Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Ortak İnovasyon Ödülü ile desteklenmiştir. LAM Sinyali ve Sağlık eğitim bursu Hücresel Yönetmeliği Ulusal Enstitüsü (T32 GM008759) ve NIH Ruth L. Kirschstein Ön Doktora Sonrası (CA165349-01) tarafından desteklenmiştir. Biz onların değerli yorumları için Prof Michael Stowell (CU Boulder), Prof Douglas Rees ve Prof Rob Phillips (Caltech) teşekkür etmek istiyorum.

1. Lipozom preparatı <ol><li> Bir Teflon astarlı kapakla bir 20 ml bir cam şişe al. </li><li> Bulaşmasını önlemek için kullanmadan önce kloroform ile tüm cam ve şırıngalar temizleyin. </li><li> Bir 250 uL hava geçirmez bir cam şırınga kullanılarak bir cam şişeye saflıkta kloroform 100 uL transfer edin. </li><li> Bir 100 uL hava geçirmez bir cam şırınga kullanılarak aynı cam şişeye tepkin madde gradlı metanol 30 uL ekleyin. </li><li> Fosfatidiletanolamin (POPE): a 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatidilkolin (POPC) hazırlamak için kolesterol lipid çözeltisi, 11 mg / mL &#39;lik 10 mg / mL Pope ve 20 ul uL 10 mg / mL POPC, 42 ve 216 uL transferi 20 ml bir cam şişeye CHCl3 kolesterol çözümler. </li><li> Lipit ince bir film şişeye altındaki gözlenene kadar yavaş akış argon veya nitrojen gazı ile organik çözücüler buharlaşır. </li><li> Artık çözücü kaldırmak için, en azından 30 dakika boyunca bir vakumlu kurutucuda kapağını açıp cam şişeye yerleştirin. </li><li> Trtamponu ansfer 2 mL, daha önce hidrat lipidler için bir cam şişeye, bir 0.2 mikron filtreden geçirilir. </li><li> 4 ° C de bir gece azından karışımı inkübe ve 48 saat içinde kullanımı. </li></ol> 2. Freeze-ve-çözülme: 30 Lipozom Ölçüler de - 100 nm Sadece <ol><li> 15 saniye boyunca sıvı nitrojen içinde lipozom süspansiyon dondurun. </li><li> 42 bir ısıtma bloğu kullanarak lipozom süspansiyon çözülme ° ~ 3 dakika C sıcaklık. </li><li> 5 döngü toplam adımları 2.1 ve 2.2 tekrarlayın. </li></ol> 3. Ekstrüzyon Doğru kendilerine rehber kitapta enstrüman anahat kullanarak, Liposofast LF-50 ekstruder monte Avestin yönergeleri izleyin. <ol><li> Destek filtre tabanında büyük bir delik destek ekranı (dairesel delik ile) yerleştirin, dairesel sinterlenmiş çanağı (deliksiz), bir dren disk (çapı 25 mm), bir polikarbonat membran (çapı 25 mm) izledi. </li><li> Küçük, siyah koyunDestek filtre tabanına sabitlemek için membran üstündeki O-ring. </li><li> 4 deliklere 4 vidayı sıkarak üst filtre ekstruder takın. </li><li> Büyük ekstruder varil altındaki üzere filtre ekstruder birimi birleştirin. Silindir namluya lipozom çözüm ekleyin. Için ekstrüzyon varil üzerinde aşağıdaki yerleştirin: büyük dairesel O-ring, dar kap, büyük dairesel O-ring, dairesel kap. </li><li> Ekstruder varil başına gaz regülatörü takın ve basınç tahliye vanası dahil olmak üzere hava kaçağı önlemek için tüm vanaları kapatın. Bir 20 ml bir cam şişe ya ekstruder filtre ünitesi altında 50 ml Erlenmeyer şişesinde yerleştirin. Bir emniyet valfi regülatör bağlı ve 600 psi basınç aşarsa yayınlayacak. Azot gazı açın ve ekstruder bağlı gaz vanasını açın. </li><li> Azot basıncı 400 nm lipozomlar, 100 nm lipozomlar için 125 psi ve 30 nm lipozomlar için 400-500 psi 25 psi artırın. </li><li> Lipozom süspansiyon izlemeknitrojen ile itilerek edilirken ension bu kap içine çıkarır gibi. Artık cam şişe içinde ekstruder filtresi aracılığıyla herhangi bir sıvı geçen gözlemlemek kadar azot akan tutun. </li></ol> 4. Dinamik ışık saçılımı (DLS) Analizi <ol><li> Bir 20 uM lipozom solüsyonu 50 uL hazırlayın. </li><li> Güç kaynağı ve lamba kaynağı açın. </li><li> DynaPro yazılımını açın. </li><li> 30 nm ve 100 nm ve&gt; 100 nm lipozomlar tespit MS800 algoritma modeli lipozomlar algılamak için MS / X algoritma modeli için yazılım ayarlayın. </li><li> Donanım bağlanın. </li><li> Hücre tutucusu içine kuvars küvet ve yerleştirmeye lipozom numunesi pipetleyin 14 uL. </li><li> Başlatmak basın. </li><li> 30 satın alma - ~ 20 sonra durması basın. </li><li> Histogram kaydedilen ortalama lipozom çapı zirveleri analiz edin. </li></ol> 5.. Takip nanoparçacık Analizi (NTA) <ol><li> Bir 500 uL, 0.1 uM lipozom hazırlamakçözüm. </li><li> Su ve etanol ile örnek bölmesi çalkalayın. </li><li> Bir tüy bırakmayan kağıt havlu ile örnek bölmesi kurulayın. </li><li> Lazer güç kaynağı ve bilgisayarı açın. </li><li> Örnek bölmesine 0.1 uM lipozom çözüm 300 uL sunun. </li><li> Sıcaklık kontrolü ve Nanopartikül Takip Analiz yazılımı açın. </li><li> Lazer açmak için düğmeye Yakalama basın. </li><li> Sahne taşımak ve mikroskop odağı ayarlamak için yatay ve dikey ayarlamaları kullanın. </li><li> Istenilen sıcaklığa (20 ° C) ve kayıt süresi (en az 30 saniye) ayarlayın. </li><li> Zaman belirli bir miktar için lipozom parçacıkların birden fazla resim çerçeveleri çekmek için Kaydet düğmesine basın. Her parçacığın hareket izler olarak histogram üzerine çapı lipozom boyutları karşılık gelen tepe analiz. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Ekstrüzyon yöntemi özetleyen bir şema, pŞekil 1 &#39;de temsil edilir. , En iyi sonuçlar elde 30 nm çaplı lipozomlar hazırlanması ~ 500 psi ve 100 nm çaplı bir yüksek basınç gerektirir hızlı bir filtre hızı elde etmek için 125 psi&#39;lik bir basınçta gerektirir. 400 nm çaplar için, ~ 25 psi arasında bir alçak basınç kesecikler daha büyük, daha homojen bir lipozom uzamasına ve oluşturmasına izin veren yavaş filtre oranının elde edilmesi tavsiye edilir. Biz tutarlı mikronaltı vezikül boyutları üretmek için optimal basınç belirlemek için bir dizi deney gerçekleştirdi. Biz basıncı gibi ekstrüzyon gözenek 30 ebatlarında, 100 ve 400 nm ile polikarbonat filtrelerden geçer sayısı çeşitlidir ve her istenilen boyutu için uygun basınç keşfetti. 30 nm gözenekler için 500 psi basınç altında uzama ve böylece daha büyük vezikül boyutları neden akış hızı azaltacaktır. 100 nm gözenekler için, sürekli bir akış 125 psi sağlandı. 400 nm gözenekler için, düşük basınçlı (25 psi) veziküller daha büyük vezikül s içine uzamasına izin verirsimgelediği kabul edilir. Yavaş açılan bilge filtrasyon akışı büyük mikronaltı veziküller 13 oluşturmak için en uygunudur. Biz üç farklı çapta, yani 30, 100 ve 400 nm ile ekstrüde lipozom boyutlarını belirlemek için DLS yapıldı. DLS partikül çapı belirlemek için saçılan ışık toplayan oluşturulmuş bir yöntemdir. Filtre gözenek ile 5 pas ve 2 ile 25 psi az 400 nm polikarbonat membran ile 125 psi 100 nm polikarbonat membran, filtre gözenek 5 ile geçer ile 500 psi bir polikarbonat 30 nm zarından 2 mM Biz ekstrüde hidrate lipozomlar Filtre gözenek geçer. 30, 100 ve 400 nm gözenek boyutları için lipozomlar ve DLS ile ölçülen çapları 66 ± 28, 138 ± 18 ve 360 ± 25 nm (Şekil 2). Bu 47 çapı 16 nm ± kaydedildi Şekil 2, gösterildiği gibi, 50 nm polistiren boncuklar bir süspansiyon, bir kalibrasyon, standart olarak kullanıldı. Yüzde polydispersity lipozom boyutları içinde herhangi bir örtüşme olmadığını göstermektedir. Bu cihaz daha büyük parçacıklar 12 doğru var bilinen önyargı nedeniyle DLS analizi kullanırken 30 nm daha yüksek çapları gözlemlemek için tipiktir. Büyük ve küçük parçacıklar ışık saçılımı şiddetlerde süspansiyon 12 lipozomlar çözmek için bir algılama yöntemi aynı anda toplanan ve böylece daha sert edilir. Bu enstrümantal sınırlamaya rağmen, kalibrasyon eğrisi yakın bir doğrusal ilişki açıklanır. NTA parçacık kırılma indisi veya yoğunluk bağımsız bir sıvı ortam, difüzyon doğrudan gözlemler her parçacığın boyutu ölçen yeni bir teknolojidir. Bu, yüksek çözünürlükte tekniği ile DLS lipozomlar ölçümü takviye etmek için kullanılabilir. NTA kalibrasyon için kullanılan 95 çapları ± 48 ve 356 ± 51 nm, iki adet 100 nm ve 400 nm polistiren çözümler kaydetti. 30 nm ve 100 nm Lipid çözümleri daha comp kaldığı görüldü<html> olarak ortalama 29 boyutları ± 14, 95 ± 17 ve 359 ± 73 nm üreten, Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi DLS göre işlenebilir çapı. 1000 nm - NTA duyarlılığını o 50 parçacıkları ölçmek için sağlar yana mikroskobik partikülleri ölçmek için daha genel bir karakterizasyon tekniği olabilir. Kalibrasyon eğrisi kaydedilen NTA çapı karşı polikarbonat membran gözenekleri arasında doğrusal bir ilişki gösterir. <table border="1"><tbody><tr><td> Lipozom Boyutları </td><td> Algılama Eşiği </td><td> Beklenen Minimum Partikül Boyutu (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Nanosight Parametreler. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Açıklayan ekstrüzyon yöntemi akış şeması, baskının nasıl ve azot akış farklı lipozom çaplarda homojenliği kontrol eder. Lipozom hidrasyonu takiben, farklı boyutlarda tek lamelli kesecikler farklı basınçlarda farklı polikarbonat membran filtreden gözenekler aracılığıyla uzatılır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Şekil 2. Ekstrüzyon sonrası kantitatif lipozom boyutlarını açıklayan Dinamik ışık saçılımı (DLS) verileri. (A) Bar grafikler üç lipozom örnekleri arasında çapı tarif etmek için gösterilmiştir. 50 nm polistiren (PS) boncuk bir kalibrasyon standart bir referans olarak kullanılmıştır. Ortalama çapı lipozom her bir örnek için çubuğu yukarıda belirtilmiştir. X-ekseni çözümlerle haddelenmiş olduğu üzere gözenek boyutları açıklanmaktadır. Y-ekseni DLS tarafından kaydedilen çapı açıklanmaktadır. Rağmen 30 nm ve 100 nm boyutları rekorbüyük 400 nm boyutu biraz daha düşük bir boyutu kaydedildi ederken ed kendi gözenek boyutları daha yüksek değerleri, kalibrasyon eğrisi (b) x-ekseni polikarbonat membran gözenek boyutları ifade yakın bir lineer korelasyon gösterir ve y-ekseni tarif DLS tarafından lipozom çapı kaydedildi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Ekstrüzyon takiben lipozom boyutları tarif Şekil 3. Nanopartikül Takip Analizi (NTA) veri. (A), her çubuk grafik lipozom örneğin çapı temsil eder. X-ekseni çözümlerle haddelenmiş olduğu üzere gözenek boyutları açıklanmaktadır. Y-ekseni NTA tarafından kaydedilen çapı açıklanmaktadır. Ortalama çapı lipozom her numune yukarıda etiketlenmiştir. (B) NTA kalibrasyon eğrisi kaydedildi çapına karşılık filtre zarı gözenek boyutları arasındaki DLS kalibrasyon eğrisi daha doğrusal bir ilişki gösterir. X-ekseni polikarbonat membran gözenek boyutları açıklar. Y-ekseni NTA tarafından kaydedilen lipozom çapı açıklanmaktadır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Şekil 4. Ekstrüzyon ardından her lipozom boyutu (500 uM) gösteren Negatif leke transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüler. Su içinde% 1 uranil asetat öncesinde 34.000 × büyütmede kurutma ve görüntüleme için örnekler leke kullanılan nerede Karbon Formvar örgü ızgaralar olumsuz örnek boyamadan önce taburcu edildi. Boyutları 30, 100 ve 400 nm açık bir şekilde birbirinden farklıdır. Büyütme 25.000 × ayarlandı. Ölçek çubuğu 0,5 mikron temsil eder. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Şekil 5. Bir zaman elbette deneyi üç lipozom boyutları ile yapılmıştır. Dinamik ışık saçılımı (DLS) her lipozom çözelti hemen aşağıdaki ekstrüzyon için ölçüldü. Bütün lipozom çözümler 4 bekletildi °C de bir gece. Bunların çapları bir gece inkübasyondan sonra DLS tarafından kaydedildi. Hiç değişiklik 16 saat inkübasyon döneminden sonra gözlenmiştir.

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Avestin Liposofast LF-50 Extruder kullanarak, ne kadar küçük ölçekli, sentetik lipozomlar bir basınç kontrol sistemi ile hazırlanmıştır gösterdi. Bu multilamellar veziküller küçük nanopartiküllerin üretimine yol açabilir lipozom hidrasyon, sonrasında kendiliğinden oluşması dikkat etmek önemlidir. Bu küçük multilamellar veziküller kaçınılmaz olarak büyük bir filtre gözenek tarafından üretilen ünilamellar veziküllerin çözümleri heterojenite neden büyük polikarbonat membran gözen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02.432-25ml </td><td> % 95 stabilizatörler </td></tr><tr><td> Yüksek Dereceli Metanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179.337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 Extruder </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipidler </td><td> Avanti Polar Lipidler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polikarbonat Gözenekler </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td> 25 mm çapında </td></tr><tr><td> Diskler PE boşaltın </td><td> Avestin, Inc </td><td> 230600 </td><td> 25 mm çapında </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Lipozomlar, yaygın olarak protein-protein, protein-lipid etkileşimler 3, monitör ilaç teslim 4,5, ve kapsülleme 4 platformun çalışmak için taklit eden bir hücre membranı olarak kullanılan doğal ve sentetik fosfolipidler oluşan yapay olarak hazırlanmış kesecikler vardır. Fosfolipidler doğal bir misel kendisini ayıran, kavisli lipid bilayers oluşturun. 6 Lipozomlar geleneksel bilayers, yani büyük tek lamelli kesecikler (luvs), küçük tek lamelli kesecikler (SUV) ve multilamellar veziküller (MLVs) 7 büyüklüğü ve sayısına göre sınıflandırılır. Özellikle, çeşitli boyutlarda homojen lipozomlar hazırlanması endo-ve ekzositoz olayları, membran füzyon ve protein trafiğini 8, hücre sinyal hayati bir rol oynar membran eğrilik eğitim için önemlidir. 400 - Birçok grup proteinleri membran eğrilik içerir ve bu nedenle çapları lipozomlar hazırlamak süreçleri &lt;100 modüle kullanılır nasıl analizhücre fonksiyonlarını 3 davranışlarını incelemek için Nm. Diğer araçların ilgi 9 uyuşturucu taşımak ve teslim gibi lipozomlar okuyan, lipozom-ilaç kapsülleme odaklanın. Lipozom oluşumu sırasında 9 bildirildiği gibi, Drug kapsülleme elde edilebilir. Bizim ekstrüzyon adım iki nedenden dolayı kapsüllü ilaç etkilememesi gerektiğini, yani (1) ilaç kapsülleme bu adımı önce elde edilmelidir ve (2) lipozomlar güvenli sulu çekirdek ilaç taşıyan, doğal biyofiziksel istikrarı muhafaza etmelidir. Bu araştırma hedeflerini daha istikrarlı mikronaltı lipid veziküller tasarlamak için optimize edilmiş bir yöntem olan ihtiyacı göstermektedir. Bununla birlikte, mevcut lipozom hazırlama teknolojileri (sonication 10, donma ve çözülme-10, sedimantasyon) biyofiziksel sınırlar yüksek tutarlılık ve verimlilik 10,5 ile oldukça eğimli (yani çapı &lt;100 nm) lipozomlar hazırlanmasına izin vermez Bir emergi çalışmalarımembran eğrilik algılama ng alanı. Bu yazıda, biyolojik ilgili lipozomlar çeşitli için sağlam bir hazırlama yöntemi sunuyoruz. Gaz sızdırmaz şırıngalar ve polikarbonat membran 10,5 kullanarak Manuel ekstrüzyon yaygın bir uygulamadır ama gözenek boyutları uygulanan manuel basınç değişkenliği nedeniyle nedeniyle &lt;100 nm kullanırken heterojenite sık görülmektedir. Biz, çapları 30 ile 400 nm arasında değişmektedir sentetik lipozomlar hazırlamak için sabit bir basınç kontrollü ekstrüzyon cihazları istihdam. Dinamik ışık saçılması (DLS) 10, 11 ve elektron mikroskopi nanoparçacık izleme analizi (NTA) 12 bizim protokolde tarif edildiği gibi, ticari polistiren (PS), bir kalibrasyon, standart olarak kullanıldı boncuklar ile, lipozom boyutları ölçmek için kullanılmıştır. Bir yakın doğrusal korelasyon bizim basınç kontrollü lipozom hazırlık yüksek sadakat gösteren, meslek gözenek boyutları ve deneysel olarak belirlenmiştir lipozomlar arasında anlamlı karşılandıdeme usulü. Ayrıca, bu yağ vesikül hazırlama yöntemi, çeşitli boyutlarda lipozom bağımsız olarak, genel olarak uygulanabilir olduğunu göstermiştir. Son olarak, biz de en fazla 16 saate kadar Hazırlanan bu lipozomlar stabil olduğu bir zaman ders çalışmada gösterilmiştir. A temsilcisi nano boyutlu lipozom hazırlık protokolü aşağıda gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Bu protokol, homojen bir yüksek derecede mikronaltı boyutlarda lipid kesecikler hazırlanması için bir çekme yöntemi açıklar. Bu yöntem, lipozom preparatı için kontrollü bir nitrojen akışı hızları ile bir basınç kontrol sistemi kullanır. Lipid hazırlanışını<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Lipozom ekstrüzyon ve boyutu karakterizasyonu burada sunulacaktır.

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.9K Görüntüleme.  University of Colorado Boulder. Bu protokol, homojen bir yüksek derecede mikronaltı boyutlarda lipid kesecikler hazırlanması için bir çekme yöntemi açıklar. Bu yöntem, lipozom preparatı için kontrollü bir nitrojen akışı hızları ile bir basınç kontrol sistemi kullanır. Lipid hazırlanışını 1,2, Lipozom ekstrüzyon ve boyutu karakterizasyonu burada sunulacaktır.

Video: Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biyomühendislik

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Biyokimya

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Kompleks Protein Ağları için Lipid Vezikül Kapsülleme Protokolü

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, using purified components. This method is relevant for the design and construction of bioreactors and the study of complex out-of-equilibrium metabolic reaction networks. We start by reconstituting (multiple) membrane proteins into large unilamellar vesicles (LUVs) according to a previously developed protocol. We then encapsulate a mixture of purified enzymes, metabolites, and fluorescence-based sensors (fluorescent proteins or dyes) via freeze-thaw-extrusion and remove non-incorporated components by centrifugation and/or size-exclusion chromatography. The performance of the metabolic networks is measured in real time by monitoring the ATP/ADP ratio, metabolite concentration, internal pH, or other parameters by fluorescence readout. Our membrane protein-containing vesicles of 100-400 nm diameter can be converted into giant-unilamellar vesicles (GUVs), using existing but optimized procedures. The approach enables the inclusion of soluble components (enzymes, metabolites, sensors) into micrometer-size vesicles, thus upscaling the volume of the bioreactors by orders of magnitude. The metabolic network containing GUVs are&#160;trapped in microfluidic devices for analysis by optical microscopy.

Yazar Spotlight: Sentetik Hücre Mühendisliğinde Zorlukların Üstesinden Gelmek

We present a protocol for reconstituting membrane proteins and encapsulating enzymes and other water-soluble components in lipid vesicles of sub-micrometer and micrometer size.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray'ler oluşumu

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı