Bu çalışma JY Sağlık Hibe 5KO8DK085136-02 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1.. Kolon Doku elde Fare Mantığını ve araştırma hedefleri detaylandıran, hayvan deneyleri gerçekleştirmek için bir protokol, teslim ve Hayvancılık Araştırma Gözetim bizim kurumsal Dairesi tarafından onaylandı. <ol><li> Servikal dislokasyon inhale izofluran ile fare Euthanize. </li><li> Ventral orta hat kesi yapmak, uzakta küçük bağırsak geri çekin ve kolon tanımlamak. Yanal mesane ve rahim (varsa) geri çekin ve kasık kemiği belirlemek ve rektum maruz ince makasla kesti. </li><li> Kolon kapalı rektum dorsal mezenter incelemek ve anüs çekum kolon harekete ve küçük bağırsak kolon kesmek için transect. </li><li> Buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) &#39;de örnek yerleştirin. </li><li> Buz gibi soğuk PBS ile bir 10 ml şırınga doldurun ve kolon ope kesilmiş, daha sonra içeriğini temizlemek için birkaç kez lümen kolon temizlemen boy-bilge makas kullanarak. </li><li> Buz soğukluğunda PBS ile 20 ml içeren, 50 ml konik bir tüp içinde kolon yerleştirin. Kolon, herhangi bir yönde yerleştirilmiş olmak zorunda değildir. Akışkan, partikül madde ile temizlenene kadar PBS değiştirerek kolon yıkayın. </li></ol> Insan Bu dokusunun yanısıra, potansiyel riskleri ve yararları bir değerlendirmesini elde önemini ayrıntılı, cerrahi hastalarında insan dokusu elde etmek bir protokol, teslim ve İnsan Araştırma Koruma Programı bizim kurumsal Dairesi tarafından onaylandı. <ol><li> Bir kolorektal cerrah ile araştırma işbirliği araştırma için insan doku elde edebilmek için gereklidir. Insan kolon dokusu elde etmek için bir protokol gönderilen ve kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış olması gerekir. </li><li> Yazılı izin önce cerrahi prosedür için hastadan elde edilir. </li><li> Cerrah standında bir kolon rezeksiyonu yapacakard moda. Kolon hastadan çıkarıldıktan sonra, numune, hemen patolojiye alınır. Patolojik değerlendirilmesi için gerekli değildir kolon duvarının tam kat bölümünde 0,5 sağlanır ve hemen buz soğukluğunda PBS yerleştirilir. Bu numune kolon mezenter içermemelidir ve yağ mevcudiyeti, sindirim süreci etkiler çünkü epiploik uzantılar, aynı zamanda kaldırılması gerekir. </li></ol> 2. Epitel Hücreleri soymak <ol><li> 50 ml konik bir tüp içinde HBSS içinde 5 mM EDTA (oda sıcaklığı) 25 ml tüm fare kolon inkübe edin. 15 dakika boyunca 37 ° C hava banyosu çalkalanarak (250 rpm) &#39;de konik tüp yerleştirin. 15 dakika sonra, dikkatli bir şekilde sıvı dökün ve 5 mM EDTA, 25 ml dolum tüpü, 5 yıkama toplam tekrarlayın. Insan kolon için, patolog gelen kolon duvarının ½ inç şeridi aldıktan sonra dört eşit büyüklükte parçalara makasla kolon kesti. Bir 50 ml konik bir tüp içine parçalarının iki yerleştirin veAyrı bir 50 mL konik tüp içine kolon dokusunun geri kalan iki adet yerleştirin. Daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi, HBSS içinde 5 mM EDTA, 25 ml ile inkübe edilir ve yıkama yapar. </li><li> Buz soğukluğunda 20 ml PBS içinde iki kez kolon durulayın. </li><li> RPMI-5 20 ml, dispaz 10 U ve kolajenaz D 2000 U (oda sıcaklığı) içeren yeni bir 50 ml konik bir tüp içinde, fare kolon doku yerleştirin. Insan kolon dokusunun için, dispaz ve kolajenaz iki katı (20 U dispaz, 4000 U kolajenaz D) kullanın. </li><li> (Yatay yerleştirilmiş ise, çok fazla havalandırma ve hücre hasarı var) dikey yönelimli bir 37 ° C sallayarak hava banyoda tüpü yerleştirin. Kadar 60 dakika boyunca 250 rpm&#39;de çalkalanır. Dispase ve kollajenaz D maruz kaldıktan sonra, kolon doku sindirimi başlayacak ve kolon doku lifli bakmaya başlayacaktır. Bu genellikle yaklaşık 30 dakika sürer. Bu kolon görünüme sahip olduğunda, enzimlerden kolon çıkarın. </li><li> Dokusu kırmak için yukarı ve aşağı 2-4 kez her tüpü çalkalayın. P5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj (4 ° C) de 200 xg&#39;de doku ellet. Dikkatlice süpernatant dökün ve atın. </li></ol> 3. Miyofibroblast İzolasyon ve Kültür <ol><li> 10 ml ACK lisiz tamponu (47 ° C) eklenerek her pelet tekrar. Tekrar santrifüj 5 dakika (4 ° C) için 200 xg, kapalı dökün ve süpernatant atın. </li><li> Bir pipet ile 10 ml RPMI-5 ekleyerek her pelet tekrar. </li><li> Bir 100 mm TC-muamele kabı içine 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak 70 mikron gözenekli süzgeç vasıtasıyla hücre süspansiyonu (5 mi) arasında yarı geçirir. Daha sonra RPMI-5 ek bir 15 ml. Farklı 100 mm TC-muamele kabına hücre süspansiyonu geri kalan 5 ml ile tekrarla. Bir fare kolon nedenle iki 100 mm TC-muamele yemekler verecektir. Insan kolon dokusunun ½ bir inçlik tabaka, dört adet 100-mm TC-muamele yemekler, toplam ürün olarak verecektir. </li><li> 37 ° C&#39;de% 10 CO2 inkübatör doku kültür kaplarına yerleştirin Kültür koşulları aynı fya da fare ve insan birincil hücreler. </li><li> 3 saat sonra, yavaşça HBSS iki değişiklik ile yıkanarak yapışmayan hücreler yıkayın. Enkaz kayan nazikçe yıkanmalıdır. Yapışık hücreler epitel hücreleri, makrofajlar ve miyofibroblastlar oluşmaktadır. Bir hafta sonrası tohumlama, sadece bölme miyofibroblastlar, makrofajlar ve epitel hücreleri ilk geçişinden sonra senesce. Taze RPMI-5&#39;i ilave edin ve hücre kültüründe hücreler büyür. </li><li> Hücreler, 5 dakika boyunca tripsinizasyon ile pasajlanır ve 2:1 bölünür. </li></ol> Kısaltmalar HBSS: Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi, RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute medya; ACK: Amonyum Klorür-Potasyum; FCS: fetal buzağı serumu, TC-tedavi: doku kültürü tedavi Çözümler ACK lisiz tamponu - (4.15 g NH4CI, 0.5 g KHCO 3, 18.6 mg Na 2 EDTA, 400 ml 2 H, O, 1 N HCI ile 7.2-7.4 pH ayarlamak için). Filtre Sterilize bir 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden 4 ° C&#39;de RPMI-5 - (500 ml yapmak için: 454,5 ml RPMI, 25 mi FCS, 5 ml 200 mM L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES, pH 7.4, 5 mi 100 mM sodyum piruvat, 5 ml 100x Pen-Strep, PBS içinde 500 ml 50 mM B-ME).

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Fare ya da insan kolon kullanarak zaman genel teknik benzer. Bu teknik aynı zamanda ince bağırsaktan miyofibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. 1 ila miyofibroblastlar izolasyonu için özel bilgiler. Fare ve 2. insan kolon aşağıda tartışılmaktadır. 1.. Fare Kolon Fare kolon sulama kolonun bir ucuna 16 G Popper küt uç iğne, bir 4 takılarak kolaylaştırılır. Uzunlamasına kolon kesim bu da yardımcı olur. Sen iğne üzerine kolon doku Akor...

Gastrointestinal (Gİ) sistem fonksiyonunun düzenlenmesi mukoza tabakası ve onun altında yatan mezenşimin arasındaki karmaşık, dinamik etkileşimleri içerir. Bu etkileşimler, normal dengesini korumak için hizmet değil, aynı zamanda patolojik koşullar altında 1 hastalık durumlarının gelişmesine yol açabilir. Miyofibroblastlar mukozal rejenerasyon, onarım ve fibrozis 2 içeren kritik Gİ süreçlerin bir dizi düzenleyen hücre subpopülasyonunun ülkelerle birlikte bir parakrin iletişim epitel tabakası alttaki bulunan stromal hücrelerin bir alt vardır. İn situ miyofibroblastlar primer özelliklerinin çok paylaştığı için 18Co hücre hattı yaygın olarak miyofibroblast fonksiyonu çalışma için kullanılmıştır, insan kolon miyofibroblast hücre hattının bir örneğidir. Bunlar protein a-düz kas aktin ekspresyonu (α-SMA) ve vimentin yanı sıra, bir dizi ekspresyonunu içerirörneğin, epidermal büyüme faktörü reseptörü, ya da lizofosfatidik asit, 3,4 için reseptör olarak, hücre yüzeyi reseptörlerinin. Çünkü bu ortak ince yapı özellikleri, hem de biyolojik işlevi 5 benzerlikler, 18Co hücre hattı, enflamatuar barsak hastalığı veya kolorektal kanser 3,6 gibi birçok hastalık durumlarının bağlamında miyofibroblast fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, hücre satırını kullanarak doğal sınırlamalar ve endişeler vardır. Bu büyüme oranları ve diğer hücre popülasyonları ile etkileşimler de dahil olmak üzere hücrenin fenotipini ve biyolojik işlevi değiştirerek, primer hücrelerden hücre çizgileri ayıran zamanla genotipik instabilitedir. Hücre hatları, aynı zamanda kullanımı için önemli bir sınırlamadır GI mikro-(epitel, stromal ve vasküler bileşenlerinin), normal bileşenleri eksikliği. Bu nedenle, deneysel hücre çizgisi araştırmadan çıkan sonuçlar ri azaltmak için daha fazla doğrulama gerektirirmisinterpretation sk. Birincil miyofibroblastlar bir hücre hattı 7 belirlenen deneysel bulguları teyit etmek için, insan ve fare kolon dokusundan elde edilebilir. Yöntem ilk Mahida, et al. 8 tarafından tarif edilen, ve protokol, fare ve insan kolon 9 birincil miyofibroblastlar izole etmek için de kullanılabilir, çok iyi tarif edilen tekniklerden biridir. Bağırsak hastalığının herhangi bir fare modeli için, bu teknik, bunlar komşu hücreler ile etkileşime nasıl çalışma veya normal ya da patolojik GI 10,11 süreçleri iki katkı birincil miyofibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. Bu teknik miyofibroblastlar şifa, fibrozis, ve kolorektal adenom ve karsinom gelişimine mukozal nasıl katkıda incelemek için kullanılabilir. Birincil miyofibroblastlar da benign (iltihaplı bağırsak hastalığı, striktür, divertikülit) ya da kötü huylu c operasyon zamanında rezeke edilmiş insan kolon dokusundan elde edilebilirşartlarından. İnsan ve fare kolon dokusundan izole edilmiş primer hücrelerde hücre kültürü içinde büyütülmüş ve pasajların sınırlı sayıda üzerinde kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Name of the reagent</td><td>Company</td><td>Catalogue number</td><td>Comments (optional)</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Invitrogen/GIBCO</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>#1 088 858</td><td></td></tr><tr><td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td><td>Fisher</td><td>#14-825-16K</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

Miyofibroblast çok GI fonksiyonları kritik rolü için önemli bir önem kazanmaktadır mide-bağırsak (GI) sistemi içinde bir stromal hücresidir. Birkaç miyofibroblast hücre çizgileri bu hücrelerin in vitro çalışma için ticari olarak mevcut olmakla birlikte, deneysel hücre kültür koşullarına maruz bırakılan bir hücre hattından araştırma sonuçları işin aşırı indirgemeci doğası gereği doğal sınırlamaları vardır. Birincil miyofibroblastlann bir hücre çizgisinde tespit deneysel bulguları teyit açısından büyük bir avantaj sunmaktadır. Bir hayvan modelinde birincil miyofibroblastlar izolasyonu daha yakından hastalık durumu çalışılmaktadır taklit eden şartlar altında miyofibroblastlar çalışma sağlar. Hücreler altta yatan hastalığı olan hastalarda doğrudan gelir beri insan kolon dokusundan birincil miyofibroblastlar izolasyonu, tartışmasız en uygun deneysel verileri sağlar. Biz u olabilir köklü bir tekniği açıklarFare ve insan kolon dokusunun hem birincil miyofibroblastlar izole etmek tilized. Bu izole edilmiş hücreler, bağırsak epitel altı miyofibroblastlar tutarlı a-düz kas aktin ve vimentin pozitif ve desmin-negatif olmak karakterize edilmiştir. Birincil miyofibroblast hücreler hücre kültürü içinde büyütülmüş ve pasajların sınırlı sayıda fazla deneysel amaçlar için kullanılabilir.

Bir kez izole edilmiş, birincil insan miyofibroblastlar hücre kültürü içinde yetiştirilen ve (geçit 4 kadar) geçişlerinin sınırlı sayıda üzerinde kullanılabilir. Bu hücreler, bağırsak epitel altı miyofibroblastlar 5,7 ile tutarlı a-düz kas aktin ve vimentin pozitif olarak karakterize edilir ve desmin-negatif (Şekil 1A) vardır. Ayrıca, tipik bir yıldız şeklinde bir morfoloji (Şekil 1 B) vardır. Birincil miyofibroblastlar daha sonra bir hücre çiz...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

isolation-of-primary-myofibroblasts-from-mouse-and-human-colon-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.6K Görüntüleme.  UCLA.  Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar. 

Video: Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Cerrahi Dokular İlköğretim İnsan Kolon Tümör Hücreleri İzolasyon ve Çekiş Sitometrinin Yumuşak Elastik Yüzeyler Doğrudan onları Kültürleme

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Biyomühendislik

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Tıp

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Biyoloji

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Murin bağırsak mezenkiminin izolasyonu yüksek telosit verimi ile sonuçlanır

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...