Yazarlar teknik yardım Emilija Renke ve Janet Yu teşekkür etmek istiyorum. DCN Savunma Amerika Birleşik Devletleri Bölümü (DR080205, DM102823, OR09055 ve OR090059) hibe tarafından desteklenmektedir. RDH Maryland Tarım Deneme İstasyonu ve Hücre ve Moleküler Biyoloji bir NIH Eğitim Grant bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Optimal Isıtma Koşullar Belirlenmesi İlk olarak, bir tane deneysel olarak ideal sıcaklık ve inkübasyon tahlil içinde ısıtma işlemi için kullanılacak zaman belirlemek gerekir. Bizim PlyC modeli için, dikkat edilmesi gereken önemli olduğunu E. coli ayrı ifade plazmit üzerinde plyCA ve plyCB genleri ile birlikte transforme tam olarak işlevsel PlyC holoenzyme 6 oluşturacak şekilde gösterilmiştir. Yanı sıra hücre büyüme koşulları ve sonraki yineleme kaplama tekniği olarak 96 oyuklu plaka hazırlık literatürde 12-16 sağlanan örneklerden adapte edildi. Önceki termal inaktivasyon denemelerinden alınan sonuçlar fizyolojik sıcaklık (yayınlanmamış gözlem) aşan ortamlarda kısa süreli inkübasyon sırasında faaliyetteki hızlı kaybı dikte olarak 30 dk bir inkübasyon süresi bu testte için uygun olacaktır. PlyC için optimum sıcaklık inkübasyon aşağıdaki adımlar ile belirlendi: <ol><li> TranYetkili E. içine plyCA (Amp r): İfade yapı pBAD24 sform plyCB (Cm r): coli DH5α pBAD33 süzün. </li><li> Ampisilin (100 mg / ml) ve kloramfenikol (35 mg / ml) ile desteklenmiş bir Luria-Bertani (LB) agar plaka Plaka transformantlar. Gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakaları </li><li> Steril bir kürdan ile, iyi bir düz dipli, berrak, steril 96 kuyu her satır (Şekil 2a) içine tek bir koloni inoküle, ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş LB 200 ul içeren mikrotiter plaka değirmi. </li><li> Güvenli bir 37 96 oyuklu plaka yerleştirin ° C inkübatör sallayarak ve 300 rpm&#39;de gecede bakterileri büyür. </li><li> 37 96 oyuklu plaka alma ° C aşağıdaki gibi yeni bir 96 oyuklu plaka için kuvöz ve çoğaltma plaka sallayarak: <ol class="lalpha"><li> Ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş LB 180 ul ekleyinkopya plakanın her için. </li><li> Kopya plaka karşılık gelen kuyulara orijinal plaka bakterilerin 20 ul aktarın. Bu ~ bir başlangıç ​​OD 600 0.5 sonuçlanmalıdır. </li></ol></li><li> Güvenli bir şekilde 37 kopya plaka yerleştirmek ° C inkübatör sallama ile 300 rpm&#39;de 1 saat için inkübe plaka, daha sonra inductant ekleyin. PBAD ekspresyon sistemleri söz konusu olduğunda, inductant% 0.25 arabinoz olup. Diğer ifade sistemleri, farklı inductants gerektirebilir. 37 geri plakası yerleştirin ° C protein ekspresyonu için izin vermek için ek bir 4 saat boyunca 300 rpm&#39;de kuvöz ve sallamak sallayarak. İfade düzeyleri genellikle PlyC 10-20 mikrogram arasında değişmektedir. </li><li> Protein ekspresyonu sonucuna sonra, 96 oyuklu plakalar uyan bir sallanan-kova rotor içeren bir soğutmalı santrifüj içinde 96 oyuklu plaka yerleştirerek kopya plaka ve pelet bakteri almak. Oda sıcaklığında 10 dakika için 3000 rpm&#39;de santrifüj yapılır.</li><li> Yavaşça ters mikrotiter plaka ile medya süpernatantı ortamı yavaşça şişeden. </li><li> Her bir kuyucuğa B-PER II bakteriyel protein Ekstraksiyon Reaktifi 50 ul ilave edilerek hücreler parçalayıcı. 20 dakika oda sıcaklığında inkübe plaka. </li><li> Fosfat 70 ul ekleyerek 120 ul her kuyuda hacmini artırın salin (PBS) pH 7,2 tampon. </li><li> Pelet 10 dakika 4 ° C&#39;de buzdolabında santrifüj için 3000 rpm&#39;de dönen plaka ile çözünmeyen hücre kalıntıları. </li><li> Bir 96 oyuklu plaka PCR karşılık gelen kuyulara çözülebilir ham lizat 110 ul aktarın. </li><li> Önceden belirlenmiş bir inkübasyon süresi olarak 30 dakika kullanarak, şu anda 15-20 ° C kapsayan geniş bir degrade sıcaklık aralığı 96 PCR plaka ikamet çözünür lizatları maruz Not amacı, belirli bir enzim&gt;% 95 katalitik etkinlik kaybeder sıcaklığında belirlemektir. </li><li> İnkübasyondan sonra, kuyu 96 inkübe4 at termalcycler plakası 5 dakika ve de son 96 mikrotitre plakası kendilerine karşılık iyi bir konuma 96 PCR plaka çözünür lizatları 100 ul aktarın ° C. </li><li> 12 kanallı multipipettor ile her kuyucuğa GAZ zorlanma D471 100 ul ekleyin. Not, D471 hücreleri başlangıçta gecede kültürlerden liyofilize ve ~ 2.0 bir OD 600 elde etmek için PBS pH 7.2 ile tekrar süspanse edilir. </li><li> Hemen 20 dakika OD 600 her 15 sn ölçerek mikroplak spektrofotometrede 96 plaka yerleştirmek ve enzim kinetiği izlemek. Optik yoğunluk bir değişiklik (ΔOD ≤ 0.1) yoksun kuyulara karşılık düşük sıcaklık inkübasyon olmayan serbest sıcaklık olarak tanımlanır. </li></ol> • geniş bir sıcaklık ekran olmayan serbest sıcaklık belirlemek için kullanıldı sonra, yukarıdaki adımların bir sıcaklık daha dar bir aralık (5 ° -10 ° C) aydınlatmak için üzerinde tekrarlanırsöz konusu enzimi için kesin olmayan serbest sıcaklığı. Not, bu tahlil içinde tanımlanan olmayan serbest sıcaklık bağlı hacim farklılıklar, konsantre hale getirme vb için başka araçlar ile belirlendi erime sıcaklığından daha farklı olabilir 2. Mutant Kitaplığı oluşturma Taranacak mutant kütüphane oluşturulması rastgele şöyle GeneMorph II Rastgele Mutagenezi Kit kullanarak plyCA gen minimal nükleotid önyargı ile bir hata eğilimli DNA polimeraz tarafından mutasyonlar içeren içerir: <ol><li> 5 &#39;ve 3&#39; plyCA geninin ucunda tercih edilen kısıtlama siteleri ile 55-72 ° C arasında benzer bir erime sıcaklığına (Tm) sahip nükleotid primerleri tasarlar. </li><li> İstenen mutasyon oranı plyCA başına 2-3 nükleotidler (1.4 kb) olduğundan, düşük f mutasyon için PCR reaksiyonu bileşen konsantrasyonlarının yanı sıra, imalatçı tarafından tavsiye edilen PCR koşulları kullanmakrequencies (kb başına 0-4,5). </li><li> Ifade vektörü içine pBAD24 mutagenized plyCA gen klonlama. </li><li> PlyCB arka plan ve ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş LB agar plaklarına plaka transformantlar: Bir DH5α pBAD33 içine yapıları Transform. </li><li> Buna ek olarak, dönüştürme ve plaka DH5α pBAD33: plyCB ifade vektörü pBAD24 WT plyCA geni ihtiva eden ile. Bu plaka Kolonileri tarama sırasında denetimleri olarak görev yapacak. </li></ol> 3. 96 oyuklu plaka Hazırlama ve Hücre Büyümesi Şartları <ol><li> Ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş LB 200 ul ile 96 oyuklu plakanın her doldurun. </li><li> Mikrotiter plate şematik (Şekil 2b) takiben, dikkatli steril bir kürdan ile gecede agar plaklarına bireyin koloni seçin ve 96 iyi tasarlanmış oyuklu pla bakteriler inokülete. Bu başına sadece bir koloni de inoküle edilir sağlamak esastır. </li><li> 37 gecede 300 rpm&#39;de güvenli demirlemiş 96 oyuklu plaka çalkalayın ° C. </li></ol> 4. Replica Kaplama, Protein Ekspresyonu İndüksiyon ve Lizat Hazırlama <ol><li> Bir değişiklik ile &quot;optimum ısıtma koşullarının belirlenmesi&quot; başlıklı bölümünden adımları 1,5-1,11 izleyin. Çoğaltma kaplama adım varmıştır ° C den sonra 4 de orijinal plaka saklayın. </li><li> Sonra adım 1.11, pozitif kontrol kuyuları A1-D1 hariç bir 96 PCR plaka karşılık gelen kuyulara çözülebilir ham lizat transfer 110 ul. Pozitif kontrol lizatları (ısıtmalı değil yani lizatları), buz üzerinde deney ve mağaza için nihai tahlil plaka olarak hizmet verecek yeni bir 96 oyuklu plaka karşılık gelen kuyulara lizatları transfer 100 ul ile ilgili. </li></ol> 5. Çözünür Lizat Isıl İşlem <ol><li> Negatif kontrol ve 1. adımda belirlenen optimum olmayan serbest inkübasyon sıcaklığında 30 dakika için PCR içinde 96 oyuklu plaka PCR şu anda kapalı lizatları mutant çözünür ısıtın. </li><li> Non-izin veren sıcaklık inkübasyondan sonra, 5 dakika 4 ° C de 96 PCR plaka inkübe edilir. </li><li> Önceden pozitif kontrol lizatları çözünür içeren nihai 96 oyuklu tahlil plakası da onların aynı konumlara 96 ​​PCR plaka çözünür lizatları 100 ul aktarın. </li><li> 12 kanallı multipipettor ile her kuyucuğa GAZ zorlanma D471 100 ul ekleyin. Hemen mikroplak spektrofotometrede plakası yerleştirin. </li><li> 20 dakika için OD 600 her 15 saniye ölçme tarafından enzim kinetikleri izler. <ol class="lalpha"><li> Ilerledikçe termal davranışı ile PlyC varyantı az daha 900 sec 50 oranında orijinal optik yoğunluk azaltabilirsiniz bir yapı olarak tanımlanırolmayan müsamahakâr sıcaklığı. Ayrıca, pozitif kontrol (yani non-ısıtmalı, WT PlyC) WT katalitik aktivite göstermek gerekir (t 1/2 ≤ 100 sn) ve negatif kontrolleri (yani, WT PlyC ısıtmalı) aktivite yoksun olmalıdır. </li></ol></li><li> Ile bir varyant PlyC ısıl özellikleri tanımlanır ilerledikçe sonra, ampisilin ve kloramfenikol ile desteklenmiş taze LB ortam maddesine ilgili mutant için iyi belirli bireysel 4 ° C ve inokülasyon bakterilere depolanmış orijinal plaka alır. 37 gecede inokulum büyütün ° C. </li><li> Özü ve saflaştırmak plazmid DNA kültürden sonra PlyCA gelişmiş termal davranış anlaması nükleotid mutasyonları tespit etmek için, sıralama için gönderin. Ayrıca, -80% 10 gliserol ve mağaza ° C daha fazla kullanım için olan gecede kültür küçük bir kısım ek. </li></ol>

<ol>
	<li>Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+design+by+directed+evolution.">Protein design by directed evolution.</a> Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).</li><li>Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+an+orthogonal+nucleoside+analog+kinase+via+fluorescence-activated+cell+sorting.">Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting.</a> Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).</li><li>Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+lysins+as+effective+antibacterials.">Bacteriophage lysins as effective antibacterials.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).</li><li>Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinventing+phage+therapy:+are+the+parts+greater+than+the+sum.">Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum.</a> Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).</li><li>Loessner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+endolysins--current+state+of+research+and+applications.">Bacteriophage endolysins--current state of research and applications.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).</li><li>Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlyC:+A+multimeric+bacteriophage+lysin.">PlyC: A multimeric bacteriophage lysin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).</li><li>Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+elimination+of+upper+respiratory+colonization+of+mice+by+group+A+streptococci+using+a+bacteriophage+lytic+enzyme.">Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).</li><li>Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysK,+the+enzyme+lysing+Staphylococcus+aureus+cells:+specific+kinetic+features+and+approaches+towards+stabilization.">LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization.</a> Biochimie. 92, 507-513 (2010).</li><li>Varea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+thermodynamic+characterization+of+Pal,+a+phage+natural+chimeric+lysin+active+against+pneumococci.">Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci.</a> J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).</li><li>Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+and+cooperative+domains+of+CPL1+lysozyme+and+its+NH2-+and+COOH-terminal+modules.+Dependence+on+choline+binding.">Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding.</a> J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).</li><li>Anderson, G., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+product+shelf+life+and+activation+energy+for+five+drugs+of+abuse.">Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse.</a> Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).</li><li>Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+novel+N-carbamylase/D-hydantoinase+fusion+enzyme+for+functional+expression+with+enhanced+stability.">Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability.</a> Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).</li><li>Koutsioulis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+on+the+cold+adapted+properties+of+TAB5+alkaline+phosphatase.">Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase.</a> Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).</li><li>McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+catalytic+efficiency+and+active+site+modification+of+1,4-beta-D-glucan+glucohydrolase+A+from+Thermotoga+neapolitana+by+directed+evolution.">Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution.</a> J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).</li><li>Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolved+xylose+transporter+from+Zymomonas+mobilis+enhances+sugar+transport+in+Escherichia+coli.">An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli.</a> Microbial cell factories. 8, 66 (2009).</li><li>Tsuzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostable+mutants+of+the+photoprotein+aequorin+obtained+by+in+vitro+evolution.">Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution.</a> J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).</li><li>Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+enzyme+stability.">Directed evolution of enzyme stability.</a> Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).</li><li>Kumar, S., Nussinov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+thermophilic+proteins+deal+with+heat.">How do thermophilic proteins deal with heat.</a> Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).</li><li>Hibbert, E. G., Dalby, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+strategies+for+improved+enzymatic+performance.">Directed evolution strategies for improved enzymatic performance.</a> Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).</li><li>Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+random+mutagenesis+by+error-prone+polymerase+chain+reaction+protocols,+Escherichia+coli+mutator+strain,+and+hydroxylamine+treatment.">Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment.</a> Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).</li><li>Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+random+mutagenesis+methods+used+for+directed+protein+evolution.">A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution.</a> J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).</li><li>Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+adapt:+lessons+from+directed+evolution.">How enzymes adapt: lessons from directed evolution.</a> Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Şekil 1 &#39;de özetlenen bu protokol, herhangi bir bacteriolytic termostabilite artırmaya yönelik evrim kullanmak olanak sağlayan bir 96 oyuklu plaka yöntemi sunar. Geliştirilmiş oluşturmak bir hata eğilimli DNA polimeraz kullanılarak, bir tipik olarak elektrostatik artan oluşan moleküler yeniden düzenlemeler nedeniyle ilgi tercüme bacteriolytic molekülü, genel olarak kinetik stabilitesini arttırmak rastgele mutasyonların tanıtmak için, disülfid köprü ve hidrofobik etkileşimler moleküler ambalaj, yüzey yükü ağlar veya daha yüksek bir oligomerizasyonun devletin 17-18 takviye gelişmiş değişiklikler. Nükleotid mutasyonu girişten sonra, kapsamlı bir tarama prosedürü ardından termal yararlı mutasyonları tanımlamak için kullanılmıştır. Burada sunulan temsilcisi sonuçlar rastgele mutajenez bir tur dayanmaktadır. Gerçekte, bu ileri sürülmüştürrastgele mutajenez en az üç ardışık tur, DNA shuffling ardından kurşun enzim olarak en güçlü mutant kullanarak her yönlendirilmiş evrim termal davranış bu tür çalışmalar 2 için uygundur. Bu protokol kinetik kararlılık artırmak mutasyonlar tespit ederken, bu varyantlar ille termostabilite artış olmadığını anlamak önemlidir. Yüksek bir sıcaklıkta yapısı tutma yeteneğine sahip olduğunda bir molekül ısı ayarlı olarak kabul edilir. Ancak, sunulan bu tahlil içinde, mutant lizatları kalıntı aktivitesi başlangıçta ısıl işlem adımı sırasında inkübe edildi ve böylece bir 19 refolding yerine geliştirilmiş termostabilite desteklemek mutasyon için seçilerek olabilir ki, aynı sıcaklıkta test edilmemiştir. Biz termal istikrarın bir göstergesi olarak termal davranış extrapolating edilirken, gerçek termal stabilite Biophys ampirik olarak ölçülmesi gerekirdairesel dikroizm (CD), diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC) ve diferansiyel tarama fluorimetry (DSF) gibi ical yöntemleri. CD ve DSF deneyler Ön veriler sundu metodolojisi tanımlanan birkaç aday gerçekten ilerledi termostabilite (veriler gösterilmemiştir) görüntülemek öneririz. Burada sunulan metodoloji PlyC yükselmiştir termal davranışı uygulamak için belirli olsa da, bu aynı metodoloji ayrıca böyle tamponlar, mutasyon oranları, ısıtma koşulları ve ifade sistemleri gibi değişkenler için bazı küçük değişiklikler ile diğer bacteriolytic enzimler için termal aktivite geliştirmek için istihdam edilebilir. Bu tahlil ile ilişkili bir önemli değişken hata eğilimli DNA polimeraz nükleotid mutasyon oranı ile ilgilidir. Biz nedeniyle bu özel enzim ile önyargı az miktarda görüntüler gösteren deneysel kanıtlar bizim yönlendirilmiş evrim tayininde hataya Mutazyme II DNA polimeraz kullanmayı seçtiBu tür hidroksilamin kullanımı, mutator E. gibi diğer rasgele mutajenez teknikleri ile karşılaştırıldığında nükleotid ilişkin rasgele ilgilenilen genin dahil edilmiştir coli suşları ve diğer hata eğilimli DNA 20 polyermases. Genel olarak, düşük bir mutasyon oranları iki nedenden dolayı daha fazla arzu edilen olma eğilimindedir. İlk olarak, protein mühendisliği ile termostabilite tipik olarak nispeten daha az amino asit ikamesine oluşur. Yüksek mutasyon oranları kesin yapısal misfolding ve fonksiyonel farklılıklar neden olabilir belirli moleküllere önemli yapısal değişikliklere neden olabilir. Örneğin, glisin, prolin kalıntıları eklenmektedir alfa sarmal ikincil yapılar 21 bozabilir. İkincisi, yüksek nükleotid mutasyon oranları biyolojik olarak inaktif kesilmiş moleküller ile sonuçlanan, erken durdurmak kodonlar içeren şansını artırmak. Genel olarak, düşük bir mutasyon oranlar tercih edilir, çünkü accumul daha düşük hata oranı sonucunuadaptif mutasyon ation yüksek mutasyon oranları nötr veya zararlı mutasyonların 22 üretirken. Rastgele mutajenez her turu için bir optimize gereken başka bir kritik değişken tarama işlemi sırasında kullanılan inkübasyon sıcaklığı içerir. Deneysel olmayan ılımlı sıcaklık seçimi nispeten zordur. Biz başlangıçta 10 olan bir inkübasyon sıcaklığı kullanılan ° C, PlyC-olmayan müsamahakâr sıcaklığından daha yüksek ise 3.000 mutantlar eleme sonrasında, herhangi bir faydalı mutasyonların tespit koyamadık. Yönlendirilmiş evrim yöntemleri sırayla additif etkileri vardır faydalıdır aminoasit değişikliğini tespit oluşmaktadır akılda tutarak, bunun yanlış pozitif üretme şansı artmış olsa bile daha az katı bir sıcaklık tarama sürecinde kullanılması gerektiğini tespit edilmiştir. Bu nedenle, biz sadece sigara-permiss C&#39;nin birkaç derece üzerinde olduğu bir inkübasyon sıcaklığı kullanılırive sıcaklık ve rescreened seçilen adayların yanlış pozitif ekarte etmek. Biz çok ılıman değildi bir inkübasyon sıcaklığı kullanmaya karar verdiler (≤ 1 ° C düşük olmayan müsamahakar sıcaklığından daha yüksek) ve tersine çok sert değil (≥ 5 ° düşük olmayan müsamahakar sıcaklığından daha yüksek C). Biz özellikle bu deneyde kullanmaya karar ideal sıcaklık ılımlı 2 ° C idi deneysel belirlenen non-müsamahakar sıcaklığından daha yüksek. Bir orta sıcaklıkta inkübasyon kullanıldığında çok hafif bir sıcaklık seçme gözlediğimiz ~% 20 (Tablo I) çok daha yüksek bir yanlış pozitif oran kimlik neden olur. Ayrıca, çok sert bir inkübasyon sıcaklığı kullanarak sonuçta önemli ölçüde geliştirilmiş termal davranışı ile mutantlar belirlemek için yetersizlik neden olabilir. Örneğin, ≥ 5 inkübasyon sıcaklığı kullanarak ° C tanımlamak için yetersizlik sonuçlandı olurdu29C3 mutant yanı sıra tarama ilk turda seçilen diğer adayların çoğunluğu umut. Toplamı, biz gelişmiş kinetik kararlılık elde etmek için mühendislik bacteriolytic enzimler için bir protokol sağlar. Üstelik, bu ısıtma adımlar olmadan aynı tahlil, katalitik aktivitesini arttırmak mutasyonları tespit etmek amacıyla kullanılabilir. Katalitik aktivite ve termostabilite hem Augmenting herhangi bir terapötik enzim bakan önemli bir gelişimsel engeldir. Bu protokolün ayrıntılar endolysin PlyC özgü da, metodoloji sadece birkaç değişiklik ile herhangi bir bacteriolytic enzim için adapte edilebilir. Biz önemli büyüklükte moleküler termostabilite bir artış oluşturmak mutasyonların uygulanması ve kimlik sonuçlanan testin işlevsellik doğrular mutagenez yalnızca ilk turda alınan ön sonuçlarını sundu.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> B-PER II Bakteriyel Protein Ekstraksiyon Reaktifi </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78260 </td></tr><tr><td> GeneMorph II Rastgele Mutagenezi Takımı </td><td> Agilent Technologies </td><td> 200500 </td></tr><tr><td> Kapaklı 96 Peki, düz tabanlı microtiter Plaka Temizle </td><td> BD Vacutainer Labware Tıp </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96 Peki Nonskirted PCR Tabaklar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td> Salıncak-kepçe Rotor </td><td> Eppendorf </td><td> A-2-DWP </td></tr><tr><td> Ampisilin Sodyum Tuz </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td></tr><tr><td> Kloramfenikol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP904 </td&gt; </tr><tr><td> Arabinoz </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> pBAD24 ifade vektörünün </td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> pBAD33 ifade vektörünün </td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

Yönlendirilmiş evrim doğada protein ile ilişkili olmayan belirli özelliklerini elde etmek için mühendislik proteinleri için doğal seleksiyon yararlanmak için bir yöntem olarak tanımlanır. Edebiyat başarıyla moleküler özgüllüğü ve kataliz 1 değiştirmek için yönlendirilmiş evrim uygulanmasına ilişkin sayısız örnekler vermiştir. Yerine moleküler mühendislik için daha rasyonel tabanlı yaklaşımların yönlendirilmiş evrim kullanan birincil avantajı 2 taranabilir varyantların hacmi ve çeşitliliği ile ilgilidir. Yönlendirilmiş evrim olası bir uygulaması gibi endolysins gibi bacteriolytic enzimler, iyileştirilmesi yapısal kararlılık gerektirir. Kodlamak ve döl virionlar ev sahibi hücre parçalama ve kurtuluş sonuçlanan, bakterilerin peptidoglikan (yani hücre duvarı) kritik bir kovalent bağ hidrolize endolysins ifade bakteriyofaj. Özellikle, bu enzimler dışsal Yatkınlık için lizis ikna yeteneğine sahipfaj yokluğunda ve ayrıca ible bakteriler, in vitro ve bunların terapötik potansiyel 3-5 için in vivo olarak doğrulanmıştır. Bizim yönlendirilmiş evrim çalışmanın konusu PlyCA ve PlyCB alt birimlerinin 6 oluşur PlyC endolysin, içerir. Saflaştırıldı ve dışsal olarak eklendiğinde, PlyC holoenzyme birkaç saniye içinde grubu streptokoklar (GAS) yanı sıra, başka streptokokal grupları lysis oluşumunu ve ayrıca GAZ 7 karşı in vivo olarak doğrulanmıştır. Anlamlı, yüksek sıcaklıklarda inkübasyon sonrası rezidüel enzim kinetiği izlenmesi PlyC Bu enzimin ek geliştirme sınırlayabilir kısa bir terapötik raf ömrü, düşündüren, 45 ° C&#39;de aniden litik aktivite kaybeder o ayrı kanıt sağlar. Daha ileri çalışmalar PlyCB altbirim kararlı iken, termal kararlılık eksikliği ancak PlyCA alt ünitesi için gözlenen açığa kadar ~ 90 ° C (yayınlanmamış gözlem). PlyC ek olarak, s varendolysins arasında termolabil doğasını açıklamak literatürde everal örnekler. Örneğin, Staphylococcus aureus endolysin LysK ve Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 ve Pal 42 kendiliğinden etkinlik kaybetmek ° C, 43.5 ° C ila 50.2 ° C, sırasıyla 8-10. Belirli bir sistem içinde mevcut sıcaklık için bir kimyasal reaksiyon oranı ile ilgilidir Arrhenius denklemi göre, termostabilite bir artış raf ömrü 11 bir artış ile ilişkili olacaktır. Bu amaçla, yönlendirilmiş evrim doğada çeşitli moleküllerin termal aktivite değiştirmek için yararlı bir araç olduğu gösterilmiştir, ancak bu özel teknoloji bacteriolytic enzimlerin çalışması için başarıyla yararlanan olmuştur asla. Aynı şekilde, antimikrobiyaller bu özel sınıfın yapısal stabilite ilerliyor başarı hesapları tamamen varolmayan vardır. Bu videoda, biz bir hata-pr kullanan bir roman metodoloji istihdambir DNA polimeraz enzim kinetik stabilite artışı (Şekil 1) ile bağlantılıdır PlyC streptokok endolysin arasında PlyCA alt ünitesine mutasyonları tanımlamak için bir 96 oyuklu plaka formatı kullanılarak iyileştirilmiş bir tarama işlemi takip eder. Rastgele mutajenez sadece bir tur sonra Sonuçlar metodolojisi yüksek sıcaklık tedavi sonrası vahşi tip (WT) PlyC kıyasla iki kat daha fazla rezidüel aktivitesi korumak PlyC türevlerini üreten düşündürmektedir.

Rastgele mutajenez ilk turun bitiminde, 6.000 &#39;den fazla PlyC mutantlar tarandı ve potansiyel olarak artan ısıl davranışı ile 35 mutantlar toplam tanımlanan seçilmiş ve dizi analizleri yapıldı. Tablo I de özetlenmiştir genomik analizi, anlaşılacağı 35 kişide, tahlil tarafından tanımlanan yanlış pozitif karşılık gelen çeviri seviyesinde WT PlyCA sekanslar içerdiği yapıların 7 o. Kalan 28 adayların, mutasyon aralığı, 1&#39;den biz hedeflediğiniz 2-3 nükleotid mutasyonu aralığında idi plyCA gen, başına 2.75 nükleotidlerin ortalama bir mutasyon oranı ile 6 nükleotid mutasyonu oldu. Translasyon düzeyinde, özellikle bu nükleotit mutasyon frekans aralığı ve polipeptid PlyCA başına 1,9 amino asidin mutasyonlarının, bir ortalama mutasyon oranı ile, 1 ila 5 amino asit, bir amino asit mutasyon dizi elde edilmiştir. En az bir amino asit ile Mutat 28 adaylarıniyon, bu mutant yapıların dört rasgele yönlendirilmiş evrim metodoloji kapsamlı bir eleme süreci gerçekten düzgün olduğunu doğrulamak için daha ileri karakterizasyon için seçilmiştir. Mutant PlyC enzimler 6-7 önceden tarif edildiği gibi SDS-PAGE analizine göre&gt;% 95 homojen bir hale edildi. WT PlyC ve dört PlyC mutant her enzim kinetikleri çeşitli yükseltilmiş sıcaklıklarda enzimler inkübe sonra eşit molar konsantrasyonlarda karakterize edilmiştir. Etkinlik 20 dakika için 600 nm, her 15 saniyede bir optik yoğunluk ölçülerek D471 gazın eklenmesinden sonra izlendi. Etkinlik ısı inkübasyondan sonra enzimin maksimum hızının kalıntı olarak tanımlanmıştır. Rastgele ileri karakterizasyonu için seçilen dört aday ki, mutant 29C3 en gelişmiş termal davranış gösterdi. Kuluçka ve PBS pH 7.2 &#39;de etkinlik için assaying ise WT PlyC ve 29C3 ve termal davranışları farklı sıcaklıkta araştırılmıştır80 nM ve 40 nM konsantrasyonlarda sırasıyla. 45-50 ° C&#39;de inkübasyon deneyleri (Şekil 3) örneklerinin 120 ul toplam hacim içinde bir ince duvarlı 96 PCR plaka içinde inkübe edildi bir PCR gerçekleştirilmiştir. 35 ° C, 40 ° C ve 45 ° C kuluçka deneylerden (Şekil 4 ve 5) örnek 1.3 ml toplam hacim içinde bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde inkübe edildi bir ısıtma bloğu içinde yapıldı. Tüm deneyler, kopyalardaki yapılmıştır. WT PlyC ve 29C3 oda sıcaklığında (25 ° C) Şekil 3&#39;te barlar ilk seti tasvir. Kinetik stabilite açısından anlamlı fark gösterdi Bununla birlikte, 45-50 arasındaki sıcaklıklarda 30 dakika ° C de bir kısa süreli inkübasyondan sonra, 29C3 faaliyeti her bir sıcaklık noktasında oluşturmak WT spesifik etkinlik önemli ölçüde daha büyük olmuştur. Örneğin, WT PlyC 45.2 az aktivitesinde% 44 kayıp görüntülenir° C iken, 29C3, aynı sıcaklıkta aktivitesinde sadece% 2&#39;lik bir kayıp gösterdi. WT PlyC ve 29C3 hem de kalıntı aktivitesi göre uzun süreli inkübasyondan çalışmalar ayrıca 35 de yapıldı ° C ve 40 ° C&#39;de 24 saat ve 48 saat zaman noktalarında kalıntı aktivitesinin ölçümü içeren. 35 ° C&#39;de, 29C3% 41 görüntülenir ve 24. WT PlyC ve 48 saat inkübasyon süresi noktaları, sırasıyla (Şekil 4a) daha 176% daha yüksek aktivite. 40 ° C&#39;de, 29C3% 28 görüntülenir ve 24. WT PlyC ve 48 saat inkübasyon süresi noktaları, sırasıyla (Şekil 4b) den% 107 daha yüksek etkinlik. WT PlyC ve 29C3 ve kalıntı aktivitesi ayrıca, 45 3 saat arasında bir toplam için her 20 dakikada ° C&#39;de takip edilmiştir WT PlyC sadece 29C3% 46 aktivite korumak için mümkün iken bu sıcaklıkta 3 saat inkübasyondan sonra% 21 aktivite korumak başardı. WT PlyC ve 29C3 için yarılanma ömrü (t 1/2) sırasıyla 67 ve 147 dk idi, önermek<html> sönme 29C3 45 ° C (Şekil 5) kinetik kararlılık içinde 2.2 kat artış vardır. <table border="1"><tbody><tr><td> Toplam Round 1 Adayları </td><td> 35 </td></tr><tr><td> WT PlyCA Sırası ile adaylar </td><td> 7 </td></tr><tr><td> ≥ 1 Amino Asit Mutasyon ile adaylar </td><td> 28 </td></tr><tr><td> - Ortalama Nükleotid Mutasyon Oranı (nt / plyCA) </td><td> 2.75 </td></tr><tr><td> - Nükleotid Mutasyon Aralığı (nt) </td><td> 1-6 </td></tr><tr><td> - Ortalama Amino Asit Mutasyon Oranı (AA / PlyCA) </td><td> 1.9 </td></tr><tr><td> - Amino Asit Mutasyon Aralığı (AA) </td><td> 1-5 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Aday Havuzu Genomik Analizler. pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Yönlendirilmiş evrim test metodolojisine. Yönlendirilmiş evrim, bir ilk tur için WT PlyC olurdu kurşun enzimi ile başlar. PlyCA gen rastgele tarafsız nükleotid mutasyonları içeren PlyC mutantlar bir kütüphane, daha sonra bir hata eğilimli DNA polimeraz tarafından inşa ifade vektörü pBAD24 klonlanmış ve E. dönüşür coli zaten pBAD33 içeren DH5α süzün:. plyCB Bireysel transformantlar 96 oyuklu plaka çok iyi kendi özel inoküle edilir. Kapsamlı bir tarama süreci sayesinde, olmayan bir izin sıcaklığında inkübasyon sonrasında katalitik olarak aktif olan bireysel PlyC mutantlar geliştirilmiş kinetik kararlılık ile mutantlar olarak sınıflandırılır. Dolayısıyla rastgele mutagenez sonraki turda kurşun enzim haline olacak en ilerledi termal davranış gösteren Theconstruct. Genel olarak, randomize üç tam tur vardırm mutagenez gelişti termal davranışları ile bacteriolytic molekülünde edilen DNA shuffling izledi. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> Şekil 2. Yönlendirilmiş evrim deneyi için 96 oyuklu plaka şablonları. Optimum ısıtma koşullarının belirlenmesi sırasında mikrotiter plate şematik (Şekil 2a) mikrotitre plakanın her satıra tek bir ebeveyn WT PlyC klon inokülasyon oluşur. Mutant tarama (Şekil 2b) ve mikro-titer plaka şematik bir eşsiz ebeveyn WT PlyC klon ile sütun 1, her sıra inokülasyon hem de ayrı bir PlyC mutant klon ile sütun 2-12 her çukurun inokülasyon oluşur. Wells A1-D1 eş olumlu ebeveyn denetimleri için belirlenmiş olanWT PlyC arasında nsist olmayan izin verilen sıcaklık inkübasyon maruz kalmaz oluşturur. Wells E1-H1 olmayan izin verilen sıcaklık inkübasyon maruz WT PlyC yapılardan oluşan olumsuz ebeveyn denetimleri için belirlenir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> Şekil 3,. WT PlyC ve 29C3 karşılaştırarak Kalıntı etkinlik kinetik analizi. Enzimler, homojen bir hale ve oda sıcaklığında ya da az ya da 45-50 ° C arasında değişen bir sıcaklık gradyanı eşit molar konsantrasyonlarda bir PCR içinde 30 dakika süre ile inkübe edildi ve Enzimatik aktivite belirli sıcaklık inkübasyondan sonra görüntülenen maksimum hız ile ilişkilidir. 25 ° C&#39;de ve 47.7 ° C&#39;de hariç olmak üzere, bir p-değeri &lt;0.05 ile ilişkili her bir sıcaklıkta WT ve 29C3 arasında faaliyet varyasyonu. Tüm veriler ortalama ± üç bağımsız deneyin SEM olarak bildirilmiştir. </p&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> Şekil 4. 35 29C3 WT PlyC göre Kalıntı etkinlik kinetik analiz ° C ve 40 ° saflaştırılmış WT PlyC ve 29C3 C. eşit molar konsantrasyonlarda 35 ° C&#39;de (Şekil 4a) veya 40 ° C (Şekil 4b) bir ısıtma bloğu içinde inkübe edildi. Kalıntı enzim aktivitesi, 24 ve 48 saat zaman noktalarında ölçüldü. Her yapı tarafından görüntülenen aktivite zaman noktasında sıfır görüntülenen maksimum hıza göre normalize edildi. Her sıcaklık ve zaman noktada WT ve 29C3 arasında faaliyet varyasyon bir p-değeri &lt;0.05 korelasyon gösteriyordu. Tüm veriler ortalama ± üç bağımsız deneyin SEM olarak bildirilmiştir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> Şekil 5,. Karşılaştırarak rezidüel aktivitesi kinetik analizi45 29C3 WT PlyC ° saflaştırılmış WT PlyC ve 29C3 C. eşit molar konsantrasyonlarda 45 ° C ve kalıntı enzim aktivitesi, 3 saat boyunca her 20 dakikada bir ölçüldü ısıtma bloğu içinde inkübe edildi. Her yapı tarafından görüntülenen aktivite zaman noktasında sıfır görüntülenen maksimum hıza göre normalize edildi. 20 dak veri noktalarının haricinde, her zaman noktasında WT ve 29C3 arasında faaliyet varyasyonun bir p-değeri &lt;0.05 korelasyon gösteriyordu. Tüm veriler ortalama ± üç bağımsız deneyin SEM olarak bildirilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes at JoVE.com

Termostabil Bakteriyolitik Enzimlerin Yönlendirilmiş Evrimi için Yeni Bir Tarama Yöntemi | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

a-new-screening-method-for-directed-evolution-thermostable

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Natural Selection

SCIENTISTS IN ACTION

17.8K Görüntüleme.  University of Maryland. Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.

Video: A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Here, we present a protocol to obtain adaptive laboratory evolution of microorganisms under conditions using chemostat culture. Also, genomic analysis of the evolved strain is discussed.

Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genetik

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase variants that have more stringent specificity than the parental enzyme. The protocol requires the creation of a library of expression selection cassettes (ESCs) for variants of the REase, ideally with variability in positions likely to affect DNA binding. The ESC is flanked on one side by a sequence for the restriction site activity desired and a biotin tag and on the other side by a restriction site for the undesired activity and a primer annealing site. The ESCs are transcribed and translated in a water-in-oil emulsion, in conditions that make the presence of more than one DNA molecule per droplet unlikely. Therefore, the DNA in each cassette molecule is subjected only to the activity of the translated, encoded enzyme. REase variants of the desired specificity remove the biotin tag but not the primer annealing site. After breaking the emulsion, the DNA molecules are subjected to a biotin pulldown, and only those in the supernatant are retained. This step assures that only ESCs for variants that have not lost the desired activity are retained. These DNA molecules are then subjected to a first PCR reaction. Cleavage in the undesired sequence cuts off the primer binding site for one of the primers. Therefore, PCR amplifies only ESCs from droplets without the undesired activity. A second PCR reaction is then carried out to reintroduce the restriction site for the desired specificity and the biotin tag, so that the selection step can be reiterated. Selected open reading frames can be overexpressed in bacterial cells that also express the cognate methyltransferase of the parental REase, because the newly evolved REase targets only a subset of the methyltransferase target sites.

Restriction endonucleases with new sequence specificity can be developed from enzymes recognizing a partially degenerate sequence. Here we provide a detailed protocol that we successfully used to alter the sequence specificity of NlaIV enzyme. Key ingredients of the protocol are the in vitro compartmentalization of the transcription/translation reaction and selection of variants with new sequence specificities.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion cofactors triggering a dimer-dodecamer transition. Upon metal ion binding, several structural modifications occur in the active site and at the interaction interface, shaping dimers to promote the self-assembly. To observe such modifications, stable oligomers must be isolated prior to structural study. Reported here is a method that allows the purification of stable dodecamers and dimers of TmPep1050, an M42 aminopeptidase of T. maritima, and their structure determination by X-ray crystallography. Dimers were prepared from dodecamers by removing metal ions with a chelating agent. Without their&#160;cofactor, dodecamers became less stable and were fully dissociated upon heating. The oligomeric structures were solved by the straightforward molecular replacement approach. To illustrate the methodology, the structure of a TmPep1050 variant, totally impaired in metal ion binding, is presented showing no further breakdown of dimers to monomers.

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

This protocol has been developed to study the dimer-dodecamer transition of TmPep1050, an M42 aminopeptidase, at the structural level. It is a straightforward pipeline starting from protein purification to X-ray data processing. Crystallogenesis, data set indexation, and molecular replacement have been emphasized through a case of study, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Biyokimya

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biyoloji

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

Roman Biyotinilasyon Enzimlerinin Seçimi için Bakteriyel Peptit Gösterimi

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

<meta charset="utf8"></head><body>Düşük Maliyetli Termomikserler Kullanılarak Termofil Adaptasyonu için Deneysel Evrim Protokolü

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures is a key requirement, not only for understanding fundamental evolutionary processes but also for developing S. acidocaldarius as a chassis for bioengineering. One major obstacle to conducting experimental evolution with thermophiles is the expense of equipment maintenance and energy usage of traditional incubators for high-temperature growth. To address this challenge, a comprehensive experimental protocol for conducting experimental evolution in S. acidocaldarius is presented, utilizing low-cost and energy-efficient bench-top thermomixers. The protocol involves a batch culture technique with relatively small volumes (1.5 mL), enabling tracking of adaptation in multiple independent lineages. This method is easily scalable through the use of additional thermomixers. Such an approach increases the accessibility of S. acidocaldarius as a model system by reducing both initial investment and ongoing costs associated with experimental investigations. Moreover, the technique is transferable to other microbial systems for exploring adaptation to diverse environmental conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Termofilik Evrimi Keşfetmek İçin Yenilikçi Teknikler Kullanarak Mikrop Adaptasyonunu Anlamak

Here, we present an experimental evolution protocol for adaptation in thermophiles utilizing low-cost, energy-efficient bench-top thermomixers as incubators. The technique is demonstrated through the characterization of temperature adaptation in Sulfolobus acidocaldarius, an archaeon with an optimal growth temperature of 75 &#176;C.

Yaşamın Uç Noktalarında Adaptasyon: Ekstremofil Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ile Deneysel Evrim

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler