Diese Arbeit wurde von dem Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award unterstützt. LAM wurde von der Signaling and Cellular Verordnung National Institute of Health Ausbildungsförderung (T32 GM008759) und der NIH Ruth L. Kirschstein Pre-Doctoral Fellow (CA165349-01) unterstützt. Wir möchten Prof. Michael Stowell (CU Boulder), Prof. Douglas Rees und Prof. Rob Phillips (Caltech) für ihre wertvollen Kommentare danken.

1. Liposomenpräparat <ol><li> Abrufen einer 20 ml-Glas mit einem mit Teflon ausgekleideten Deckel. </li><li> Reinigen Sie alle Glaswaren und Spritzen mit Chloroform vor dem Gebrauch, um eine Kontamination zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie 100 ul Chloroform von Reagenzgüteklasse dem Glasfläschchen mit einer 250 ul luftdichten Glas Spritze. </li><li> In 30 l Reagens reines Methanol zu dem gleichen Glasfläschchen mit einer 100 ul luftdichten Glas Spritze. </li><li> Phosphatidylethanolamin (PAPST):: zu einer 2 mm 7:1.5:1.5 Phosphatidylcholin (POPC) vorbereiten Cholesterin-Lipid-Lösung, zu übertragen 216 ul 10 mg / mL POPC, 42 ul 10 mg / mL Papst und 20 ul von 11 mg / mL Cholesterin-Lösungen in CHCl 3 der 20 ml Glasflasche. </li><li> Verdampft die organischen Lösungsmittel unter Verwendung langsam-Flow-Argon oder Stickstoff, bis ein dünner Film von Lipiden an der Unterseite des Glasfläschchens. </li><li> Legen Sie den nicht begrenzten Glasfläschchen in einem Vakuumexsikkator für mindestens 30 Minuten, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen. </li><li> Transfer 2 ml Puffer, die vorher durch einen 0,2 Mikron-Filter geleitet, um dem Glasfläschchen zu hydratisieren die Lipide. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 4 ° C über Nacht und innerhalb von 48 Stunden. </li></ol> 2. Frost-und Tauwetter-: Für Liposomengrößen von 30 bis 100 nm nur <ol><li> Liposomensuspension Einfrieren in flüssigem Stickstoff für 15 Sekunden. </li><li> Auftauen Liposomensuspension mit einem Heizblock bei 42 ° C Temperatur für ~ 3 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 für insgesamt 5 Zyklen. </li></ol> 3. Extrusion Folgen Sie den Anweisungen, um Avestin korrekt zusammenbauen LiposoFast LF-50 Extruder, mit dem Instrument stellen in ihren Reiseführer. <ol><li> Platzieren Sie die große Öffnung Stützsieb (mit runden Löchern) in dem Träger Filtergrundplatte, gefolgt von der kreisförmigen gesinterten Schale (ohne Löcher), eine Drain-Scheibe (25 mm Durchmesser), und eine Polycarbonat-Membran (25 mm im Durchmesser). </li><li> Setzen Sie den kleinen, schwarzenO-Ring an der Oberseite der Membran, um sie auf den Träger Filter zu befestigen. </li><li> Bringen Sie die obere Filter Extruder durch Anziehen 4 Schrauben in den vier entsprechenden Löcher. </li><li> Montieren Sie den Filter auf die Extruder-Einheit unter dem großen Extruderzylinder. Fügen Sie die Liposomen-Lösung für das Zylinderrohr. Platzieren Sie den folgenden auf der Oberseite des Extrusionstrommel um: große, runde O-Ring, schmale Mütze, großen runden O-Ring-, Kreis-Kappe. </li><li> Befestigen Sie den Gasregler auf dem Extruderzylinder oben und schließen Sie alle Ventile zu Luftverlust, darunter das Überdruckventil zu verhindern. Legen Sie eine 20 ml Glasflasche oder 50-ml-Erlenmeyer-Kolben unter dem Extruder Filtereinheit. Ein Sicherheitsventil ist an den Regler angeschlossen werden und loslassen, wenn der Druck über 600 psi. Schalten Sie das Stickstoffgas und öffnen Sie das Gasventil mit dem Extruder. </li><li> Steigern Stickstoffdruck auf 25 psi für 400 nm Liposomen, 125 psi für 100 nm Liposomen und 400-500 psi für 30 nm Liposomen. </li><li> Sehen Sie sich das Liposom suspSpannen Sie wie es in den Behälter ausstößt, während der Stickstoff geschoben wird. Halten Sie den Stickstoff fließt, bis Sie beobachten nicht mehr jede Flüssigkeit, die durch den Extruder Filter in das Glasgefäß. </li></ol> 4. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) Analyse <ol><li> Bereiten 50 ul einer 20 uM Liposomenlösung. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung der Lampe und Quelle. </li><li> Öffnen Sie die DynaPro Software. </li><li> Stellen Sie die Software an die MS / X-Algorithmus Modell Liposomen von 30 nm und 100 nm und MS800-Algorithmus Modell&gt; 100 nm Liposomen erkennen zu erfassen. </li><li> Schließen Sie an die Hardware. </li><li> Jeweils 14 ul von Liposomen-Probe in die Quarzküvette und Einsatz in den Küvettenhalter. </li><li> Drücken Sie starten. </li><li> Drücken Sie nach ~ 20 stoppen - 30 Akquisitionen. </li><li> Analysieren Sie die durchschnittliche Liposomendurchmesser Gipfel im Histogramm aufgezeichnet. </li></ol> 5. Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) <ol><li> Bereiten Sie einen 500 mL, 0,1 uM LiposomenLösung. </li><li> Spülen Sie den Probenraum mit Wasser und Ethanol. </li><li> Trocknen Sie den Probenraum mit einem fusselfreien Papiertuch. </li><li> Schalten von der Laserleistung und an den Computer. </li><li> Liefern Sie 300 ul 0,1 uM Liposomenlösung zu den Probenraum. </li><li> Öffnen Sie die Temperaturregelung und die Nanopartikel-Tracking-Analyse-Software. </li><li> Drücken Sie auf die Schaltfläche Capture, um den Laser einzuschalten. </li><li> Verwenden Sie die horizontalen und vertikalen Ausrichtung auf die Bühne zu bewegen und justieren Sie die Mikroskop-Fokus. </li><li> Stellen Sie die gewünschte Temperatur (20 ° C) und Aufnahmedauer (mindestens 30 Sekunden). </li><li> Drücken Sie die Record-Taste, um mehrere Bilderrahmen der Liposomen-Partikel für eine bestimmte Menge an Zeit in Anspruch nehmen. Analysieren der Peaks, die den Durchmesser Liposomengrößen auf dem Histogramm, wie es die Bewegung der einzelnen Partikel verfolgt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Schema skizziert die Extrusion Methode ist pübel in 1. Um optimale Ergebnisse zu erhalten, Herstellung von Liposomen mit einem Durchmesser von 30 nm erfordert einen hohen Druck von ~ 500 psi und einem Durchmesser von 100 nm erfordert einen Druck von 125 psi, um eine rasche Filter zu erzielen. Für Durchmesser von 400 nm, ein Unterdruck von etwa 25 psi empfohlen eine etwas langsamere Abscheiderate, die die Vesikel zu verlängern und zu größeren, homogenen Liposomen können zu erreichen. Wir führten eine Reihe von Experimenten, um den optimalen Druck für die Erstellung von konsistenten Sub-Mikrometer-Vesikel Größen zu bestimmen. Wir variiert der Druck als auch die Anzahl der Extrusion durchläuft Polycarbonat-Filter mit einer Porengröße von 30, 100 und 400 nm und entdeckte geeigneten Druck für jede gewünschte Größe. Für 30 nm Poren, wird der Druck unter 500 psi reduziert die Fließgeschwindigkeit, was zu Dehnung und damit größere Vesikelgrößen. Für 100 nm Poren, wurde ein stetiger Strom bei 125 psi erreicht. Bei 400 nm-Poren, ermöglicht niedrigem Druck (25 psi) die Vesikel in größeren Vesikel s länglichenzialisiert. Eine langsame tropfenweise Flow Filtration ist optimal, um größere Sub-Mikrometer-Vesikel 13 zu schaffen. Wir führten DLS die Liposomengrößen extrudiert durch drei verschiedenen Durchmessern, dh 30, 100 und 400 nm zu bestimmen. DLS ist ein etabliertes Verfahren, das gestreute Licht sammelt, um die Partikeldurchmesser zu bestimmen. Wir extrudiert hydratisierten Liposomen von 2 mM durch eine Polycarbonat-Membran 30 nm bei 500 psi mit 5 Durchgängen durch den Filter Poren, eine 100 nm Polycarbonat-Membran bei 125 psi mit 5 Durchgängen durch den Filter Poren und einer 400 nm Polycarbonat-Membran bei 25 psi mit 2 durch den Filter Poren. Die Durchmesser der Liposomen gemessen und durch DLS für 30, 100 und 400 nm Porengröße waren 66 ± 28, 138 ± 18 und 360 ± 25 nm (Abbildung 2). Eine Suspension von 50 nm Polystyrolkügelchen wurde als Kalibrierstandard verwendet wie in 2, wo sie erfasst einen Durchmesser von 47 ± 16 nm dargestellt. Die prozentuale polydispersity zeigt, dass es keine Überschneidungen innerhalb Liposomen-Größen. Es ist typisch, Durchmesser größer als 30 nm zu beobachten bei der Verwendung von DLS-Analyse aufgrund der bekannten Bias dieses Instrument zu größeren Partikel 12. Lichtstreuung Intensitäten von großen und kleinen Partikeln gleichzeitig von einem Nachweisverfahren gesammelt und damit schwerer zu Liposomen in Suspension 12 zu lösen. Trotz dieser Einschränkung instrumental, beschreibt die Eichkurve eine nahezu lineare Korrelation. NTA ist eine neue Technologie, die die Größe der einzelnen Partikel aus direkten Beobachtungen der Diffusion in einem flüssigen Medium, unabhängig von Teilchen Brechungsindex oder Dichte mißt. Das hochauflösende Technik kann verwendet werden, um die Messung von Liposomen mit DLS ergänzen. Die NTA aufgezeichnet Durchmesser von 95 ± 48 und 356 ± 51 nm, zwei 100 nm und 400 nm Polystyrol-Lösungen wurden für die Kalibrierung verwendet. Lipid-Lösungen von 30 nm und 100 nm beobachtet, um eine Layout-Datei haben<html> landwirtschaftlicher Durchmesser zu den DLS wie in 3 gezeigt ist, wodurch durchschnittlichen Größen von 29 ± 14, 95 ± 17 und 359 ± 73 nm aufweist. 1000 nm - Die NTA kann eine allgemeinere Charakterisierung Technik, um mikroskopisch kleine Partikel zu quantifizieren, da seine Empfindlichkeit erlaubt es, Partikel von 50 zu messen sein. Die Eichkurve zeigt eine lineare Korrelation zwischen den Polycarbonat-Membran Poren im Vergleich zu dem aufgezeichneten NTA Durchmesser. <table border="1"><tbody><tr><td> Liposomengrößen </td><td> Nachweisgrenze </td><td> Erwartete minimale Partikelgröße (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. NanoSight Parameter. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; 1. Flussdiagramm der Extrusionsverfahren, die beschreiben, wie der Druck und Stickstoffstrom steuert die Homogenität der verschiedenen Liposom Durchmesser. Im Anschluss an Liposomen Flüssigkeitszufuhr, sind unilamellare Vesikel verschiedener Größe durch verschiedene Polycarbonat-Membranfilter Poren mit unterschiedlichem Druck extrudiert. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dynamische Lichtstreuung (DLS) Daten zur Beschreibung der quantitativen Größen Liposomen nach der Extrusion. (A) Balkendiagramme gezeigt, um die Durchmesser der drei Liposom Beispiele beschreiben. Ein Kalibrierstandard von 50 nm Polystyrol (PS)-Kügelchen wurde als Referenz verwendet. Die durchschnittlichen Liposomen Durchmesser werden über der Bar für jede Probe angegeben. Die x-Achse beschreibt die Porengrößen von denen die Lösungen wurden extrudiert durch. Die y-Achse beschreibt den Durchmesser von DLS aufgezeichnet. Obwohl die 30 nm und 100 nm Größen EintragED-Werte höher als die Porengröße, während die größere Größe 400 nm aufgezeichnet eine etwas geringere Größe, zeigt die Eichkurve (b) eine nahezu lineare Korrelation, wobei die x-Achse drückt die Polycarbonatmembran Porengrößen und die y-Achse beschreibt die aufgezeichnet Liposomendurchmesser durch DLS. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Abbildung 3. Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) Daten zur Beschreibung der Liposomen-Größen nach der Extrusion. (A) Die Balkendiagramme stellen den Durchmesser jedes Liposom Probe. Die x-Achse beschreibt die Porengrößen von denen die Lösungen wurden extrudiert durch. Die y-Achse beschreibt die Größe Durchmesser durch die NTA aufgezeichnet. Die mittlere Liposomen Durchmessern übereinander Probe markiert. (B) Die NTA Eichkurve zeigt eine lineare Korrelation als der DLS Eichkurve zwischen den Filtermembran Porengrößen gegenüber dem Durchmesser aufgenommen. Die x-Achse beschreibt die Polycarbonatmembran Porengrößen. Die y-Achse beschreibt die aufgezeichneten Liposomendurchmesser NTA. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Abbildung 4. Negativ Fleck Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Aufnahmen zeigen jeweils Liposomengröße (500 um) extrudiert. Carbon-Mesh-Gitter wurden Formvar negativ vor der Färbung Probe entlassen, wo 1% Uranylacetat in Wasser verwendet wurde, um die Proben vor dem Trocknen und Bildgebung bei 34.000-facher Vergrößerung zu färben. Größe 30, 100 und 400 nm deutlich voneinander unterscheiden. Die Vergrößerung wurde zu 25.000 × gesetzt. Der Maßstab entspricht 0,5 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Abbildung 5. Ein Zeit-Gänge-Versuch wurde mit drei Größen Liposomen durchgeführt. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde für jede Liposomen-Lösung unmittelbar nach der Extrusion gemessen. Alle Lösungen wurden in Liposomen 4 °C über Nacht. Die Durchmesser wurden von den DLS nach Inkubation über Nacht aufgezeichnet. Wenig bis gar keine Veränderung wurde nach einer 16-stündigen Inkubationszeit beobachtet.

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	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Verwenden des Avestin LiposoFast LF-50 Extruder, haben wir gezeigt, wie kleine, synthetischen Liposomen durch ein druckgesteuertes System hergestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass multilamellare Vesikel spontan nach Liposom Hydratisierung, die Herstellung von kleineren Nanopartikel führen kann. Diese kleinen multilamellare Vesikel wird unweigerlich durch die größere Polycarbonat-Membran Porengröße fließen, wodurch Heterogenität in Lösungen von einschichtigen Vesikeln durch eine große Filterporengröße prod...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> 95% Stabilisatoren </td></tr><tr><td> High Grade Methanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179.337-4L </td><td></td></tr><tr><td> LiposoFast LF-50 Extruder </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phospholipide </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polycarbonat Poren </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td> 25 mm Durchmesser </td></tr><tr><td> Lassen Sie Discs PE </td><td> Avestin, Inc. </td><td> 230600 </td><td> 25 mm Durchmesser </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Liposomen sind künstlich hergestellte Vesikel aus natürlichen und synthetischen Phospholipiden, die weithin als eine Zellmembran imitiert Plattform, um Protein-Protein und Protein-Lipid-Wechselwirkungen 3, Drug-Delivery-Monitor 4,5 und 4 studierst Einkapselung verwendet werden. Phospholipide natürlich erstellen gebogene Lipid-Doppelschichten und zeichnet sich aus einer Micelle. 6 Liposomen werden traditionell von Größe und Anzahl der Doppelschichten, dh große unilamellare Vesikel (LUV), kleine einschichtige Vesikel (SUVs) und multilamellare Vesikel (MLV) 7 eingestuft. Insbesondere ist die Herstellung von homogenen Liposomen in verschiedenen Größen für das Studium Membrankrümmung, die eine wichtige Rolle bei der zellulären Signalübertragung, Endo-und Exozytose, Membranfusion und Proteintransport 8 wichtig. Mehrere Gruppen analysieren, wie sich Proteine ​​verwendet werden, zu modulieren Prozesse, die Membrankrümmung einzubeziehen und somit vorbereiten Liposomen mit Durchmessern &lt;100 bis 400nm bis ihr Verhalten auf Zellfunktionen 3 studierst. Andere konzentrieren sich auf Liposom-Arzneistoff-Verkapselung, Studium Liposomen als Vehikel zu transportieren und liefern ein Medikament von Interesse 9. Drug-Kapselung erreicht wie während Liposomenbildung 9 gemeldet werden. Unsere Extrusionsschritt sollte nicht die verkapselten Wirkstoffs aus zwei Gründen, dh sie sollten (1) Wirkstoffverkapselung vor diesem Schritt erreicht werden und (2) Liposomen sollten ihrer natürlichen biophysikalischen und formstabil bleibt, sicher trägt das Arzneimittel im wässrigen Kern. Diese Forschungsergebnisse legen nahe, weitere Ziele die Notwendigkeit für eine optimierte Methode, um eine stabile Sub-Mikrometer-Lipidvesikel zu entwerfen. Dennoch weisen die aktuellen Liposomenzubereitung Technologien (Beschallung 10, Frost-und Tauwetter-10, Sedimentation) nicht zulassen, Herstellung von Liposomen mit stark gekrümmten Oberfläche (dh Durchmesser &lt;100 nm) mit hoher Konsistenz und Effizienz 10,5, die der physischen Begrenztheit Studien eines Emerging Bereich der Membrankrümmung Fernerkundung. Hier präsentieren wir eine robuste Herstellungsmethode für eine Vielzahl von biologisch relevanten Liposomen. Manuelle Extrusion unter Verwendung gasdichte Spritzen und Polycarbonatmembranen 10,5 ist eine gängige Praxis, aber Heterogenität wird oft beobachtet, wenn mit Porengrößen &lt;100 nm aufgrund aufgrund der Variabilität der manuellen Druck aufgebracht. Wir verwendeten einen konstanten Druck-gesteuerten Extrusionsvorrichtung, um synthetischen Liposomen, deren Durchmesser im Bereich zwischen 30 und 400 nm herzustellen. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) 10, 11 und Elektronenmikroskopie Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) 12 wurden verwendet, um die Liposomen-Größen zu quantifizieren, wie in unserem Protokoll beschrieben, mit kommerziellen Polystyrol (PS) Perlen als Kalibrier-Standard verwendet. Eine nahezu lineare Korrelation zwischen der verwendeten Porengrößen und der experimentell bestimmten Liposomen beobachtet, was eine hohe Wiedergabetreue der druckgesteuerten Liposomenpräparation erfüllthod. Ferner haben wir gezeigt, dass diese Lipidvesikel Herstellungsverfahren allgemein anwendbar, unabhängig von verschiedenen Größen Liposom ist. Schließlich haben wir auch in einem zeitlichen Verlauf Studie zeigte, dass diese vorbereiteten Liposomen stabil waren für bis zu 16 Stunden. Ein Vertreter in Nano-Größe Liposomenzubereitung Protokoll wird unter Beweis gestellt.

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Dieses Protokoll beschreibt ein Extrusionsverfahren zur Herstellung Lipidvesikel von Submikrometer-Abmessungen mit einem hohen Grad an Homogenität. Dieses Verfahren verwendet eine Druck-Steuerung mit gesteuerten Stickstoff Flussraten für Liposomenpräparation. Die Lipid-Vorbereitung<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Wird Liposomen Extrusion, Größe und Charakterisierung Beispiele vorgestellt werden.

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.9K Aufrufe.  University of Colorado Boulder. Dieses Protokoll beschreibt ein Extrusionsverfahren zur Herstellung Lipidvesikel von Submikrometer-Abmessungen mit einem hohen Grad an Homogenität. Dieses Verfahren verwendet eine Druck-Steuerung mit gesteuerten Stickstoff Flussraten für Liposomenpräparation. Die Lipid-Vorbereitung 1,2, Wird Liposomen Extrusion, Größe und Charakterisierung Beispiele vorgestellt werden.

Serie: Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Forschung

Biotechnik

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Biochemie

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Protokoll zur Verkapselung von Lipid-Vesikeln für komplexe Proteinnetzwerke

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, using purified components. This method is relevant for the design and construction of bioreactors and the study of complex out-of-equilibrium metabolic reaction networks. We start by reconstituting (multiple) membrane proteins into large unilamellar vesicles (LUVs) according to a previously developed protocol. We then encapsulate a mixture of purified enzymes, metabolites, and fluorescence-based sensors (fluorescent proteins or dyes) via freeze-thaw-extrusion and remove non-incorporated components by centrifugation and/or size-exclusion chromatography. The performance of the metabolic networks is measured in real time by monitoring the ATP/ADP ratio, metabolite concentration, internal pH, or other parameters by fluorescence readout. Our membrane protein-containing vesicles of 100-400 nm diameter can be converted into giant-unilamellar vesicles (GUVs), using existing but optimized procedures. The approach enables the inclusion of soluble components (enzymes, metabolites, sensors) into micrometer-size vesicles, thus upscaling the volume of the bioreactors by orders of magnitude. The metabolic network containing GUVs are&#160;trapped in microfluidic devices for analysis by optical microscopy.

Autor im Rampenlicht: Herausforderungen in der Entwicklung synthetischer Zellen angehen

We present a protocol for reconstituting membrane proteins and encapsulating enzymes and other water-soluble components in lipid vesicles of sub-micrometer and micrometer size.

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen