著者は、技術支援のためにEmilija Renkeとジャネットゆうに感謝したいと思います。 DCNは、米国国防総省（DR080205、DM102823、OR09055、そしてOR090059）からの助成金によってサポートされています。 RDHは、メリーランド州農業試験場及び細胞分子生物学におけるNIHの訓練助成金からの助成金によってサポートされています。

1。最適な加熱条件を決定まず、1つは、実験的アッセイにおける加熱工程に使用する最適な培養温度と時間を決定する必要があります。当社PlyCモデルのために、それは注意することが重要であること、E.大腸菌別個の発現プラスミド上plyCAとplyCB遺伝子で同時形質転換は、完全に機能PlyCホロ6を形成することが示されている。 96ウェルマイクロタイタープレートの準備だけでなく、細胞増殖条件およびその後のレプリカメッキ技術は、文献12から16で提供される例から適合させられました。 30分のインキュベーション時間は、以前の熱不活性化実験の結果として、このアッセイのために適しているであろう生理的な温度（未発表データ）を超える環境での短期のインキュベーションの間に活動の急速な損失が決まります。 PlyCのための最適なインキュベーション温度は、次の手順で明らかにした： <ol><li>トランコンピにplyCA（アンプR）：発現構築pBAD24をsform 大腸菌株DH5αpBAD33：plyCB CM（R）。 </li><li>アンピシリン（100μg/ ml）を、クロラムフェニコール（35μg/ ml）のを補ったルリア - ベルターニ（LB）寒天プレート上で形質転換体をプレート。一晩37℃のプレートをインキュベート</li><li>滅菌爪楊枝で、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを添加したLB 200μlを含む滅菌、クリア、平底96ウェル、蓋付きマイクロタイタープレートのウェル（ 図2a）の各行に個々のコロニーを接種する。 </li><li>しっかりと37℃の振盪インキュベーターで96ウェルマイクロタイタープレートを配置し、300rpmで細菌が一晩増殖。 </li><li> 37℃の振盪インキュベーターとレプリカプレートから、次のように新しい96ウェルマイクロタイタープレートに96ウェルマイクロタイタープレートを取得します。 <ol class="lalpha"><li>アンピシリンとクロラムフェニコールを添加したLBの180μlを加えレプリカプレートの各ウェルに。 </li><li>原版からレプリカプレート内の対応するウェルに菌の20μlを移します。これは、〜の初期OD 600が 0.5になるはずです。 </li></ol></li><li>しっかりと37℃の振盪インキュベーターにレプリカプレートを配置し、inductantを追加し、300rpmで1時間静置します。のpBAD発現系の場合には、inductantは0.25％アラビノースです。他の発現系は、異なるinductantsが必要な場合があります。 °Cタンパク質の発現を可能にするために追加の4時間300rpmで振とうインキュベーターを振って37にバックプレートを置きます。発現レベルは、通常PlyCの10-20μgの間の範囲。 </li><li>タンパク質の発現が締結した後、96ウェルマイクロタイタープレートに適合スイングバケットローターを含んで冷却遠心機で96ウェルマイクロタイタープレートを配置することによって、レプリカプレートと細菌ペレットを取得します。室温で10分間、3000rpmで遠心分離します。</li><li>ゆっくり反転マイクロ​​タイタープレートによってメディア上清を除去し、穏やかにメディアをデカントする。 </li><li>各ウェルにB-PER II細菌タンパク質抽出試薬の50μlを加えて細胞を溶解する。 20分間室温で静置します。 </li><li>生理食塩水（PBS）pH7.2のリン酸緩衝の70μlを添加し、各ウェルに120μlの音量を上げる。 </li><li>ペレットで10分間4℃で冷却遠心機のC、3,000 rpmでプレートを回転させて不溶性の細胞残屑。 </li><li> 96ウェルサーモプレートの対応するウェルに可溶性の粗ライセート110μLを。 </li><li>所定のインキュベーション時間として30分を使用して、現在15〜20℃にまたがる広い傾斜温度範囲に96ウェルサーモプレートに常駐している水溶性の溶解物を公開なお、目標は、特定の酵素が&gt; 95％の触媒活性を失うどんな温度で判断することです。 </li><li>インキュベーション後、96ウェルをインキュベートサーマルサイクラーは、5分間、4℃でプレートと最後の96ウェルマイクロタイタープレート内の対応だけでなく場所に96ウェルサーモプレートから水溶性の溶解液100μlを移す。 </li><li> 12チャンネルmultipipettorで、各ウェルへのガス株D471の100μlを添加する。注意、D471細胞はもともと一晩培養物から凍結乾燥し、約2.0のOD 600を取得するためにPBS pH7.2で再懸濁する。 </li><li>直ちにマイクロプレート分光光度計では、96ウェルプレートを配置し、20分間OD 600が毎回 15秒を測定することにより、酵素反応速度を監視します。光学密度（ΔOD≤0.1）の変化を欠いていた井戸に相当する最低温度のインキュベーションは、非許容温度として定義されています。 </li></ol>広い温度画面が非許容温度を識別するために実行された後、上記の手順は、温度のより狭い範囲（5℃-10℃）を解明するために繰り返すことができる目的の酵素のための正確な非許容温度。なお、このアッセイにおいて同定非許容温度では、ボリュームの違いに起因する他の手段、濃度などによって解明融解温度とは異なる場合があります 2。変異体ライブラリーを生成する上映される変異体ライブラリーの作成 ​​がランダムに次のようにGeneMorph IIのランダム突然変異誘発キットを使用してplyCA遺伝子の最小限のヌクレオチドバイアスでエラーが発生しやすいDNAポリメラーゼによって変異を組み込ん含まれます。 <ol><li> 5 &#39;および3&#39; plyCA遺伝子の両端にある選択肢の制限部位を有する55から72℃の間で同様の融解温度（Tm）を有するヌクレオチドプライマーを設計します。 </li><li>所望の突然変異率はplyCAあたり2〜3個のヌクレオチド（1.4キロバイト）であるので、PCR反応成分の濃度だけでなく、低変異fのメーカーが推奨するサーマルサイクラー条件を使用requencies（kbあたり0から4.5）。 </li><li>発現ベクターpBAD24に変異誘発plyCA遺伝子をクローニングします。 </li><li>アンピシリンとクロラムフェニコールを添加したLB寒天プレート上plyCB背景とプレートの形質転換：DH5αpBAD33にコンストラクトを変換します。 </li><li> WT plyCA遺伝子を含む発現ベクターpBAD24とplyCB：さらに、DH5αpBAD33を変革し、プレート。このプレートからコロニーがスクリーニング中にコントロールとして機能します。 </li></ol> 3。 96ウェルマイクロタイタープレートの調製と細胞増殖条件<ol><li>アンピシリンとクロラムフェニコールを添加したLB200μlの96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを埋める。 </li><li>マイクロタイタープレートの模式図（ 図2b）に続いて、慎重に滅菌爪楊枝で一晩寒天プレートから個々のコロニーを選択し、96ウェルマイクロタイターPLAの井戸と称する中の細菌を接種するTE。それも1つだけのコロニーを接種されていることを確認することが不可欠である。 </li><li> 37℃で一晩、300rpmでしっかりと固定された96ウェルマイクロタイタープレートを振る℃に</li></ol> 4。レプリカメッキ、タンパク質発現誘導とライセートの調製<ol><li> 1修正して &quot;最適な加熱条件を決定&quot;というタイトルのセクションからのステップ1.5から1.11に従ってください。レプリカめっき工程が締結した後、4℃の時に原版を保管してください。 </li><li>ステップ1.11の後、陽性コントロールウェルA1-D1を除く96ウェルサーモプレートの対応するウェルに可溶の粗溶解物の転送110μlの。ポジティブコントロール溶解物（加熱されないすなわち溶解物）、氷の上で実験や店舗のための最終的なアッセイプレートとして使用する新しい96ウェルマイクロタイタープレート内の対応するウェルへの溶解物の転送を100μlにつきまして。 </li></ol> 5。可溶性ライセート熱処理<ol><li>現在、ステップ1で決定し最適化された非寛容な培養温度で30分間、サーモで96ウェルサーモプレートに閉じ込め陰性コントロール及び変異型可溶性溶解物を加熱する。 </li><li>非許容温度でインキュベートした後、5分間、4℃で96ウェルサーモプレートをインキュベートする。 </li><li>すでに陽性対照可溶性溶解物を含む最終96ウェルマイクロタイターアッセイプレートでの同一の井戸の場所に96ウェルサーモプレートから水溶性の溶解液100μlを移す。 </li><li> 12チャンネルmultipipettorで、各ウェルへのガス株D471の100μlを添加する。直ちにマイクロプレート分光光度計にプレートを置きます。 </li><li> 20分間OD 600が毎15秒を測定することにより、酵素反応速度を監視します。 <ol class="lalpha"><li>進行した熱挙動とPlyCバリアントは秒未満で900秒で50パーセント独自の光学密度を低下させることができる構築物として定義されています非許容温度。また、陽性対照（ すなわち、非加熱、WT PlyC）WT触媒活性を表示する必要がある（T 1/2≤100秒）とネガティブコントロール（ すなわち 、WT PlyCを加熱された）活性を欠いてある必要があります。 </li></ol></li><li>とPlyCバリアントが熱挙動が特定された進行した後、アンピシリンとクロラムフェニコールを補った新鮮なLB培地に興味のある変異体によく、特​​定の個人から4℃と接種細菌に格納されているオリジナルのプレートを取得します。 37℃で一晩接種を育てる℃に</li><li>抽出し、精製したプラスミドDNAを培養液から、その後PlyCAに強化された熱挙動を推測するヌクレオチド変異を同定するために、配列決定のために提出してください。また、-80℃で10％グリセロールおよび店舗℃でさらに使用するために一晩培養した培養液から少量を補足するものです。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

図1に概説このプロトコルは、1は、任意の溶菌酵素の熱安定性を高めるために定向進化を利用することを可能にする96ウェルマイクロタイタープレートの方法論を提示する。エラーが発生しやすいDNAポリメラーゼを使用することにより、人は、ジスルフィド架橋、改善生成する疎水性相互作用を一般的に静増加から成る分子の再編によるもので興味のある翻訳溶菌分子全体の運動の安定性を増加させるランダム変異を導入することができます分子充填、表面電荷ネットワークまたはより高いオリゴマー形成状態17から18の補強の強化改造。塩基変異の導入後、広範なスクリーニング方法は、その後、熱的に有益な変異を同定するために使用された。ここで紹介する代表的な結果は、ランダム突然変異誘発の1ラウンドに基づいていた。現実には、それがあることが示唆されているDNAシャッフリング続いランダム突然変異の少なくとも3つの連続したラウンド、鉛酵素として最も堅牢な変異体を用いて各々は、定向進化熱挙動の研究、これらのタイプ2に適しています。 このプロトコルは動力学的安定性を増大させる変異を特定しますが、これらの変異体は必ずしも増加した熱安定性を持っていないことを理解することが重要です。それは高温で、その構造を保持する能力を持っているときに分子が熱安定性と見なされます。しかし、提示されたアッセイでは、変異体溶解液の残存活性は、彼らが最初に熱処理工程中でインキュベートしたので、一つは19フォールディングではなく、強化された熱安定性を促進する変異を選択することができるのと同じ温度でアッセイされていません。我々は、熱安定性の指標として、熱挙動を外挿すれていますが、真の熱安定性は生物物理学によって経験的に測定する必要がありますこのような円偏光二色性（CD）、示差走査熱量測定（DSC）および示差走査蛍光定量（DSF）としてiCALメソッド。 CDやDSFの実験から予備的なデータは提示方法論から同定されたいくつかの候補が実際に進行した熱安定性を（データは示されていない）が表示されないことを示唆している。 ここで紹介する方法はPlyCに増加し熱挙動を実装するための固有のものですが、これと同じ方法は、さらに、例えば、緩衝液、突然変異率、加熱条件および発現系などの変数にいくつかのマイナーな変更を加えて他の溶菌酵素に熱活性を増強するために用いることができる。このアッセイに関連する一つの重要な変数は、エラーを起こしやすいDNAポリメラーゼのヌクレオチド変異率に関するものである。我々は、この特定の酵素を示唆する実験的証拠に起因する当社の定向進化アッセイでエラーが発生しやすいMutazyme II DNAポリメラーゼが持つバイアスの最低額を表示し使用することにしましたヌクレオチドは無作為にそのようなヒドロキシルアミン、ミューテータEの使用など、他のランダムな突然変異誘発技術と比較して、目的の遺伝子に組み込まれているに関して大腸菌株および他のエラーが発生しやすいのDNA polyermases 20。一般的に、低い突然変異率は二つの理由からより望ましい傾向にある。まず、タンパク質へのエンジニアリング熱安定性は、典型的には、比較的少数のアミノ酸置換で構成されています。高い突然変異率が決定的に構造上のミスフォールディングおよび機能的相違をもたらすことができ、特定の分子への劇的な構造変化を引き起こす可能性があります。例えば、グリシン、プロリン残基を組み込むことは、αヘリックス二次構造21を混乱させることができます。第二に、高い塩基変異率は、生物学的に不活性である分子を切り捨て、その結果、早期停止コドンを組み込むことの可能性を高める。一般的に、低い突然変異率が好ましいためaccumulの低いエラー率の結果適応変異のationより高い突然変異率が中立または有害な突然変異22を生成しながら。 ランダム突然変異誘発のラウンドごとに、1が最適化しなければならないもう一つの重要な変数は、スクリーニングプロセス中に使用されるインキュベーション温度を必要とする。実験的な非許容温度の選択は比較的困難である。我々は、最初に10歳の培養温度を用い℃、PlyCの非許容温度よりも高いしかし3000変異株をスクリーニングした後、我々がどんな有利な変異を同定することができませんでした。定向進化の方法論を順次添加剤の効果を持っている有益なアミノ酸置換を識別で構成されて念頭に置いて、それは偽陽性を生成できる可能性が増加した場合であってもそれほど厳しく温度はスクリーニングプロセス中に使用されるべきであることを決定した。このように、我々は唯一の非permiss上記数度あったインキュベーション温度を使用アイブ温度と再スクリーニングし、選択した候補者は、偽陽性を除外する。 我々はあまりにも温帯ではありませんでした（≤1℃最低非許容温度よりも高い）、逆にあまりにも過酷ではない（≥最低非許容温度より5℃以上）培養温度を利用することを決めた。我々は、この特定のアッセイで使用することを決めた理想的な温度は適度な2℃で実験的に決定され、非許容温度よりも高い。適度なインキュベーション温度を使用するときにあまりにも軽度である温度を選択することは、我々が観察した約20％（ 表I）よりもはるかに高い偽陽性識別率になります。さらに、あまりにも過酷である培養温度を用いて、最終的には大幅に強化された熱挙動と突然変異体を同定することができないことにつながる可能性があります。例えば、≥5の培養温度を用い℃で識別することができないことに終わっていただろう有望29C3変異ならびにスクリーニングの最初のラウンド中に選択した他の候補者の大半。 合計では、強化された運動安定性を獲得するためのエンジニアリング溶菌酵素のためのプロトコルを提供する。また、この同じアッセイは、加熱処理を行わない場合、触媒活性を向上させる変異をスクリーニングするために使用することができます。触媒活性と熱安定性の両方を増強しても、治療の酵素が直面している重要な発達のハードルである。このプロトコルの詳細はエンドリシンPlyCを特定できますが、方法論はわずかな変化を持つ任意の溶菌酵素に適合させることができます。私たちはかなりの大きさの分子の熱安定性の増加を生成する変異の実装と同定、その結果、アッセイのその機能を検証突然変異誘発の最初のラウンドからの予備結果を発表した。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> B-PER II細菌タンパク質抽出試薬</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 78260 </td></tr><tr><td> GeneMorph IIのランダム突然変異誘発キット</td><td>アジレント·テクノロジー</td><td> 200500 </td></tr><tr><td>ふたが付いている96ウェル、平底マイクロタイタープレートをクリア</td><td> BDバキュテイナー実験器具メディカル</td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96ウェルPCRプレートNonskir​​ted </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td>スイングバケットローター</td><td>エッペンドルフ</td><td> -2-DWP </td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP1760 </td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP904 </TD&gt; </tr><tr><td>アラビノース</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> pBAD24発現ベクター</td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> pBAD33発現ベクター</td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

向進化は自然の中でタンパク質に関連付けられていない特定のプロパティを取得するためにタンパク質を設計するために自然淘汰を活用するためのメソッドとして定義されます。文学は正常分子特異性と触媒1を変更するために定向進化の実施について多数の例を提供してきました。分子工学のための指向性進化の代わりに、より合理的なベースのアプローチを利用する主な利点は、2をスクリーニングすることができる変異体の量と多様性に関連する。定向進化の一つの可能​​なアプリケーションは、エンドリシンとして溶菌酵素の構造安定性を改善することを含む。エンコードと子孫ビリオンの宿主細胞の溶解および解放の結果、細菌のペプチドグリカン（ すなわち細胞壁）における重要な共有結合を加水分解するエンドリシンを表現するバクテリオファージ。特筆すべきは、これらの酵素は、外因susceptする溶解を誘導する能力を有し、ible細菌ファージの不存在下で、さらには、in vitroおよびそれらの治療法としての可能性3-5 in vivoの両方で検証されています。私たちの指向性進化の研究の主題はPlyCAとPlyCBサブユニット6から構成されているPlyCエンドリシンを伴う。精製し、外因性添加する場合には、PlyCホロ酵素は、ほんの数秒で群レンサ球菌（GAS）だけでなく、他の連鎖球菌グループを溶解し、さらにガス7に対するin vivoで検証されています。かなり、高温のインキュベーション後の残留酵素反応速度を監視することPlyCこの酵素の追加開発が制限される場合があります短い治療の貯蔵寿命を、示唆し、45℃で急激に溶解活性を失うという明確な証拠を提供しています。さらなる研究がPlyCBサブユニットが安定しているのに対し、熱安定性の欠如が唯一PlyCAサブユニットで観察されるまで明らか〜90℃（未発表データ）。 PlyCに加えて、sがあるエンドリシンの熱に不安定な性質を記述する文献でエベラル例。例えば、 黄色ブドウ球菌エンドリシンLysKと肺炎球菌エンドリシンCPL-1とパルは42で自発的に活性を失う℃、43.5℃、50.2℃、それぞれ8月10日 。特定のシステムに存在する温度に、化学反応の速度を関連付けるアレニウスの式によると、熱安定性の増加は、棚の平均余命11の増加と相関する。この目的に向かって、監督の進化は自然の中で様々な分子の熱活性を変化させるための有用なツールであることが示されているが、この特定の技術は、溶菌酵素の研究のためにこの脆弱性を悪用されていませんでした。同様に、抗菌剤のこの特定のクラスの構造的安定性を進行することの成功したアカウントが完全に存在しないに等しい。このビデオでは、エラー-prを使って斬新な手法を採用する1 DNAポリメラーゼ酵素動力学的安定性の増加（ 図1）に相関PlyCレンサ球菌エンドリシンのPlyCAサブユニットに変異を同定するために、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットを使用して最適化されたスクリーニングプロセスが続く。ランダム突然変異誘発のちょうど1ラウンド後の結果は、方法論は、高温処理後に野生型（WT）PlyCと比較すると倍以上の残存活性を保持Ply​​C変異体を生成することが示唆された。

ランダム突然変異誘発の第一ラウンドの結論では、6,000人以上PlyC変異体をスクリーニングし、潜在的に増加した熱挙動と35変異体の合計は、識別選択し、配列決定した。ゲノム解析は、 表Iにまとめたが、35候補者のことを示唆している、構築物7アッセイによって同定された誤検出に対応した翻訳のレベルでWT PlyCAシーケンスが含まれていました。残りの28候補のうち、変異の範囲は、我々がターゲットとされた2から3塩基変異の範囲内であったplyCA遺伝子、当たり2.75ヌクレオチドの平均変異率と1から6塩基の変異からだった。翻訳レベルで、この特定の塩基変異の範囲と頻度は、ポリペプチドPlyCAあたり1.9アミノ酸変異の平均変異率で、1〜5個のアミノ酸のアミノ酸変異の範囲が得られた。 少なくとも一つのアミノ酸mutatと28の候補これらの変異体の構築物のイオン、4はランダムに定向進化の方法論の広範なスクリーニングプロセスが実際に適切に機能していることを検証するためにさらなる特徴付けのために選ばれた。変異PlyC酵素は6月7日以前に説明したように、SDS-PAGE分析に基づいて、&gt; 95％の均一性まで精製した。 WT PlyCと4 PlyC各変異体の酵素反応速度論は、様々な高温で精製された酵素をインキュベートした後、等モル濃度で特徴づけられた。活動は20分ごとに15秒600nmでの光学密度を測定することにより、D471ガスを添加した後にモニターした。活動は熱のインキュベーション後の残存酵素最大速度として定義されていました。無作為にさらなる特徴付けのために選択された4つの候補のうち、変異29C3が最も強化された熱挙動を示した。インキュベートし、PBS中でpHは7.2で活性についてアッセイしながら、WT PlyCと29C3の熱挙動が異なる温度で調べた80 nMおよび40 nM濃度であった。 45から50℃の培養実験（ 図3）は、サンプルを120μlの総体積で薄肉の96ウェルサーモプレート中でインキュベートしたサーマルサイクラーで行った。 35℃、40℃と45℃のインキュベーション実験（ 図4および5）サンプルは1.3ミリリットルの総体積で1.5 mlマイクロチューブ中でインキュベートしたヒートブロックで行われた。全ての実験は3連で行った。 WT PlyCと29C3は、室温（25℃）、 図3のバーの最初のセットに描かれているの動安定性に有意差は認められなかったしかし、45から50の範囲の温度から30分°Cのための短期のインキュベーション後、29C3の活性は、各温度点で構築WTに比活性よりも実質的に大きくなった。たとえば、WT PlyCは45.2での活動の44％の損失を表示°Cの一方29C3は、同じ温度で活性がわずか2％の減少を示した。 WT PlyCと29C3両方の残存活性を比較した長期的インキュベーション研究は​​、さらに35℃で行ったCから40°C、24時間と48時間の時点において残存活性の測定を伴う。 （ 図4a）は、それぞれ、24および48時間のインキュベーションの時点で35℃で、29C3は41％を表示およびWT PlyCより176パーセントも高い活性を示す。 40℃、29C3は（ 図4b）は、それぞれ、24および48時間のインキュベーションの時点で、WT PlyCよりも28％と107％高い活性を示した。 WT PlyCと29C3の残存活性は、45℃で3時間、合計20分毎℃を監視したWT PlyCだけ29C3は46％の活性を保持することができたのに対し、この温度で​​3時間インキュベートした後、21％の活性を保持することができました。 WT PlyCと29C3用の半減期（t 1/2）は、それぞれ67と147分をお勧めしていた<html>ること29C3は45°C（ 図5）で、動力学的安定性は2.2倍に増加しています。 <table border="1"><tbody><tr><td>合計ラウンド1候補</td><td> 35 </td></tr><tr><td> WT PlyCAシーケンスを使用した候補</td><td> 7 </td></tr><tr><td> ≥1アミノ酸変異を持つ候補者</td><td> 28 </td></tr><tr><td> -平均塩基変異率（NT / plyCA） </td><td> 2.75 </td></tr><tr><td> - 塩基変異レンジ（NT） </td><td> 1月6日</td></tr><tr><td> - 平均アミノ酸変異率（AA / PlyCA） </td><td> 1.9 </td></tr><tr><td> - アミノ酸変異レンジ（AA） </td><td> 1月5日</td></tr></tbody></table> 表1。候補プールのゲノム解析。 pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; 図1。進化のアッセイ方法を指示した。向進化では、1は、最初のラウンドのためのWT PlyCなる鉛酵素で始まります。 plyCA遺伝子にランダム公平なヌクレオチドの変異を含むPlyC変異体のライブラリーを発現ベクターpBAD24にクローニングし、 大腸菌に形質転換し、エラーを起こしやすいDNAポリメラーゼによって構成され大腸菌はすでにpBAD33を含むDH5α株：plyCB個々の形質転換体を96ウェルマイクロタイタープレートのウェル独自の特定に接種する。広範なスクリーニングプロセスを通して、非許容温度でのインキュベーション後に触媒的に活性である個々のPlyC変異体は強化された動力学的安定性を有する変異体として分類されています。結果的にランダム突然変異誘発の次のラウンドのためのリード酵素となります最も進ん熱挙動を表示Theconstruct。全体的に、ランドセルの3つの完全なラウンドがありますメートル突然変異誘発は進化して熱挙動と溶菌分子中に得られたDNAシャフ続く。 <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> 図2。向進化アッセイのため、96ウェルマイクロタイタープレートのテンプレート。最適な加熱条件（ 図2a）を決定する際のマイクロタイタープレートの模式図は、マイクロタイタープレートの各行に単一の親WT PlyCクローンを接種することで構成されています。突然変異体スクリーニング（ 図2b）中にマイクロタイタープレートの模式図は、一意の親WT PlyCクローンと1列目の各ウェルに接種するだけでなく、異なるPlyC変異体クローンを持つ列2-12に各ウェルに接種することで構成されています。ウェルズA1-D1が共同ポジティブペアレンタルコントロール、用に指定されていますWT PlyCのNSISTは、非許容温度のインキュベーションにさらされていない構築。ウェルズE1-H1は、非許容温度のインキュベーションにさらされているWT PlyCコンストラクトから成る負ペアレンタルコントロール、用に指定されています<img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> 図3。 WT PlyCと29C3を比較残存活性動態解析。酵素均一になるまで精製し、どちら室温で等モル濃度で、または45から50の範囲の温度勾配でサーモで30分間℃でインキュベートした。酵素活性は、特定の温度のインキュベーション後に表示される最大速度と相関している。 25℃と47.7℃、p値に相関各温度でのWTと29C3間の活性の変化&lt;0.05は例外となります。すべてのデータは平均値±3つの独立した実験のSEMとして報告されます。 </p&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> 図4。 35℃29C3にWT PlyCを比較残存活性動態解析 WT PlyCと29C3の精製°Cから40°Cの等モル濃度は、35℃のヒートブロックに°C（ 図4a）または40°C（ 図4b）をインキュベートした。残存する酵素活性を24および48時間の時点で測定した。各コンストラクトによって表示される活動は、時刻ゼロで表示された最大速度に対して標準化した。それぞれの温度と時間の時点でWTと29C3間の活性の変化は、p値&lt;0.05に相関していた。すべてのデータは平均値±3つの独立した実験のSEMとして報告されます。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> 図5。比較残存活性動態解析WT PlyCと29C3の精製45℃29C3にWT PlyC℃の等モル濃度は、45℃のヒートブロックでインキュベート℃、残存酵素活性は3時間20分ごとに測定した。各コンストラクトによって表示される活動は、時刻ゼロで表示された最大速度に対して標準化した。 20分でデータ点を除いて、各時点でのWTと29C3間の活性の変化は、p値&lt;0.05に相関していた。すべてのデータは平均値±3つの独立した実験のSEMとして報告されます。

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耐熱性細菌分解酵素の指向性進化のための新しいスクリーニング法 |免疫学と感染症 |ビデオ

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

耐熱性工学の分野に特有の新奇向進化法は溶菌酵素のために開発され、結果的に検証されました。高温のインキュベーションの後、野生型タンパク質と比較した場合、ランダム突然変異誘発の唯一の1ラウンドの後、進化した溶菌酵素、PlyC 29C3は、二回残存活性よりも大きく表示されます。

耐熱性溶菌酵素の定向進化のための新しいスクリーニング法

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

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17.8K ビュー.  University of Maryland. 耐熱性工学の分野に特有の新奇向進化法は溶菌酵素のために開発され、結果的に検証されました。高温のインキュベーションの後、野生型タンパク質と比較した場合、ランダム突然変異誘発の唯一の1ラウンドの後、進化した溶菌酵素、PlyC 29C3は、二回残存活性よりも大きく表示されます。

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Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Here, we present a protocol to obtain adaptive laboratory evolution of microorganisms under conditions using chemostat culture. Also, genomic analysis of the evolved strain is discussed.

ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

遺伝学

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase variants that have more stringent specificity than the parental enzyme. The protocol requires the creation of a library of expression selection cassettes (ESCs) for variants of the REase, ideally with variability in positions likely to affect DNA binding. The ESC is flanked on one side by a sequence for the restriction site activity desired and a biotin tag and on the other side by a restriction site for the undesired activity and a primer annealing site. The ESCs are transcribed and translated in a water-in-oil emulsion, in conditions that make the presence of more than one DNA molecule per droplet unlikely. Therefore, the DNA in each cassette molecule is subjected only to the activity of the translated, encoded enzyme. REase variants of the desired specificity remove the biotin tag but not the primer annealing site. After breaking the emulsion, the DNA molecules are subjected to a biotin pulldown, and only those in the supernatant are retained. This step assures that only ESCs for variants that have not lost the desired activity are retained. These DNA molecules are then subjected to a first PCR reaction. Cleavage in the undesired sequence cuts off the primer binding site for one of the primers. Therefore, PCR amplifies only ESCs from droplets without the undesired activity. A second PCR reaction is then carried out to reintroduce the restriction site for the desired specificity and the biotin tag, so that the selection step can be reiterated. Selected open reading frames can be overexpressed in bacterial cells that also express the cognate methyltransferase of the parental REase, because the newly evolved REase targets only a subset of the methyltransferase target sites.

Restriction endonucleases with new sequence specificity can be developed from enzymes recognizing a partially degenerate sequence. Here we provide a detailed protocol that we successfully used to alter the sequence specificity of NlaIV enzyme. Key ingredients of the protocol are the in vitro compartmentalization of the transcription/translation reaction and selection of variants with new sequence specificities.

より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion cofactors triggering a dimer-dodecamer transition. Upon metal ion binding, several structural modifications occur in the active site and at the interaction interface, shaping dimers to promote the self-assembly. To observe such modifications, stable oligomers must be isolated prior to structural study. Reported here is a method that allows the purification of stable dodecamers and dimers of TmPep1050, an M42 aminopeptidase of T. maritima, and their structure determination by X-ray crystallography. Dimers were prepared from dodecamers by removing metal ions with a chelating agent. Without their&#160;cofactor, dodecamers became less stable and were fully dissociated upon heating. The oligomeric structures were solved by the straightforward molecular replacement approach. To illustrate the methodology, the structure of a TmPep1050 variant, totally impaired in metal ion binding, is presented showing no further breakdown of dimers to monomers.

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

This protocol has been developed to study the dimer-dodecamer transition of TmPep1050, an M42 aminopeptidase, at the structural level. It is a straightforward pipeline starting from protein purification to X-ray data processing. Crystallogenesis, data set indexation, and molecular replacement have been emphasized through a case of study, TmPep1050H60A H307A variant.

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

生化学

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

生物学

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

免疫・感染学

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

<meta charset="utf8"></head><body>低コストのサーモミキサーを用いた好熱剤適応のための実験的進化プロトコル

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures is a key requirement, not only for understanding fundamental evolutionary processes but also for developing S. acidocaldarius as a chassis for bioengineering. One major obstacle to conducting experimental evolution with thermophiles is the expense of equipment maintenance and energy usage of traditional incubators for high-temperature growth. To address this challenge, a comprehensive experimental protocol for conducting experimental evolution in S. acidocaldarius is presented, utilizing low-cost and energy-efficient bench-top thermomixers. The protocol involves a batch culture technique with relatively small volumes (1.5 mL), enabling tracking of adaptation in multiple independent lineages. This method is easily scalable through the use of additional thermomixers. Such an approach increases the accessibility of S. acidocaldarius as a model system by reducing both initial investment and ongoing costs associated with experimental investigations. Moreover, the technique is transferable to other microbial systems for exploring adaptation to diverse environmental conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:好熱性進化を探求するための革新的な技術を使用した微生物の適応の理解

Here, we present an experimental evolution protocol for adaptation in thermophiles utilizing low-cost, energy-efficient bench-top thermomixers as incubators. The technique is demonstrated through the characterization of temperature adaptation in Sulfolobus acidocaldarius, an archaeon with an optimal growth temperature of 75 &#176;C.

生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusによる実験的進化

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...

耐熱性溶菌酵素の定向進化のための新しいスクリーニング法

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ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

X線結晶学は、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌

新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

指向進化方法で

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusによる実験的進化

耐熱性溶菌酵素の定向進化のための新しいスクリーニング法

要約

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ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌

新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

指向進化方法で

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusによる実験的進化

X線結晶学は、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する