Os autores agradecem a Emilija Renke e Janet Yu para assistência técnica. DCN é suportada por concessões dos Estados Unidos Departamento de Defesa (DR080205, DM102823, OR09055, e OR090059). RDH é apoiado por uma bolsa da Estação Experimental de Maryland Agricultura e uma bolsa de formação NIH em Biologia Celular e Molecular.

1. Determinar Condições aquecimento ideal Em primeiro lugar, deve-se determinar experimentalmente a temperatura de incubação e tempo óptimo para usar para a etapa de aquecimento no ensaio. Para o nosso modelo PlyC, é importante notar que a E. coli co-transformados com genes e plyCA plyCB em plasmídeos de expressão separados tem sido mostrado para formar a holoenzima totalmente funcional PlyC 6. A preparação 96 da placa de microtitulação assim como as condições de crescimento celular e da técnica de revestimento subsequente réplica foram adaptados a partir de exemplos fornecidos na literatura 12-16. Um tempo de incubação de 30 min será apropriado para este ensaio como os resultados anteriores a partir de experiências de inactivação térmica ditar uma rápida perda de actividade durante a incubação de curto prazo em ambientes superiores a temperatura fisiológica (observação não publicada). A temperatura de incubação ideal para PlyC foi elucidada através dos seguintes passos: <ol><li> Transform a expressão construção pBAD24: plyCA (Amp r) na E. competente coli DH5cc pBAD33: plyCB (Cm r). </li><li> Placa dos transformantes numa placa de ágar Luria-Bertani (LB) suplementado com ampicilina (100 jig / ml) e cloranfenicol (35 mg / ml). Incubar as placas durante a noite a 37 ° C. </li><li> Com um palito estéril, inocular uma colónia individual para cada fila de poços (Figura 2a) em 96 estéril, límpida, de fundo chato bem, com tampa de placas de microtitulação contendo 200 ul de meio LB suplementado com ampicilina e cloranfenicol. </li><li> Seguramente colocar a placa de microtitulação de 96 bem sobre a 37 ° C agitando incubadora e crescer as bactérias durante a noite a 300 rpm. </li><li> Recuperar o 96 da placa de microtitulação de 37 ° C a agitação incubadora e da placa de réplica para uma nova placa de microtitulação de 96 poços da seguinte forma: <ol class="lalpha"><li> Adicionar 180 ul de meio LB suplementado com ampicilina e cloranfenicola cada poço da placa de réplica. </li><li> Transferir 20 uL de bactérias a partir da placa original para os poços correspondentes na placa de réplica. Isso deve resultar em uma primeira OD 600 de ~ 0,5. </li></ol></li><li> Colocar a placa de forma segura sobre a réplica de 37 ° C agitando incubadora e incubar a placa durante 1 hora a 300 rpm, em seguida, adicionar o inductant. No caso dos sistemas de expressão pBAD, a arabinose inductant é de 0,25%. Outros sistemas de expressão podem exigir inductants diferentes. Colocar a placa de volta a 37 ° C agitando incubadora e agitação a 300 rpm durante uma hora adicional de 4 para permitir a expressão da proteína. Os níveis de expressão variam tipicamente entre 10-20 jag de PlyC. </li><li> Uma vez que a expressão da proteína concluiu, recuperar a placa de réplica e sedimentar as bactérias, colocando a 96 placa de microtitulação numa centrifugadora refrigerada que contém um rotor oscilante de balde que se encaixa 96 placas de microtitulação de poços. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 min à temperatura ambiente.</li><li> Remover o sobrenadante mídia por lentamente invertendo a placa de microtitulação e gentilmente decantação da mídia. </li><li> Lisar as células por adição de 50 ul de B-PER Extraction Reagent II Bacterial Protein a cada poço. Incube a placa à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Aumentar o volume de cada poço a 120 ul por adição de 70 ul de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,2. </li><li> Pellet os detritos insolúveis por centrifugação celular a placa a 3000 rpm durante 10 min a 4 ° C na centrífuga refrigerada. </li><li> Transferir 110 uL do lisado bruto solúvel aos poços correspondentes de uma placa de 96 poços termociclador. </li><li> Usando 30 min como o tempo de incubação predeterminado, expor os lisados ​​solúveis actualmente residem na placa de 96 poços termociclador para uma ampla gama de gradiente de temperatura que mede 15-20 ° C. Note, o objetivo é determinar em que a temperatura de uma determinada enzima perde&gt; atividade catalítica de 95%. </li><li> Após a incubação, incubar a 96 poçostermociclador placa a 4 ° C durante 5 minutos e 100 ul de transferir os lisados ​​solúveis a partir da placa de 96 poços termociclador para o local correspondente no poço 96 final bem placa de microtitulação. </li><li> Com um multipipettor 12 canais, adicionar 100 ul de tensão GAS D471 a cada poço. Note, D471 células são originalmente liofilizado a partir de culturas durante a noite e ressuspensos com PBS pH 7,2 para se obter uma DO 600 de ~ 2,0. </li><li> Colocar imediatamente a placa de 96 poços no espectrofotómetro de microplacas e monitorizar a cinética da enzima medindo a OD 600 a cada 15 segundos durante 20 minutos. A incubação a temperatura mais baixa que correspondem a cavidades que não possuíam uma alteração na densidade óptica (ΔOD ≤ 0,1) é definida como a temperatura não permissiva. </li></ol> Depois de um ecrã largo temperatura é realizado para identificar a temperatura não permissiva, os passos acima pode ser repetido ao longo de um intervalo mais estreito de temperaturas (5 ° -10 ° C) para elucidara temperatura não permissiva preciso para a enzima de interesse. Nota, a temperatura não permissiva identificadas neste ensaio pode ser diferente do que a temperatura de fusão elucidada por outros meios, devido a diferenças de volume, concentração, etc 2. Gerando a Biblioteca Mutant A criação da biblioteca a ser rastreada mutante envolve incorporar mutações ao acaso por uma ADN-polimerase propensa a erros, com polarização de nucleótidos mínima no gene plyCA usando o GeneMorph II Kit mutagênese aleatória, como se segue: <ol><li> Conceber iniciadores nucleotídicos a temperaturas de fusão semelhantes (T m) entre 55-72 ° C, com os locais de restrição de escolha na extremidade 5 &#39;e 3&#39; do gene plyCA. </li><li> Uma vez que a taxa de mutação desejada é de 2-3 nucleótidos por plyCA (1,4 kb), utilizar os componentes da reacção de PCR concentrações, bem como as condições termociclador recomendadas pelo fabricante para baixo f mutaçãorequencies (0-4,5 por kb). </li><li> Clonar os genes mutagenizadas plyCA no vector de expressão pBAD24. </li><li> Transformar as construções em um DH5a: pBAD33 plyCB fundo e os transformantes de placas sobre placas de agar LB suplementado com ampicilina e cloranfenicol. </li><li> Além disso, transformar DH5a e placa pBAD33: plyCB com o vector de expressão de pBAD24 contendo o gene WT plyCA. As colónias da placa esta irá servir como os controlos durante a triagem. </li></ol> 3. 96 Preparação Placa Bem microtitulação e Condições de Crescimento Celular <ol><li> Encher cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com 200 ul de meio LB suplementado com ampicilina e cloranfenicol. </li><li> Seguindo o esquema de placas de microtitulação (Figura 2b), cuidadosamente seleccionar uma colónia individual a partir das placas de agar durante a noite com um palito esterilizado e inocular a bactéria designada no poço de microtitulação de 96 poços a plate. É essencial assegurar que somente uma colónia por poço é inoculado. </li><li> Agitar o ancorada 96 placa de microtitulação a 300 rpm durante a noite a 37 ° C. </li></ol> 4. Chapeamento réplica, Indução Protein Expression e Preparação Lysate <ol><li> Siga os passos 1,5-1,11 da seção intitulada &quot;Determinação das condições de aquecimento ideal&quot;, com uma modificação. Armazenar a placa original, a 4 ° C, após o passo de revestimento de réplica foi concluído. </li><li> Depois do passo 1.11, 110 ul de transferência do lisado bruto solúvel para as cavidades correspondentes de uma placa de 96 poços termociclador, excepto para o controle positivo poços A1-D1. No que respeita aos lisados ​​de controlo positivo (isto é, que não lisados ​​são aquecidas), 100 ul de transferência dos lisados ​​para as cavidades correspondentes de uma nova placa de microtitulação de 96 poços, que servirá como a placa de ensaio final para a experiência e armazenar em gelo. </li></ol> 5. Tratamento térmico solúvel Lysate <ol><li> Aqueça o controlo negativo e mutante solúvel lisados ​​atualmente confinada no termociclador placa de 96 poços no termociclador durante 30 minutos à temperatura de incubação optimizado não permissiva determinado na etapa 1. </li><li> Após incubação não permissiva temperatura, incubar a placa de 96 termociclador bem a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Transferir 100 uL dos lisados ​​solúveis a partir da placa de 96 poços termociclador aos seus locais idênticos bem na final placa de ensaio de 96 poços de microtitulação contendo já os lisados ​​de controlo positivo solúveis. </li><li> Com um multipipettor 12 canais, adicionar 100 ul de tensão GAS D471 a cada poço. Imediatamente colocar a placa no espectrofotómetro de microplacas. </li><li> Monitorizar a cinética da enzima medindo a OD 600 a cada 15 segundos durante 20 minutos. <ol class="lalpha"><li> Uma variante com PlyC progrediu comportamento térmico é definido como uma construção que pode diminuir a densidade óptica original em 50 por cento, em menos de 900 segundos, notemperatura não permissiva. Além disso, os controlos positivos (isto é, não-aquecido, WT PlyC) necessário exibir actividade catalítica WT (t 1/2 ≤ 100 seg) e os controlos negativos (isto é aquecida, WT PlyC) deve ser desprovido de actividade. </li></ol></li><li> Uma vez que uma variante com PlyC progrediu comportamento térmico é identificado, recuperar a placa original, armazenada a 4 ° C e bactérias inocule do indivíduo bem específico para o mutante de interesse em meio LB fresco suplementado com ampicilina e cloranfenicol. Crescer o inoculo durante a noite a 37 ° C. </li><li> Extrair e purificar ADN de plasmídeo a partir da cultura e, em seguida, submeter a sequenciação, a fim de identificar as mutações de nucleótidos que inferir um comportamento térmico melhorado para PlyCA. Além disso, o complemento de uma pequena alíquota da cultura durante a noite, com glicerol a 10% e armazenar a -80 ° C para posterior utilização. </li></ol>

<ol>
	<li>Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+design+by+directed+evolution.">Protein design by directed evolution.</a> Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).</li><li>Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+an+orthogonal+nucleoside+analog+kinase+via+fluorescence-activated+cell+sorting.">Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting.</a> Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).</li><li>Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+lysins+as+effective+antibacterials.">Bacteriophage lysins as effective antibacterials.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).</li><li>Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinventing+phage+therapy:+are+the+parts+greater+than+the+sum.">Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum.</a> Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).</li><li>Loessner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+endolysins--current+state+of+research+and+applications.">Bacteriophage endolysins--current state of research and applications.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).</li><li>Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlyC:+A+multimeric+bacteriophage+lysin.">PlyC: A multimeric bacteriophage lysin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).</li><li>Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+elimination+of+upper+respiratory+colonization+of+mice+by+group+A+streptococci+using+a+bacteriophage+lytic+enzyme.">Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).</li><li>Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysK,+the+enzyme+lysing+Staphylococcus+aureus+cells:+specific+kinetic+features+and+approaches+towards+stabilization.">LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization.</a> Biochimie. 92, 507-513 (2010).</li><li>Varea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+thermodynamic+characterization+of+Pal,+a+phage+natural+chimeric+lysin+active+against+pneumococci.">Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci.</a> J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).</li><li>Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+and+cooperative+domains+of+CPL1+lysozyme+and+its+NH2-+and+COOH-terminal+modules.+Dependence+on+choline+binding.">Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding.</a> J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).</li><li>Anderson, G., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+product+shelf+life+and+activation+energy+for+five+drugs+of+abuse.">Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse.</a> Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).</li><li>Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+novel+N-carbamylase/D-hydantoinase+fusion+enzyme+for+functional+expression+with+enhanced+stability.">Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability.</a> Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).</li><li>Koutsioulis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+on+the+cold+adapted+properties+of+TAB5+alkaline+phosphatase.">Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase.</a> Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).</li><li>McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+catalytic+efficiency+and+active+site+modification+of+1,4-beta-D-glucan+glucohydrolase+A+from+Thermotoga+neapolitana+by+directed+evolution.">Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution.</a> J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).</li><li>Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolved+xylose+transporter+from+Zymomonas+mobilis+enhances+sugar+transport+in+Escherichia+coli.">An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli.</a> Microbial cell factories. 8, 66 (2009).</li><li>Tsuzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostable+mutants+of+the+photoprotein+aequorin+obtained+by+in+vitro+evolution.">Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution.</a> J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).</li><li>Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+enzyme+stability.">Directed evolution of enzyme stability.</a> Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).</li><li>Kumar, S., Nussinov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+thermophilic+proteins+deal+with+heat.">How do thermophilic proteins deal with heat.</a> Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).</li><li>Hibbert, E. G., Dalby, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+strategies+for+improved+enzymatic+performance.">Directed evolution strategies for improved enzymatic performance.</a> Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).</li><li>Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+random+mutagenesis+by+error-prone+polymerase+chain+reaction+protocols,+Escherichia+coli+mutator+strain,+and+hydroxylamine+treatment.">Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment.</a> Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).</li><li>Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+random+mutagenesis+methods+used+for+directed+protein+evolution.">A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution.</a> J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).</li><li>Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+adapt:+lessons+from+directed+evolution.">How enzymes adapt: lessons from directed evolution.</a> Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo, esboçado na Figura 1, apresenta uma metodologia 96 placa de microtitulação assim que permite utilizar evolução dirigida para aumentar a estabilidade térmica de qualquer enzima bacteriolytic. Através da utilização de uma DNA polimerase propensa a erros, pode-se introduzir mutações aleatórias que aumentam a estabilidade global cinética da molécula traduzida bacteriolytic de interesse, que é geralmente devido a reorganizações moleculares consistem em aumentar electrostáticas, dissulfureto de pontes e de interacções hidrofóbicas que geram melhorado empacotamento molecular, modificações avançadas de redes de superfície de carga ou reforço de um estado de maior oligomerização 17-18. Após a introdução das mutações de nucleótidos, um procedimento de rastreio extenso foi então utilizado para identificar mutações que são termicamente benéfico. Os resultados representativos aqui apresentados foram baseadas em um ciclo de mutagénese aleatória. Na realidade, tem sido sugerido quepelo menos, três rondas sucessivas de mutagénese aleatória, cada um utilizando a mutante mais robusta como a enzima de chumbo, seguido por ADN baralhar é apropriada para este tipo de estudos dirigidos evolução do comportamento térmico 2. É importante compreender que, embora este protocolo identifica as mutações que aumentam a estabilidade cinética, essas variantes não necessariamente um aumento de termoestabilidade. Uma molécula é considerada termoestável quando tem a capacidade de reter a sua estrutura a uma temperatura elevada. No entanto, no ensaio apresentado, a actividade residual dos lisados ​​mutantes não são ensaiadas na mesma temperatura que foram inicialmente incubadas a durante o passo de tratamento térmico e, portanto, pode-se seleccionar a presença de mutações que promovem a re-enrolamento, em vez de termoestabilidade melhorada 19. Enquanto nós estamos extrapolando comportamento térmico como uma indicação de estabilidade térmica, estabilidade térmica verdadeira deve ser medido empiricamente por Biophysical métodos tais como dicroísmo circular (CD), calorimetria diferencial de varredura (DSC) e fluorimetria diferencial de varredura (DSF). Os dados preliminares obtidos em experiências de CD e DSF sugerem que vários candidatos identificados a partir da metodologia apresentada, de facto exibir termoestabilidade progrediu (dados não mostrados). Embora a metodologia aqui apresentada é específica para a implementação aumento do comportamento térmico de PlyC, esta mesma metodologia pode, adicionalmente, ser empregues para aumentar a actividade de outras enzimas térmica bacteriolytic com algumas pequenas alterações nas variáveis, tais como tampões, as taxas de mutação, as condições de aquecimento e sistemas de expressão. Uma variável importante associada a este ensaio refere-se à taxa de mutação nucleotídica do ADN-polimerase propensa a erros. Optou-se por utilizar o error-prone DNA polimerase II Mutazyme no nosso ensaio de evolução dirigida, devido à evidência experimental que sugere esta enzima particular exibe a menor quantidade de polarização comdiz respeito a que os nucleótidos são aleatoriamente incorporado no gene de interesse quando em comparação com outras técnicas de mutagénese ao acaso, como a utilização de hidroxilamina, E. mutator coli e DNA error-prone outro polyermases 20. De um modo geral, menores taxas de mutação tendem a ser mais desejável por duas razões. Em primeiro lugar, a termoestabilidade da engenharia de proteínas normalmente consiste em relativamente poucas substituições de aminoácidos. Taxas de mutação elevadas pode causar dramáticas alterações estruturais determinadas moléculas que podem resultar em conclusivamente misfolding estrutural e discrepâncias funcionais. Por exemplo, a incorporação de resíduos de prolina e glicina podem romper estruturas alfa helicoidais secundárias 21. Em segundo lugar, as altas taxas de mutação de nucleotídeo aumentar as possibilidades de incorporar codões de terminação prematuros, resultando em moléculas truncadas que são biologicamente inactivos. De um modo geral, menores taxas de mutação são preferidos porque baixa as taxas de erro no resultado accumulção de mutações adaptativas enquanto que as taxas de mutação mais elevadas gerar mutações neutras ou prejudiciais 22. Para cada ronda de mutagénese aleatória, outra variável crítica que se deve optimizar envolve a temperatura de incubação utilizado durante o processo de rastreio. Selecção da temperatura não permissiva experimental é relativamente difícil. Nós inicialmente utilizada uma temperatura de incubação que foi de 10 ° C superior à temperatura não permissiva de PlyC, no entanto após o rastreio de mutantes 3000, não fomos capazes de identificar quaisquer mutações vantajosas. Tendo em mente as metodologias evolução dirigida consistem em identificar sequencialmente benéficos substituições de aminoácidos que têm efeitos aditivos, determinou-se que uma temperatura de menos rigorosas deve ser utilizado durante o processo de rastreio, mesmo que aumentou a possibilidade de geração de falsos positivos. Como tal, foi utilizada uma temperatura de incubação, que foi de apenas alguns graus acima do não-permissive temperatura e novo rastreio candidatos selecionados para descartar os falso-positivos. Decidimos utilizar uma temperatura de incubação, que não foi muito temperado (≤ 1 ° C superior à mais baixa temperatura não permissiva) e, inversamente, não muito dura (≥ 5 ° C superior à mais baixa temperatura não permissiva). A temperatura ideal decidimos utilizar neste ensaio particular foi a 2 moderado ° C mais elevado do que o determinado experimentalmente temperatura não permissiva. Escolhendo uma temperatura que é muito suave irá resultar em uma taxa muito mais elevada de identificação de falsos positivos do que a ~ 20% foi observada (Tabela I) quando se utiliza uma temperatura de incubação moderada. Além disso, usando uma temperatura de incubação, que é muito duro pode, em última análise resultar na incapacidade para identificar mutantes com significativamente melhor comportamento térmico. Por exemplo, utilizando uma temperatura de incubação de ≥ 5 ° C teria resultado na incapacidade de identificar aprometendo mutante 29C3, assim como a maioria dos outros candidatos selecionados durante a primeira rodada de seleção. Em suma, nós fornecemos um protocolo de enzimas de engenharia bacteriolytic para adquirir estabilidade cinética reforçada. Além disso, este mesmo ensaio, sem os passos de aquecimento, pode ser usado para o rastreio de mutações que aumentam a actividade catalítica. Aumentar tanto a atividade catalítica e estabilidade térmica é um obstáculo importante no desenvolvimento voltado para qualquer enzima terapêutico. Embora os detalhes deste protocolo são específicos para o PlyC endolysin, a metodologia pode ser adaptado a qualquer enzima bacteriolytic apenas com algumas alterações. Nós apresentamos resultados preliminares de apenas a primeira ronda de mutagénese que valida que a funcionalidade do ensaio, o que resulta na aplicação e identificação de mutações que geram um aumento na termoestabilidade molecular de magnitude significativa.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> B-PER II Reagente de Extracção Bacterial Protein </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78260 </td></tr><tr><td> GeneMorph II Kit mutagênese aleatória </td><td> Agilent Technologies </td><td> 200500 </td></tr><tr><td> Limpar 96 Bem, Microplaca de fundo plano com tampa </td><td> BD Vacutainer Labware Médica </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96 Bem Nonskirted Placas PCR </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td> Rotor basculante </td><td> Eppendorf </td><td> A-2-DWP </td></tr><tr><td> Sal de Sódio Ampicilina </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td></tr><tr><td> Cloranfenicol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP904 </td&gt; </tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> pBAD24 vetor de expressão </td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> pBAD33 vetor de expressão </td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

Evolução dirigida é definida como um método para aproveitar a selecção natural, a fim de engendrar proteínas adquirir propriedades específicas que não estão associados com a proteína na natureza. A literatura tem fornecido numerosos exemplos sobre a implementação de evolução dirigida com sucesso alterar especificidade molecular e catálise 1. A principal vantagem da utilização de evolução dirigida, em vez de mais racional abordagens para a engenharia molecular refere-se ao volume e diversidade de variantes que podem ser rastreados 2. Uma possível aplicação de evolução dirigida envolve a melhoria da estabilidade estrutural de enzimas, tais como bacteriolytic endolysins. Bacteriófago codificar e expressar endolysins de hidrolisar uma ligação covalente crítico no peptidoglicano (ie parede celular) de bactérias, resultando na lise da célula hospedeira e libertação de viriões da progenia. Notavelmente, estas enzimas têm a capacidade de induzir a lise extrinsecamente à susceptibilidadeveis bactérias na ausência de fago e, além disso, têm sido validada tanto in vitro como in vivo para o seu potencial terapêutico 3-5. O assunto do nosso estudo envolve a evolução dirigida endolysin PlyC, que é composta de subunidades PlyCB PlyCA e 6. Quando purificada e adicionada extrinsecamente, a holoenzima PlyC lisa estreptococos do grupo A (GAS), assim como outros grupos de estreptococos em uma questão de segundos e, além disso, tem sido validado in vivo contra GAS 7. Significativamente, a monitorização cinética enzimática residual após incubação a temperatura elevada fornece evidência nítida de que PlyC perde actividade lítica abruptamente a 45 ° C, o que sugere uma vida útil curta terapêutica, que pode limitar o desenvolvimento adicional desta enzima. Novos estudos revelam a falta de estabilidade térmica é observado apenas para a subunidade PlyCA, enquanto que a subunidade PlyCB é estável até ~ 90 ° C (observação não publicada). Além de PlyC, existem sárias exemplos na literatura que descrevem a natureza termolábil de endolysins. Por exemplo, o Staphylococcus aureus endolysin LysK e Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 e Pal perder actividade espontaneamente a 42 ° C, 43,5 ° C e 50,2 ° C, respectivamente 8-10. De acordo com a equação de Arrhenius, que relaciona a velocidade de uma reacção química com a presente temperatura no sistema em particular, um aumento da estabilidade térmica irá correlacionar com um aumento da esperança de vida de prateleira 11. Para este fim, a evolução dirigida foi demonstrado ser uma ferramenta útil para a alteração da actividade térmica de várias moléculas na natureza, mas nunca esta tecnologia particular foi explorada com sucesso para o estudo das enzimas bacteriolytic. Da mesma forma, as contas de sucesso de progredir a estabilidade estrutural desta classe específica de agentes antimicrobianos em conjunto são inexistentes. Neste vídeo, nós empregamos uma nova metodologia que utiliza um erro-pruma ADN polimerase, seguido por um processo de triagem optimizada utilizando um formato de placa de 96 bem de microtitulação para a identificação de mutações para a subunidade PlyCA do endolysin estreptocócica PlyC que se correlacionam com um aumento na estabilidade cinética enzimática (Figura 1). Resultados após apenas uma rodada de mutagénese aleatória sugerem a metodologia é gerar variantes PlyC que retêm mais do que duas vezes a actividade residual quando comparada à de tipo selvagem (WT) PlyC após tratamento a uma temperatura elevada.

Na conclusão do primeiro turno de mutagênese aleatória, mais de 6.000 mutantes PlyC foram rastreados e um total de 35 mutantes com potencial aumento comportamento térmico foram identificados, selecionados e seqüenciados. Análise genómica, resumidos na Tabela I, sugere que os 35 candidatos, 7 das construções continham sequências WT PlyCA ao nível da tradução, o que corresponde a falsos positivos identificados pelo ensaio. Dos restantes 28 candidatos, a gama de mutação foi de 1 a 6 mutações de nucleótidos com uma taxa de mutação média, 2,75 nucleótidos por plyCA gene, que estava na gama de 2-3 mutação nucleotídica que foram alvo. Ao nível da tradução, esta gama de mutação específica de nucleótidos e de frequência produziu uma gama mutação de aminoácidos de 1 a 5 aminoácidos, com uma taxa média de 1,9 mutação mutações de aminoácidos por PlyCA polipeptídeo. Dos 28 candidatos com pelo menos um aminoácido Mutation, quatro destas construções mutantes foram aleatoriamente escolhidos para caracterização adicional para validar que o processo de rastreio extenso da metodologia de evolução dirigida foi de facto a funcionar correctamente. As enzimas mutantes foram purificadas PlyC a&gt; 95% de homogeneidade com base em SDS-PAGE, conforme descrito anteriormente 6-7. Cinética enzimática de WT PlyC e cada um dos quatro mutantes PlyC foram caracterizados em concentrações molares iguais, após incubação das enzimas purificadas de diferentes temperaturas elevadas. A actividade foi monitorizada após a adição de D471 GAS, medindo a densidade óptica a 600 nm a cada 15 seg durante 20 min. A actividade foi definida como a velocidade máxima da enzima residual após incubação de calor. Dos quatro candidatos seleccionados aleatoriamente para posterior caracterização, mutante 29C3 mostrou a maior parte do comportamento melhorado térmica. O comportamento térmico de WT PlyC e 29C3, foi investigada a diferentes temperaturas durante a incubação e de ensaio para a actividade em PBS pH 7,2 a80 nM e 40 nM, respectivamente concentrações. As experiências 45-50 ° C de incubação (Figura 3) foram realizadas num termociclador, onde as amostras foram incubadas em uma placa de parede fina termociclador 96 poço num volume total de 120 ul. A 35 ° C, 40 ° C e 45 ° C experiências de incubação (Figura 4 e 5) foram realizadas num bloco de aquecimento em que as amostras foram incubadas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml num volume total de 1,3 ml. Todos os experimentos foram realizados em triplicado. WT PlyC e 29C3 mostrou nenhuma diferença significativa na estabilidade cinética à temperatura ambiente (25 ° C), como descrito no primeiro conjunto de barras na Figura 3. No entanto, depois de uma incubação de curta duração, durante 30 min a partir de temperaturas que variam entre 45-50 ° C, a actividade de 29C3 foi substancialmente maior do que a actividade específica para o WT construir em cada ponto de temperatura. Por exemplo, o WT PlyC apresentado uma perda de 44% na actividade de 45,2° C ao passo que 29C3 mostrou uma perda de apenas 2% da actividade na mesma temperatura. Estudos a longo prazo de incubação, comparando a actividade residual de ambos WT PlyC e 29C3 foram adicionalmente realizada a 35 ° C e 40 ° C que envolve a medição da actividade residual em 24 e 48 pontos de tempo hr. A 35 ° C, 41% 29C3 exibido e actividade de 176% maior do que a WT PlyC a 24 e 48 h de incubação os pontos de tempo, respectivamente (Figura 4a). A 40 ° C, 28% 29C3 exibido e actividade de 107% maior do que a WT PlyC a 24 e 48 h de incubação os pontos de tempo, respectivamente (Figura 4b). A actividade residual de WT PlyC e 29C3 foram também monitorizados a cada 20 minutos durante um total de 3 horas a 45 ° C. WT PlyC só foi capaz de manter a actividade de 21% após um período de incubação de 3 horas a esta temperatura, ao passo que 29C3 foi capaz de manter a actividade de 46%. A meia-vida (t 1/2) para WT PlyC e 29C3 foram de 67 e 147 min, respectivamente, sugere<html> ing que 29C3 tem um aumento de 2,2 vezes na estabilidade cinética a 45 ° C (Figura 5). <table border="1"><tbody><tr><td> Total de candidatos Round 1 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> Candidatos com WT Sequência PlyCA </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Candidatos com ≥ Mutação Ácido Amino 1 </td><td> 28 </td></tr><tr><td> - Taxa de Mutação média de nucleotídeos (nt / plyCA) </td><td> 2,75 </td></tr><tr><td> - Faixa de Mutação de nucleotídeos (nt) </td><td> 1-6 </td></tr><tr><td> - Taxa de Mutação média de Aminoácidos (AA / PlyCA) </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td> - Faixa de Mutação de Aminoácidos (AA) </td><td> 1-5 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Candidato Análise Genômica Pool. pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Metodologia de ensaio dirigido evolução. Na evolução dirigida, começa-se com a enzima de chumbo, o que seria PlyC WT para a primeira rodada. Uma biblioteca de mutantes aleatórios imparciais PlyC contendo mutações de nucleótidos para o gene plyCA é então construído por uma ADN-polimerase propensa a erros, clonado no vector de expressão de pBAD24 e transformada na E. coli estirpe DH5a contendo já pBAD33:. plyCB transformantes individuais são inoculadas em sua própria específica poço de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. Através de um processo de rastreio extensivo, os mutantes individuais PlyC que são cataliticamente activo após incubação a uma temperatura não permitida são classificados como mutantes com estabilidade cinética melhorada. Theconstruct mostrando o comportamento mais progrediu térmica, consequentemente, torna-se a enzima de chumbo para a próxima rodada de mutagênese aleatória. No geral, há três rodadas completas de random mutagênese seguido de DNA baralhar resultando em uma molécula bacteriolytic com evoluído comportamento térmico. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> Figura 2. 96 modelos de microtitulação de placas para o ensaio de evolução dirigida. O esquema de placas de microtitulação durante a determinação das condições óptimas de aquecimento (figura 2a) é constituído por inoculação de um único clone parental WT PlyC em cada linha da placa de microtitulação. O diagrama esquemático da placa de microtitulação durante a triagem mutante (Figura 2b) é constituído por inoculação de cada poço na coluna 1 com um único clone parental WT PlyC bem como inocular cada cavidade nas colunas 2-12 com um clone mutante PlyC distinto. Wells A1-D1 são designados para os controles positivos dos pais, que consist de WT PlyC construções não exposto a não admissível incubação à temperatura. Poços E1-H1 são designados para os controlos negativos parentais, que consistem em construções WT PlyC que estão expostos ao não-incubação à temperatura permissível. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> Figura 3. A análise cinética comparando a actividade residual WT PlyC e 29C3. Enzimas foram purificadas até à homogeneidade e foram incubadas durante 30 min num termociclador em concentrações molares iguais em ambas temperatura ambiente ou a um gradiente de temperatura que varia de 45-50 ° C. A actividade enzimática está correlacionada com a velocidade máxima apresentada, após incubação a temperatura específica. Com a excepção de 25 ° C e 47,7 ° C, a variação da actividade entre WT e 29C3 a cada temperatura correlacionada com um valor de p &lt;0,05. Todos os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes. </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> Figura 4. A análise cinética comparando a actividade residual WT PlyC de 29C3 a 35 ° C e 40 ° C. As concentrações molares de igualdade purificada WT PlyC e 29C3 foram incubadas num bloco de aquecimento a 35 ° C (Figura 4-A) ou 40 ° C (Figura 4b). A actividade enzimática residual foi medida a 24 e 48 pontos de tempo hr. A actividade exibida por cada construção foi normalizada para a velocidade máxima apresentada no ponto zero de tempo. A variação da actividade entre WT e 29C3 em cada ponto de temperatura e de tempo correlacionado com um valor de p &lt;0,05. Todos os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> Figura 5. Análise de atividade residual cinética comparandoWT PlyC de 29C3 a 45 ° C. As concentrações molares de igualdade purificada WT PlyC e 29C3 foram incubadas num bloco de aquecimento a 45 ° C e a actividade enzimática residual foi medida a cada 20 min durante 3 horas. A actividade exibida por cada construção foi normalizada para a velocidade máxima apresentada no ponto zero de tempo. Com a excepção dos pontos de dados, a 20 min, a variação da actividade entre WT e 29C3 em cada ponto de tempo correlacionado com um valor de p &lt;0,05. Todos os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes.

Watch this Scientific Journal Video about A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes at JoVE.com

Um novo método de triagem para a evolução dirigida de enzimas bacteriolíticas termoestáveis ​​| Imunologia e Infecção | Vídeo

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Um método de evolução dirigida novo específico para o domínio da engenharia termoestabilidade foi desenvolvido e, consequentemente, para as enzimas bacteriolytic validado. Depois de apenas uma rodada de mutagénese ao acaso, uma enzima evoluiu bacteriolytic, PlyC 29C3, exibido duas vezes maior do que a actividade residual quando comparada com a proteína de tipo selvagem, após incubação a temperatura elevada.

Novo método de triagem para a evolução dirigida de enzimas termoestáveis ​​Bacteriolytic

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

a-new-screening-method-for-directed-evolution-thermostable

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Natural Selection

SCIENTISTS IN ACTION

17.8K visualizações.  University of Maryland. Um método de evolução dirigida novo específico para o domínio da engenharia termoestabilidade foi desenvolvido e, consequentemente, para as enzimas bacteriolytic validado. Depois de apenas uma rodada de mutagénese ao acaso, uma enzima evoluiu bacteriolytic, PlyC 29C3, exibido duas vezes maior do que a actividade residual quando comparada com a proteína de tipo selvagem, após incubação a temperatura elevada.

Vídeo: A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Here, we present a protocol to obtain adaptive laboratory evolution of microorganisms under conditions using chemostat culture. Also, genomic analysis of the evolved strain is discussed.

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Genética

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase variants that have more stringent specificity than the parental enzyme. The protocol requires the creation of a library of expression selection cassettes (ESCs) for variants of the REase, ideally with variability in positions likely to affect DNA binding. The ESC is flanked on one side by a sequence for the restriction site activity desired and a biotin tag and on the other side by a restriction site for the undesired activity and a primer annealing site. The ESCs are transcribed and translated in a water-in-oil emulsion, in conditions that make the presence of more than one DNA molecule per droplet unlikely. Therefore, the DNA in each cassette molecule is subjected only to the activity of the translated, encoded enzyme. REase variants of the desired specificity remove the biotin tag but not the primer annealing site. After breaking the emulsion, the DNA molecules are subjected to a biotin pulldown, and only those in the supernatant are retained. This step assures that only ESCs for variants that have not lost the desired activity are retained. These DNA molecules are then subjected to a first PCR reaction. Cleavage in the undesired sequence cuts off the primer binding site for one of the primers. Therefore, PCR amplifies only ESCs from droplets without the undesired activity. A second PCR reaction is then carried out to reintroduce the restriction site for the desired specificity and the biotin tag, so that the selection step can be reiterated. Selected open reading frames can be overexpressed in bacterial cells that also express the cognate methyltransferase of the parental REase, because the newly evolved REase targets only a subset of the methyltransferase target sites.

Restriction endonucleases with new sequence specificity can be developed from enzymes recognizing a partially degenerate sequence. Here we provide a detailed protocol that we successfully used to alter the sequence specificity of NlaIV enzyme. Key ingredients of the protocol are the in vitro compartmentalization of the transcription/translation reaction and selection of variants with new sequence specificities.

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

Restriction endonuclease (REase) specificity engineering is extremely difficult. Here we describe a multistep protocol that helps to produce REase ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion cofactors triggering a dimer-dodecamer transition. Upon metal ion binding, several structural modifications occur in the active site and at the interaction interface, shaping dimers to promote the self-assembly. To observe such modifications, stable oligomers must be isolated prior to structural study. Reported here is a method that allows the purification of stable dodecamers and dimers of TmPep1050, an M42 aminopeptidase of T. maritima, and their structure determination by X-ray crystallography. Dimers were prepared from dodecamers by removing metal ions with a chelating agent. Without their&#160;cofactor, dodecamers became less stable and were fully dissociated upon heating. The oligomeric structures were solved by the straightforward molecular replacement approach. To illustrate the methodology, the structure of a TmPep1050 variant, totally impaired in metal ion binding, is presented showing no further breakdown of dimers to monomers.

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

This protocol has been developed to study the dimer-dodecamer transition of TmPep1050, an M42 aminopeptidase, at the structural level. It is a straightforward pipeline starting from protein purification to X-ray data processing. Crystallogenesis, data set indexation, and molecular replacement have been emphasized through a case of study, TmPep1050H60A H307A variant.

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Bioquímica

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biologia

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Imunologia e Infecção

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo de evolução experimental para adaptação termófila utilizando termomixers de baixo custo

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures is a key requirement, not only for understanding fundamental evolutionary processes but also for developing S. acidocaldarius as a chassis for bioengineering. One major obstacle to conducting experimental evolution with thermophiles is the expense of equipment maintenance and energy usage of traditional incubators for high-temperature growth. To address this challenge, a comprehensive experimental protocol for conducting experimental evolution in S. acidocaldarius is presented, utilizing low-cost and energy-efficient bench-top thermomixers. The protocol involves a batch culture technique with relatively small volumes (1.5 mL), enabling tracking of adaptation in multiple independent lineages. This method is easily scalable through the use of additional thermomixers. Such an approach increases the accessibility of S. acidocaldarius as a model system by reducing both initial investment and ongoing costs associated with experimental investigations. Moreover, the technique is transferable to other microbial systems for exploring adaptation to diverse environmental conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Entendendo a adaptação de micróbios usando técnicas inovadoras para explorar a evolução termofílica

Here, we present an experimental evolution protocol for adaptation in thermophiles utilizing low-cost, energy-efficient bench-top thermomixers as incubators. The technique is demonstrated through the characterization of temperature adaptation in Sulfolobus acidocaldarius, an archaeon with an optimal growth temperature of 75 &#176;C.

Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...

Novo método de triagem para a evolução dirigida de enzimas termoestáveis Bacteriolytic

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli

Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

Dirigido Método Evolução

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

Novo método de triagem para a evolução dirigida de enzimas termoestáveis ​​Bacteriolytic

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli

Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

Dirigido Método Evolução

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

Novo método de triagem para a evolução dirigida de enzimas termoestáveis Bacteriolytic