Bu çalışma kısmen hibe no tarafından desteklenmiştir. 213/09 İsrail Bilim Vakfı, hiçbir hibe. 2005258 BSF kuruluşundan itibaren, hiçbir hibe. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) 201.665 ve Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü tarafından Technion. Biz Siyanobakterinin arz ve işlenmesiyle ilgili Technion Kimya Schulich Fakültesi Prof. Noam Adir ve Faris salame yardım kabul ediyorsunuz. Technion Mikro-Nano Fabrikasyon Ünitesi Svetlana Yoffis yardım ve desteği büyük ölçüde takdir edilmektedir.

1. ESR Micro görüntüleme Genel Bakış Öncelikle, kısa bir açıklama ESR, ESR mikroskopi ve sisteminin çeşitli bileşenleri sağlamak ve o zaman gerçek görüntüleme deneyleri anlatacağız. Elektron spin rezonans, altına yerleştirilen bir dış statik manyetik alan (Şekil 1), belirli bir frekansta elektromanyetik radyasyon eşleşmemiş elektron spin molekülleri tarafından emildiği bir spektroskopik tekniktir. ESR, serbest radikaller ve paramanyetik merkezleri ve kimlik tespiti için, kimya, biyoloji, fizik, malzeme bilimi gibi bilim geniş alanlarda istihdam edilmektedir. Bu canlı türlerinin paramanyetik moleküllerin çevre eğitimi için güçlü bir yöntemdir ve asitlik (pH), viskozite, oksijen, ve reaktif oksijen türleri konsantrasyonları 3 hakkında bilgi sağlar. ESR, heterojen örnekleri için, spektral bilgileri, manyetik alan gradyanlar 4 kullanımı yoluyla, mekansal çözüme bir şekilde (yani, bir görüntü elde ederek) elde edilebilir. Bu esas olarak proton spin gözlemler manyetik rezonans görüntüleme (MRG) daha yaygın yöntem çok benzer. Şimdiye kadar, bu ESR görüntüleme teknikleri birkaç santimetre nispeten büyük boyutu ve çözünürlük mm çaplı canlı örnekler için uygulanmıştır. ESR görüntülemede (Örneğin Şekil 2, 5 referans alınan bakın.) Nispeten yeni bir gelişme milimetre ve alt milimetre boyutunda örneklerin ölçümleri milimetre çaplı çözünürlükte küçük hayvanlar bakarak yeteneklerini uzantısı mikron ölçekli çözünürlüğü. Bu alan, 1 mikron 2 (Şekil 3 temsilcisi örneklerini görmek) yaklaşan bir çözünürlüğe sahip 3D ESR görüntüleri sağlayabilir bugün ESR mikroskopi olarak bilinir . ESR mikroskop aslında geleneksel bir ESR spektrometresi benzer. Bu satın alma süreci ve veri işleme kontrol etmek için statik alan, spin eksitasyon ve sinyal tespiti için bir mikrodalga sistemi, örnek tutmak için bir sonda ve bilgisayarlı bir konsol üretmek için bir mıknatıs vardır. Diğer bileşenler benzersiz ESR genel görüntüleme ve ESR küçük kopya da mevcut görüntüleme probu bulunmaktadır manyetik elektronik sistemin bir parçası alanında degrade kaynakları, ve degrade bobinleri. Bizim özel sistem hakkında daha fazla bilgi protokol filmde gösterilen ve referans 2&#39;de açıklanmıştır. 2. ESR Micro görüntüleme Numune Hazırlama Bu aşama, ESR mikro görüntüleme deney için numune hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Bu aşamada hücreler sonunda trityl radikal 6 tampon çözelti ile birlikte, özel olarak hazırlanmış cam ESR mikroskopi numune kabı alt yerleştirilir . Bu protokol siyanobakteriler hücrelerinin ölçüm açıklar ve bu nedenle, diğer hücre türleri için uygun ayarlamalar numune hazırlama aşamasında gerekli olabilir. <ol><li> İlk olarak, ~ 400 400 mikron boyutunda emici kağıt birkaç kareler alınan ve daha sonra 1.2 mL (40 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon) siyanobakteriler süspansiyon ile dolu bir Eppendorf tüp içine yerleştirilir. </li><li> Süspansiyon bir mikrosantrifüj 6000 RPM 2 dakika süreyle santrifüj edilir. </li><li> Bunu takiben, supernatant tampon ~ 50 mcL siyanobakteriler dehidratasyonu önlemek için sol dışında tamamen kaldırılır. Bu sürecin bir sonucu olarak, emici kağıt siyanobakteriler hücreleri tarafından doymuş yağlardır. </li><li> Ince cımbız kullanarak, birkaç lif kağıt ayıklanır ve bir bardak gibi özel olarak hazırlanmış cam numune tutucu 7 altına yerleştirilir. Trityl BG-11 çözüm 8, 9, 3 mM (bkz: Programı 1) ince bir şırınga yardımıyla numune tutucu eklenir . Sahibi, daha sonra küçük bir hava çıkışı açık bırakarak, UV yapıştırıcı kullanarak mühürlü. <table border="1"><tbody><tr><td> Stok 4 </td><td> Stok 3 </td><td> Stok 2 </td><td> Stok 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Ferrik amonyum sitrat 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Sitrik asit: 1H2O 0.6g/liter </td&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Programı 1. BG-11 ortamın hazırlanması. </li></ol> 3. ESR Micro-görüntüleme Deneyler <ol><li> Görüntüleme deney başlamak için, ESR mikro görüntüleme sistemi açmak ve görüntüleme probu içine girdiğini rezonatör örnek eklemek. </li><li> Şimdi, bilgisayar kontrol yazılımı kullanarak, &quot;Dinle&quot; modunda sistem ve ESR ölçümleri için kullanılan prob rezonans mikrodalga frekans bulmak. </li><li> Ki, darbe dizisi için zamanlama parametrelerini ayarlamak, uygulanan mikrodalga frekans eşleşen değer statik manyetik alan ve emin olmak için ESR sinyali gözlemlemek ardından bu sistemi fonksiyonları ve örnek iyi hazırlanmış. </li><li> Sonra, piksel sayısını görüntüleme parametreleri, gradyanlar gücünü ve gerekli değerleri degrade bakliyat uzunluğu ayarlayın. </li><li> Kurulum sonrasında interpulse ayırma, değerleri  500, 600, 700 ns ile Hahn eko görüntüleme darbe dizisi (Şekil 4), üç 3D ESR görüntüleri toplamak. </li><li> Örnek olarak tahmin Işık gerekli deneysel koşullara bağlı olarak açık ya da kapalı. </li><li> Satın alma sırasında, veriler otomatik olarak kaydedilir. Tezler ham veri dosyaları sonra trityl radikal konsantrasyon ve gevşeme zamanı önceden varolan bir kalibrasyon ile bir oksijen konsantrasyonu görüntü çevrilmiştir T 2 harita görüntülerini sağlamak için Matlab yazılımı komut dosyası üzerinden işlenir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Deney sonuçlarının farklı τ değerleri kaydedilmiş üç boyutlu birkaç ESR mikro-görüntüleri. Tipik ham veri görüntüleri Şekil 5&#39;te verilmektedir. Karanlık koşullar altında ölçülen en büyük üç fotoğraf, sinyal yoğunluğunda azalma dışında çok benzer. Öte yandan, örnek farklı yerlerinde farklı dinlenme süreleri nedeniyle ışık ışınlama altında görüntü düzeni değişir. Bu veriler, Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi ve aynı zamanda gevşeme zamanı, T 2 (Şekil 7) görüntüleri bir genlik görüntü elde etmek için 1 işlenmiş olabilir. T 2 görüntüleri denklemi üzerinden rahatlama zaman oksijen konsantrasyonu bağlantılar önceden varolan bir kalibrasyon eğrisi ile oksijen konsantrasyonu değerleri çevrilir: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Denklem 1" /> Burada, T 2 0 prob spin-spin relaksasyon zamanı anoksik koşullar altında (prob konsantrasyon, C ve D difüzyon katsayısı bağlı olarak), ve k bir orantılılık sabittir. Çoğu durumda, difüzyon katsayısı (gerekirse, prensip olarak doğrudan ESR 6, 10 ile de değerlendirilebilir, fakat) canlı örnekler için çok değişmez, ve spin konsantrasyon görüntüleme işlemi sırasında elde edilir. Bu nedenle, bu ilişkiyi doğrudan oksijen konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir. Şekil 6 geri dönecek olursak, siyanobakteriler hücreler esas numune tutucu sağ tarafta yer olduğunu genlik görüntü açıktır. Ayrıca, Şekil 7 dayalı, ışık O 2 üretimi başlatır ve özellikle siyanobakteriler yakın vokseller, çözümün O 2 konsantrasyonunda önemli bir artışa neden olduğu açıktır. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: elektron spin rezonans enerji seviyeleri. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Tipik bir Tümör taşıyan fare oksijen konsantrasyonu görüntü. MRI görüntü dayalı anatomik bilgi, soldaki görüntü gösterir. Kararlı bir serbest radikal organik fare enjekte ve kendi ESR özellikleri, çevresi (sağda), oksijen konsantrasyonu sağlar. ESR tabanlı sonuçları MRG anatomik görüntü üzerine bindirilmiş. Görüş alanı 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: yüksek çözünürlüklü mikro ölçekli ES iki örnekPhotolithographically N @ C 60 tozu (solda) ve LiPc paramanyetik kristalleri ile oluşturulan örnek R görüntüleri (sağda) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4: mikrodalga (MW) gösteren ve degrade, G x, G y ve G z bakliyat Tipik Hahn görüntüleme darbe dizisi <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5: Tipik ham veri ESR mikro görüntüler: a, b ve c = 500.600.700 ns sırasıyla τ ölçülen ışık aydınlatma cyanobacterium örnek ham veriler. Öğeler, d, e, ve a, b ve c gibi ama ışık aydınlatması ile aynıdır. Yoğunluğu keyfi ölçeğinde çizilmiştir (ancak, üç karanlık veya hafif ham veri görüntüleri her içinde tutarlı) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6: Genlik radikal çözüm konsantrasyonu (keyfi ölçekli) karşılık gelen görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7: T 2 görüntüler ve ilgili [O 2] değerleri koyu (solda) ve ışık koşulları altında (sağda).

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

Bu protokol, ESR mikro-görüntüleme canlı küçük örnekler yanında oksijen konsantrasyonu haritaya nasıl uygulanabileceğini gösteriyor. Mekansal çözünürlükte ~ 30 x 30 x 100 mikron yakın mikromolar oksijen konsantrasyonu duyarlılık ve voksel başına alt femtomole mutlak oksijen hassasiyeti göstermiştir. ESR mikro görüntüleme kullanımı hücrelerin yakın oksijen haritalama için mikro elektrotlar veya fosforesans / floresan dayalı mevcut teknikleri tamamlar. Ayrıca, uygun paramanyetik probu ile, hücre içi oksijen mikro-görüntüleme, diğer yöntemlerle elde etmek için çok zor bir yeteneği kolayca uygulanabilir olacaktır. Yakın bir gelecekte, süper oksit konsantrasyonu, asitlik (pH), prob difüzyon katsayısı ve tabii ki, oksijen konsantrasyonu gibi kontrast parametreleri sağlayarak, daha birkaç mikron çözünürlüğü ile canlı örnek görüntüler elde etmek için bu metodoloji geliştirmek planlıyoruz. Bu yetenekler, kontrast tip açısından ve hem de örnekleri özellikleri (bazı durumlarda örneğin şeffaf olmayan kalın örnekleri, hücre içi vs. Ekstrasellüler ölçümler) mevcut optik tabanlı yöntemlere tamamlayıcı niteliktedir.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>BG-11 buffer</td><td></td><td></td><td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet Curing</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63, or NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

Bu protokol mikron ölçekli çözünürlük 1 canlı hücreleri derhal ortamda oksijen düzeyleri üç boyutlu haritalama için bir elektron spin rezonans (ESR) mikro görüntüleme yöntemi açıklamaktadır. Oksijen yaşam döngüsünde en önemli moleküllerden biridir. Mitokondride oksidatif fosforilasyon terminal elektron alıcısı olarak görür ve reaktif oksijen türlerinin üretiminde kullanılır. Oksijen ölçümleri, mitokondriyal ve metabolik fonksiyonları, sinyal yolları, çeşitli uyaranların, membran geçirgenlik ve hastalık farklılaşma etkisi çalışması için önemlidir. Oksijen tüketimi, bu nedenle, bütün organizmaların hücreleri mitokondri çeşitli biyolojik sistemler geniş uygulanabilir hücre metabolizması, bilgilendirici bir göstergedir. Önemi nedeniyle, pek çok yöntem canlı sistemlerde oksijen ölçümleri için geliştirilmiştir. Şu girişimleri yüksek çözünürlüklü oksijen görüntüleme sağlamak için, özellikle yüksek foto-toksisite ve düşük oksijen hassasiyeti problar istihdam olarak tatmin edici sonuçlar sağlamak için başarısız optik floresans ve fosforesans yöntemleri dayanmaktadır. ESR, örnek dışsal paramanyetik probları sinyal ölçer, oksijen konsantrasyonu çok hassas ölçümler sağlamak için bilinir. Tipik bir vakada, ESR ölçümleri prob lineshape genişletilmesi ve / veya yerel oksijen konsantrasyonu doğrudan bağlantılı olan dinlenme süresini kısaltarak haritası. (Oksijen paramanyetik; bu nedenle, dışsal paramanyetik probu ile çarpışan, onun rahatlama kez darlığı.) Geleneksel olarak, bu tür deneyler, düşük çözünürlüklü, küçük hayvanlar görüntüleme için milimetre çaplı ESR ile yürütülmektedir. Burada da küçük canlı örneklerin incelenmesi için ESR görüntüleme mikron ölçeğinde yapılmalıdır nasıl göstermektedir. ESR mikro görüntüleme, oda sıcaklığında 2 1 mikron yaklaşan bir çözünürlük ile mekansal çözüme ESR sinyalleri toplanmasını sağlayan nispeten yeni bir metodoloji . Bu protokol kağıt ana amacı, bu yeni yöntem, yeni geliştirilen oksijen duyarlı problar ile birlikte, küçük canlı örneklerinde oksijen düzeyleri haritalama uygulanabilir nasıl göstermektir. Mekansal çözünürlükte ~ 30 x 30 x 100 mikron yakın mikromolar oksijen konsantrasyonu duyarlılık ve voksel başına alt femtomole mutlak oksijen hassasiyeti göstermiştir. ESR mikro görüntüleme kullanımı hücrelerin yakın oksijen haritalama için mikro elektrotlar veya fosforesans / floresan dayalı mevcut teknikleri tamamlar. Ayrıca, uygun paramanyetik probu ile, aynı zamanda hücre içi oksijen mikro-görüntüleme, diğer yöntemlerle elde etmek için çok zor bir yeteneği kolayca uygulanabilir olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping at JoVE.com

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K Görüntüleme.  The Technion, Israel Institute of Technology. Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.

Video: Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of redox-regulated signaling in biological settings. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is the only direct method to assess free radicals unambiguously. Its advantage is that it detects physiologic levels of specific species with a high specificity, but it does require specialized technology, careful sample preparation, and appropriate controls to ensure accurate interpretation of the data. Cyclic hydroxylamine spin probes react selectively with superoxide or other radicals to generate a nitroxide signal that can be quantified by EPR spectroscopy. Cell-permeable spin probes and spin probes designed to accumulate rapidly in the mitochondria allow for the determination of superoxide concentration in different cellular compartments.
In cultured cells, the use of cell permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) along with and without cell-impermeable superoxide dismutase (SOD) pretreatment, or use of cell-permeable PEG-SOD,&#160;allows for the differentiation of extracellular from cytosolic superoxide. The mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) allows for measurement of mitochondrial ROS (predominantly superoxide).
Spin probes and EPR spectroscopy can also be applied to in vivo models. Superoxide can be detected in extracellular fluids such as blood and alveolar fluid, as well as tissues such as lung tissue. Several methods are presented to process and store tissue for EPR measurements and deliver intravenous 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin probe in vivo. While measurements can be performed at room temperature, samples obtained from in vitro and in vivo models can also be stored at -80 &#176;C and analyzed by EPR at 77 K. The samples can be stored in specialized tubing stable at -80 &#176;C and run at 77 K to enable a practical, efficient, and reproducible method that facilitates storing and transferring samples.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is an unambiguous method to measure free radicals. The use of selective spin probes allows for detection of free radicals in different cellular compartments. We present a practical, efficient method to collect biological samples that facilitate treating, storing, and transferring samples for EPR measurements.

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Biyokimya

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs O2 sensitive luminescent sensor foils (planar optodes) in combination with a specialized camera system for imaging luminescence lifetime in the frequency-domain. Planar optodes are prepared by dissolving the O2-sensitive indicator dye in a polymer and spreading the mixture on a solid support in a defined thickness via knife coating. After evaporation of the solvent, the planar optode is placed in close contact with the sample of interest - here demonstrated with the roots of the aquatic plant Littorella uniflora. The O2 concentration-dependent change in the luminescence lifetime of the indicator dye within the planar optode is imaged via the backside of the transparent carrier foil and aquarium wall using a special camera. This camera measures the luminescence lifetime (&#181;s) via a shift in phase angle between a modulated excitation signal and emission signal. This method is superior to luminescence intensity imaging methods, as the signal is independent of the dye concentration or intensity of the excitation source, and solely relies on the luminescence decay time, which is an intrinsically referenced parameter. Consequently, an additional reference dye or other means of referencing are not needed. We demonstrate the use of the system for macroscopic O2 imaging of plant rhizospheres, but the camera system can also easily be coupled to a microscope.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe the use of a novel, frequency-domain luminescence lifetime camera for mapping 2D O2 distributions with optical sensor foils. The camera system and image analysis procedures are described along with the preparation, calibration and application of sensor foils for visualizing the O2 microenvironment in the rhizosphere of aquatic plants.

Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemi ile O2'nin Lüminesans Yaşam Boyu Görüntülemesi

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Kimya

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Hızlı Tarama Elektron Paramagnetik Rezonans Görüntüleme Fizyolojik Önemli Parametreler için Yeni bulvarlar açar<em&gt; İn Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>EPRI ve Ultrason Kullanılarak Tümör Oksijen Seviyelerinin Klinik Öncesi Görüntülenmesi

Tumor Hypoxia Assessment: In Vivo 3D Oxygen Imaging Through Electron Paramagnetic Resonance

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 (i.e., hypoxia) is connected to tumor aggressiveness and poor response to therapy. The quantification of tumor pO2 allows the evaluation of treatment effectiveness. Electron Paramagnetic Resonance Imaging (EPRI), particularly Pulse EPRI, has emerged as an advanced three-dimensional (3D) method of assessing tissue oxygenation in vivo. This innovation was enabled by the technological developments in EPR (Electron Paramagnetic Resonance) and the application of the water-soluble oximetric spin probes from the triaryl family, offering fast and sensitive oxygenation data. The relaxation time of the spin probe (T1 and/or T2) provides accurate information about pO2 in selected voxels.
Human glioblastoma LN229 tumors were grown in the interscapular fad pad of BALB/c nude mice. Ultrasound (US) imaging was used as a reference for tumor anatomical information. To image tissue pO2, the animals were placed in a fixed position in the animal bed with fiducials, enabling registration between the imaging modalities. After the OX071 contrast agent was administered, EPRI was performed, followed by US B-mode. Because of the low spin probe toxicity, the procedure can be repeated during tumor growth or treatment. Following imaging, the registration process was carried out using software written in MATLAB. Ultimately, the hypoxic fraction can be calculated for a specific tumor, and the histogram of pO2 tissue distribution can be compared over time. EPRI combined with ultrasound is an excellent tool for oxygen mapping of tumors in the preclinical setting.

<meta charset="utf8"></head><body>Tümör Hipoksi Değerlendirmesi: Elektron Paramanyetik Rezonans ile İn Vivo 3D Oksijen Görüntüleme

Quantitative 3D oxygen maps of murine tumors were imaged noninvasively using Pulse Electron Paramagnetic Resonance. Ultrasound B-mode and Power Doppler were used for anatomy and vascular structure. Images from both modalities were superimposed enabling multi-parametric tumor analysis.

Tümör Hipoksi Değerlendirmesi: Elektron Paramanyetik Rezonans ile İn Vivo 3D Oksijen Görüntüleme 

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 ...

Kanser Araştırmaları

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Biyoloji

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Doku Teşhisi için Fare Beyninin Gerçek Zamanlı, İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemi ile O_2'nin Lüminesans Yaşam Boyu Görüntülemesi

Hızlı Tarama Elektron Paramagnetik Rezonans Görüntüleme Fizyolojik Önemli Parametreler için Yeni bulvarlar açar

Tümör Hipoksi Değerlendirmesi: Elektron Paramanyetik Rezonans ile İn Vivo 3D Oksijen Görüntüleme

Tümör Hipoksi Değerlendirmesi: Elektron Paramanyetik Rezonans ile İn Vivo 3D Oksijen Görüntüleme

Tümör Hipoksi Değerlendirmesi: Elektron Paramanyetik Rezonans ile İn Vivo 3D Oksijen Görüntüleme

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Doku Teşhisi için Fare Beyninin Gerçek Zamanlı, İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi