the selection of the coldest part of a molecular beam, as low-energy rotational quantum states generally experience the largest deflection. Different structural isomers (conformers) of a species can be separated due to the different arrangement of functional groups, which leads to distinct dipole moments. These are exploited by the electrostatic deflector for the production of a conformationally pure sample from a molecular beam. Similarly, specific cluster stoichiometries can be selected, as the mass and dipole moment of a given cluster depends on the degree of solvation around the parent molecule. This allows experiments on specific cluster sizes and structures, enabling the systematic study of solvation of neutral molecules.

We present a technique that allows the spatial separation of different conformers or clusters present in a molecular beam. An electrostatic deflector is used to separate species by their mass-to-dipole moment ratio, leading to the production of gas-phase ensembles of a single conformer or cluster stoichiometry.

분자 순응및 클러스터의 공간 분리

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

연구

공학

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards understanding its mechanism. Protonation and conformational changes affect the vibration pattern of amino acid side chains and of the peptide bond, respectively, both of which can be probed by infrared (IR) difference spectroscopy. For proteins whose function can be repetitively and reproducibly triggered by light, it is possible to obtain infrared difference spectra with (sub)microsecond resolution over a broad spectral range using the step-scan Fourier transform infrared technique. With ~102-103 repetitions of the photoreaction, the minimum number to complete a scan at reasonable spectral resolution and bandwidth, the noise level in the absorption difference spectra can be as low as ~10-4, sufficient to follow the kinetics of protonation changes from a single amino acid. Lower noise levels can be accomplished by more data averaging and/or mathematical processing. The amount of protein required for optimal results is between 5-100 &#181;g, depending on the sampling technique used. Regarding additional requirements, the protein needs to be first concentrated in a low ionic strength buffer and then dried to form a film. The protein film is hydrated prior to the experiment, either with little droplets of water or under controlled atmospheric humidity. The attained hydration level (g of water / g of protein) is gauged from an IR absorption spectrum. To showcase the technique, we studied the photocycle of the light-driven proton-pump bacteriorhodopsin in its native purple membrane environment, and of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 solubilized in detergent.

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

Direct Imaging of Laser-driven Ultrafast Molecular Rotation

We present a method for visualizing laser-induced, ultrafast molecular rotational wave packet dynamics. We have developed a new 2-dimensional Coulomb explosion imaging setup in which a hitherto-impractical camera angle is realized. In our imaging technique, diatomic molecules are irradiated with a circularly polarized strong laser pulse. The ejected atomic ions are accelerated perpendicularly to the laser propagation. The ions lying in the laser polarization plane are selected through the use of a mechanical slit and imaged with a high-throughput, 2-dimensional detector installed parallel to the polarization plane. Because a circularly polarized (isotropic) Coulomb exploding pulse is used, the observed angular distribution of the ejected ions directly corresponds to the squared rotational wave function at the time of the pulse irradiation. To create a real-time movie of molecular rotation, the present imaging technique is combined with a femtosecond pump-probe optical setup in which the pump pulses create unidirectionally rotating molecular ensembles. Due to the high image throughput of our detection system, the pump-probe experimental condition can be easily optimized by monitoring a real-time snapshot. As a result, the quality of the observed movie is sufficiently high for visualizing the detailed wave nature of motion. We also note that the present technique can be implemented in existing standard ion imaging setups, offering a new camera angle or viewpoint for the molecular systems without the need for extensive modification.

We present a protocol for creating a real-time movie of a molecular rotational wave packet using a high-resolution Coulomb explosion imaging setup.

레이저 기반 초고속 분자 회전의 직접 이미징

We present a method for visualizing laser-induced, ultrafast molecular rotational wave packet dynamics. We have developed a new 2-dimensional Coulomb ...

화학

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Photoresponsive 액정의 구조 역학을 관찰을 위한 새로운 기술

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is presented with detailed step-by-step instructions, figures, and videos for smooth data collection.

We present a comprehensive guide to fixed target sample preparation, data collection, and data processing for serial synchrotron crystallography at Diamond beamline I24.

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

생화학

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Monitoring Conformational Dynamics of Single Unmodified Proteins using Plasmonic Nanotweezers

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes can alter protein biophysics and reduce the usefulness of the data acquired. Plasmonic nanotweezers is a technique that uses localized surface plasmon resonance (LSPR) on gold nanostructures to enhance the electric field within a confined hotspot region. This field enhancement allows for the use of low laser powers to trap single nanoparticles far smaller than conventional optical tweezers, down to only a few nanometers in diameter, such as single proteins. Trapping of single protein molecules within the hotspot region induces a shift in the local refractive index (nprotein &#62; nwater), altering light scattering as a product of the molecule&#39;s polarisability, which is affected by its volume, shape anisotropy, and refractive index. An avalanche photodiode (APD) collects the subsequent changes in light scattering. These alterations can then be analyzed to determine changes in the trapped molecule, including its size, global conformation, and dynamics of conformational change over time. The incorporation of microfluidics within the system allows for controlled environmental changes and real-time monitoring of their subsequent effects on the molecule. In this protocol, we demonstrate the steps to trap single protein molecules, alter their environmental solution conditions, and monitor their corresponding conformational changes using a plasmonic nanotweezers system.

Plasmonic nanotweezers use localized surface plasmon resonance in gold nanostructures to trap single nanoparticles, including proteins, within a nanometer-scale optical field. Changes in the scattered signal reveal protein presence and conformational dynamics, enabling monitoring without fluorophore modifications or surface tethering.

플라즈모닉 나노핀셋을 사용한 단일 비변형 단백질의 구조적 역학 모니터링

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...