Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse nicht unterstützt. 213/09 vom israelischen Science Foundation, Grant No. 2005258 vom BSF Stiftung Grant No. 201665 vom European Research Council (ERC) und der Russell Berrie Institut für Nanotechnologie am Technion. Wir erkennen die Hilfe von Prof. Noam Adir und Faris Salame aus der Schulich Fakultät für Chemie am Technion in Bezug auf die Versorgung und Behandlung der Cyanobakterien. Die Hilfe und die Unterstützung von Svetlana Yoffis vom Technion Micro-Nano Fabrication Unit ist sehr geschätzt.

1. Übersicht der ESR Micro-Imaging Erstens bieten wir eine kurze Erläuterung der ESR, ESR-Mikroskopie und die verschiedenen Komponenten unseres Systems, und dann werden wir die tatsächliche Imaging Experimente beschreiben. Elektronen-Spin-Resonanz ist eine spektroskopische Technik, bei der elektromagnetische Strahlung bei einer bestimmten Frequenz durch Moleküle mit ungepaarten Elektronenspins absorbiert wird, platziert im Rahmen eines externen statischen Magnetfeld (Abbildung 1). ESR ist in weiten Bereichen der Wissenschaft, wie Chemie, Biologie, Physik und Materialwissenschaften beschäftigt, für die Detektion und Identifizierung von freien Radikalen und paramagnetischen Zentren. Es ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der Umgebung von paramagnetischen Molekülen in lebenden Arten und gibt Auskunft über Säuregrad (pH), Viskosität, Sauerstoff und reaktiven Sauerstoff-Spezies-Konzentrationen 3. Für heterogene Proben, kann ESR spektralen Informationen in ortsaufgelöst (dh durch den Erwerb eines Bildes) gewonnen werden, durch den Einsatz von Magnetfeldgradienten 4. Dies ist sehr ähnlich zu den gängigen Verfahren der Magnetresonanztomographie (MRT), die vor allem beobachtet Protonenspins. Bis jetzt wurden solche ESR bildgebenden Verfahren für lebende Exemplare mit relativ großen Abmessungen von wenigen Zentimetern und in mm-Skala Auflösung. (Zum Beispiel siehe Abbildung 2 aus Lit. 5 entnommen.) Eine relativ neue Entwicklung in ESR-Bildgebung ist die Erweiterung seiner Fähigkeiten aus der Betrachtung Kleintiere im Millimeter-Skala Auflösung der Messungen von Millimeter-und Sub-Millimeter-Größe Proben mit Mikrometer-Skala Auflösung. Dieses Feld wird als ESR-Mikroskopie, die heute 3D-ESR Bilder mit einer Auflösung von fast 1 micron 2 (siehe repräsentative Beispiele in Abbildung 3) kann liefern bekannt. Ein ESR-Mikroskop ist im Wesentlichen ähnlich wie bei einem konventionellen ESR-Spektrometers. Es hat einen Magneten zur Erzeugung des statischen Feldes, ein Mikrowellen-System zum Spinanregung und Signalerkennung, eine Sonde zur Aufnahme der Probe, und ein EDV-Konsole auf den Erwerb Prozess-und Daten-Handling zu kontrollieren. Andere Komponenten einzigartige ESR Bildgebung im Allgemeinen und auch in bestehende ESR Mikrokopie sind Magnetfeldgradienten Quellen, die Teil des elektronischen Systems sind, und Gradientenspulen, die in der Imaging-Sonde entfernt. Weitere Details über unsere speziellen Systems sind in das Protokoll Film gezeigt und beschrieben in Referenz 2. 2. ESR Micro-Imaging Probenvorbereitung Diese Stufe beschreibt die Methode für die Probenvorbereitung für die ESR-Mikro-Imaging Experiment. Am Ende dieser Phase-Zellen sind an der Unterseite eines speziell präparierten Glas ESR-Mikroskopie Probenbehälter zusammen mit einem Trityl-Radikals 6 Pufferlösung gelegt. Dieses Protokoll beschreibt die Messung von Cyanobakterien-Zellen und somit für andere Arten von Zellen, angemessene Anpassungen können in der Probenvorbereitung der Bühne benötigt werden. <ol><li> Zuerst werden ein paar Plätze von saugfähigen Papier mit einer Größe von ~ 400 400 um entnommen und in ein Eppendorf-Röhrchen, die anschließend mit 1,2 ml der Cyanobakterien Suspension (bei einer Konzentration von 40 mg / mL) gefüllt ist. </li><li> Die Suspension wird für 2 Minuten bei 6000 RPM in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. </li><li> Anschließend wird der Überstand Puffer vollständig außer für ~ 50 ul, die von links nach Cyanobakterien Austrocknung zu vermeiden, werden entfernt. Als Ergebnis dieses Prozesses ist die saugfähigen Papier nun durch die Cyanobakterien-Zellen gesättigt. </li><li> Mit feinen Pinzette, sind ein paar Fasern aus dem Papier extrahiert und auf dem Boden eines topfartigen speziell präparierten Glasprobe Halter 7. Nach, dass eine 3 mM Trityl in BG-11-Lösung 8, 9 (siehe Schema 1), um den Probenhalter wird durch die Hilfe einer feinen Spritze zugegeben. Der Halter ist dann versiegelt mit UV-härtenden Klebstoff, so dass eine kleine Luftauslass zu öffnen. <table border="1"><tbody><tr><td> Lager 4 </td><td> Lager 3 </td><td> Lager 2 </td><td> Lager 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Eisenammoniumcitrat 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7 H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Zitronensäure: 1H2O 0.6g/liter </td&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5 H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6 H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Schema 1. Vorbereitung der BG-11 Medium. </li></ol> 3. ESR Micro-Imaging-Experiments <ol><li> Zu Beginn der Imaging-Experiment auf der ESR-Mikro-Imaging-System ein und legen die Probe in den Resonator, die innerhalb der Imaging-Sonde geht. </li><li> Jetzt, mit dem Computer-Software, stellen Sie das System auf &quot;Tune&quot;-Modus und finden Sie die Resonanz Mikrowellenfrequenz der Sonde, die für die ESR-Messungen verwendet werden. </li><li> Im Anschluss daran setzte das statische Magnetfeld auf den Wert, dass die angewandten Mikrowellenfrequenz entspricht, setzen Sie die Timing-Parameter für die Impulsfolge und beobachten Sie die ESR-Signal, um sicherzustellen, dass das System gut funktioniert und die Probe wird gut vorbereitet. </li><li> Dann setzen Sie die Imaging-Parameter, wie zB die Anzahl der Pixel, die Stärke des Gradienten und die Länge der Gradientenpulsen ihre geforderten Werte. </li><li> Nach Setup sammeln drei 3D-ESR Bilder von einem Hahn-Echo-Bildgebung Pulssequenz (Abbildung 4) mit Puls-Trennung, Werte  500, 600 und 700 ns. </li><li> Licht auf die Probe projiziert wird ein-oder ausschalten abhängig von der erforderlichen experimentellen Bedingungen gedreht. </li><li> Bei der Aufnahme werden die Daten automatisch gespeichert. Thesen Rohdaten-Dateien werden dann via Matlab Software Skript verarbeitet werden, um Bilder der Tritylradikal Konzentration und die Relaxationszeit T 2 Karte, die in einer Sauerstoff-Konzentration image via vorbestehenden Kalibrierung übersetzt sind. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Ergebnisse des Experiments sind mehrere dreidimensionale ESR Mikro-Bilder mit unterschiedlichen τ-Werte aufgezeichnet. Typische Rohdaten Bilder sind in Abbildung 5 zur Verfügung gestellt. Die besten drei Bilder, unter dunklen Bedingungen gemessen, sind sehr ähnlich, außer für die Reduktion der Signalintensität. Auf der anderen Seite, das Bildmuster Veränderungen unter Bestrahlung mit Licht durch die unterschiedlichen Relaxationszeiten in verschiedenen Teilen der Probe. Diese Daten können 1 verarbeitet werden, um eine Amplitude Bild zu erhalten, wie in Abbildung 6 gezeigt, und auch Bilder von der Relaxationszeit T 2 (Abbildung 7). Die T 2 Bilder werden in Sauerstoffkonzentration Werte über eine bereits vorhandene Kalibrierkurve, dass die Sauerstoffkonzentration auf die Relaxationszeit über die Gleichung Links übersetzt: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Gleichung 1" /> Hier ist T 2 0 der Spin-Spin-Relaxationszeit von der Sonde unter anoxischen Bedingungen (abhängig von der Sonde Konzentration, C, und die Diffusionskoeffizienten, D), und k eine Proportionalitätskonstante ist. In den meisten Fällen ist der Diffusionskoeffizient variiert nur wenig für die Live-Proben (obwohl, wenn nötig, es kann im Prinzip direkt ausgewertet auch durch ESR 6, 10), und die Spin-Konzentration während der bildgebenden Verfahren erhalten. Daher kann diese Beziehung zur direkten Messung der Sauerstoffkonzentration werden. Gehen wir zurück zu Abbildung 6 geht hervor, aus der Amplitude Bild, dass die Cyanobakterien-Zellen hauptsächlich auf der rechten Seite des Probenhalters befanden. Darüber hinaus, basierend auf Abbildung 7, ist es klar, dass das Licht die Produktion von O 2 initiiert und führt zu einem signifikanten Anstieg in der Lösung O 2-Konzentration, vor allem in der Voxel in der Nähe der Cyanobakterien. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Energie-Ebenen in Elektronen-Spin-Resonanz. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Typische Sauerstoffkonzentration Bild einer tumortragenden Maus. Das Bild links zeigt die anatomischen Informationen, auf einem MRT-Bild basiert. Ein stabiles freies organisches Radikal war es, die Maus injiziert und dessen ESR Eigenschaften bieten die Sauerstoffkonzentration an seine Umwelt (rechts). ESR-basierte Ergebnisse sind in der MRT anatomischen Bild überlagert. Sehfeld von 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Zwei Beispiele für hochauflösende Mikro-Maßstab ESR Bilder von photolithographisch erzeugte Probe mit N @ C 60 Pulver (links) und LiPc paramagnetischen Kristallen (rechts) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: Typische Hahn bildgebenden Pulssequenz zeigt der Mikrowelle (MW) und Steigung, G x, G y und G z Impulse. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: Typische Rohdaten ESR Mikro-Bilder: a, b und c sind Rohdaten der Cyanobakterium Probe ohne Beleuchtung für τ gemessen = 500600700 ns bzw.. Items d, e, und sind die gleichen wie a, b und c, aber mit Beleuchtung. Die Intensität ist in willkürlichen Maßstab aufgetragen (ist aber in jedem Satz von drei dunkle oder helle Rohdaten Bilder konsistent) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6: Amplitude entsprechendes Bild der radikalen Konzentration in der Lösung (willkürliche Skala). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7: T 2 Bilder und die entsprechenden [O 2] Werte unter dunkel (links) und Licht (rechts) Bedingungen.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

Dieses Protokoll zeigt, wie ESR Mikro-Imaging eingesetzt werden, um Sauerstoff-Konzentration in der Nähe leben, kleine Proben abzubilden. Eine räumliche Auflösung von ca. 30 x 30 x 100 pm nachgewiesen wird, mit nahezu mikromolaren Sauerstoffkonzentration Sensitivität und sub-Femtomol absolute Sauerstoffempfindlichkeit pro Voxel. Der Einsatz von ESR Mikro-Imaging für Sauerstoff-Mapping in der Nähe Zellen ergänzt die derzeit verfügbaren Techniken der Mikro-Elektroden oder Fluoreszenz / Phosphoreszenz basiert. Darüber hinaus mit der richtigen paramagnetischen Sonde, wird es leicht anwendbar für die intrazelluläre Sauerstoff-Mikro-Imaging, eine Fähigkeit, die andere Methoden finden, sehr schwer zu erreichen. In naher Zukunft planen wir auf eine weitere Verbesserung dieser Methodik zu leben Probe Bilder mit einer Auflösung von wenigen Mikrometern zu schaffen, bietet dagegen Parameter wie Superoxid-Konzentration, Säuregrad (pH), Sonde Diffusionskoeffizienten und, natürlich, Sauerstoffkonzentration. Diese Fähigkeiten sind komplementär zu den aktuellen optischen-basierten Methoden sowohl in Bezug auf Kontrast-Typ und auch von Proben Merkmale (z. B. nicht-transparenten dicken Proben und in einigen Fällen intrazellulären vs extrazelluläre Messungen).

<table><tbody><tr><td>Centrifuge </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>BG-11 buffer</td><td></td><td></td><td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet Curing</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63, or NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

Dieses Protokoll beschreibt ein Elektron-Spin-Resonanz (ESR) Mikro-Imaging-Methode zur dreidimensionalen Abbildung von Sauerstoff in der unmittelbaren Umgebung lebende Zellen mit Mikrometer-Skala Auflösung 1. Sauerstoff ist eines der wichtigsten Moleküle in den Kreislauf des Lebens. Es dient als terminaler Elektronenakzeptor der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien und ist in der Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies verwendet. Messungen der Sauerstoff für das Studium der Mitochondrien und Stoffwechselfunktionen, Signalwege, die Auswirkungen der verschiedenen Reize, Membranpermeabilität und Krankheit Differenzierung wichtig. Sauerstoffverbrauch ist daher eine informative Marker des zellulären Stoffwechsels, die weitgehend für die verschiedenen biologischen Systemen aus den Mitochondrien von Zellen bis zu ganzen Organismen ist. Aufgrund seiner Bedeutung ist, haben viele Methoden für die Messung von Sauerstoff in Live-Systemen entwickelt. Aktuelle Versuche, hochauflösenden Sauerstoff Bildgebung bieten sich vor allem auf optische Fluoreszenz und Phosphoreszenz Methoden, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen, wie sie Sonden mit hoher Bild-Toxizität und geringe Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff beschäftigen scheitern basiert. ESR, die das Signal vom exogenen paramagnetischen Sonden in der Probe misst, ist bekannt, dass sehr genaue Messungen der Sauerstoffkonzentration liefern. In einem typischen Fall map ESR-Messungen der Sonde Linienform Verbreiterung und / oder Entspannungs-Zeit verkürzen, die direkt an der lokalen Sauerstoffkonzentration verbunden. (Sauerstoff ist paramagnetisch; daher beim Zusammenstoß mit der exogenen paramagnetischen Sonde, Kurzatmigkeit sie ihren Relaxationszeiten.) Traditionell diese Art von Experimenten mit niedriger Auflösung, Millimeter-Skala ESR für Kleintiere Imaging durchgeführt. Hier zeigen wir, wie ESR Bildgebung kann auch in den Mikrometer-Maßstab durchgeführt werden für die Untersuchung von kleinen Live-Proben. ESR Mikro-Imaging ist eine relativ neue Methode, die den Erwerb von ortsaufgelösten ESR-Signale mit einer Auflösung von fast 1 Mikron bei Raumtemperatur 2 ermöglicht. Das Hauptziel dieses Protokoll-Papier ist zu zeigen, wie diese neue Methode, zusammen mit neu entwickelten Sauerstoff-sensitive Sonden kann die Zuordnung der Sauerstoffgehalt in kleine Live-Proben angewandt werden. Eine räumliche Auflösung von ca. 30 x 30 x 100 pm nachgewiesen wird, mit nahezu mikromolaren Sauerstoffkonzentration Sensitivität und sub-Femtomol absolute Sauerstoffempfindlichkeit pro Voxel. Der Einsatz von ESR Mikro-Imaging für Sauerstoff-Mapping in der Nähe Zellen ergänzt die derzeit verfügbaren Techniken der Mikro-Elektroden oder Fluoreszenz / Phosphoreszenz basiert. Darüber hinaus mit der richtigen paramagnetischen Sonde, wird es auch leicht anwendbar für die intrazelluläre Sauerstoff-Mikro-Imaging, eine Fähigkeit, die andere Methoden finden, sehr schwer zu erreichen.

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Mikrometer-Skala dreidimensionale Bildgebung der Sauerstoffkonzentration in der unmittelbaren Umgebung der lebenden Zellen durch Elektronen-Spin-Resonanz-Mikroskopie.

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K Aufrufe.  The Technion, Israel Institute of Technology. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Mikrometer-Skala dreidimensionale Bildgebung der Sauerstoffkonzentration in der unmittelbaren Umgebung der lebenden Zellen durch Elektronen-Spin-Resonanz-Mikroskopie.

Serie: Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of redox-regulated signaling in biological settings. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is the only direct method to assess free radicals unambiguously. Its advantage is that it detects physiologic levels of specific species with a high specificity, but it does require specialized technology, careful sample preparation, and appropriate controls to ensure accurate interpretation of the data. Cyclic hydroxylamine spin probes react selectively with superoxide or other radicals to generate a nitroxide signal that can be quantified by EPR spectroscopy. Cell-permeable spin probes and spin probes designed to accumulate rapidly in the mitochondria allow for the determination of superoxide concentration in different cellular compartments.
In cultured cells, the use of cell permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) along with and without cell-impermeable superoxide dismutase (SOD) pretreatment, or use of cell-permeable PEG-SOD,&#160;allows for the differentiation of extracellular from cytosolic superoxide. The mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) allows for measurement of mitochondrial ROS (predominantly superoxide).
Spin probes and EPR spectroscopy can also be applied to in vivo models. Superoxide can be detected in extracellular fluids such as blood and alveolar fluid, as well as tissues such as lung tissue. Several methods are presented to process and store tissue for EPR measurements and deliver intravenous 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin probe in vivo. While measurements can be performed at room temperature, samples obtained from in vitro and in vivo models can also be stored at -80 &#176;C and analyzed by EPR at 77 K. The samples can be stored in specialized tubing stable at -80 &#176;C and run at 77 K to enable a practical, efficient, and reproducible method that facilitates storing and transferring samples.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is an unambiguous method to measure free radicals. The use of selective spin probes allows for detection of free radicals in different cellular compartments. We present a practical, efficient method to collect biological samples that facilitate treating, storing, and transferring samples for EPR measurements.

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Forschung

Biochemie

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs O2 sensitive luminescent sensor foils (planar optodes) in combination with a specialized camera system for imaging luminescence lifetime in the frequency-domain. Planar optodes are prepared by dissolving the O2-sensitive indicator dye in a polymer and spreading the mixture on a solid support in a defined thickness via knife coating. After evaporation of the solvent, the planar optode is placed in close contact with the sample of interest - here demonstrated with the roots of the aquatic plant Littorella uniflora. The O2 concentration-dependent change in the luminescence lifetime of the indicator dye within the planar optode is imaged via the backside of the transparent carrier foil and aquarium wall using a special camera. This camera measures the luminescence lifetime (&#181;s) via a shift in phase angle between a modulated excitation signal and emission signal. This method is superior to luminescence intensity imaging methods, as the signal is independent of the dye concentration or intensity of the excitation source, and solely relies on the luminescence decay time, which is an intrinsically referenced parameter. Consequently, an additional reference dye or other means of referencing are not needed. We demonstrate the use of the system for macroscopic O2 imaging of plant rhizospheres, but the camera system can also easily be coupled to a microscope.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe the use of a novel, frequency-domain luminescence lifetime camera for mapping 2D O2 distributions with optical sensor foils. The camera system and image analysis procedures are described along with the preparation, calibration and application of sensor foils for visualizing the O2 microenvironment in the rhizosphere of aquatic plants.

Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von O2 mit einem Frequency-Domain-basierten Kamerasystem

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Chemie

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Biotechnik

<meta charset="utf8"></head><body>Präklinische Bildgebung des Tumorsauerstoffgehalts mittels EPRI und Ultraschall

Tumor Hypoxia Assessment: In Vivo 3D Oxygen Imaging Through Electron Paramagnetic Resonance

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 (i.e., hypoxia) is connected to tumor aggressiveness and poor response to therapy. The quantification of tumor pO2 allows the evaluation of treatment effectiveness. Electron Paramagnetic Resonance Imaging (EPRI), particularly Pulse EPRI, has emerged as an advanced three-dimensional (3D) method of assessing tissue oxygenation in vivo. This innovation was enabled by the technological developments in EPR (Electron Paramagnetic Resonance) and the application of the water-soluble oximetric spin probes from the triaryl family, offering fast and sensitive oxygenation data. The relaxation time of the spin probe (T1 and/or T2) provides accurate information about pO2 in selected voxels.
Human glioblastoma LN229 tumors were grown in the interscapular fad pad of BALB/c nude mice. Ultrasound (US) imaging was used as a reference for tumor anatomical information. To image tissue pO2, the animals were placed in a fixed position in the animal bed with fiducials, enabling registration between the imaging modalities. After the OX071 contrast agent was administered, EPRI was performed, followed by US B-mode. Because of the low spin probe toxicity, the procedure can be repeated during tumor growth or treatment. Following imaging, the registration process was carried out using software written in MATLAB. Ultimately, the hypoxic fraction can be calculated for a specific tumor, and the histogram of pO2 tissue distribution can be compared over time. EPRI combined with ultrasound is an excellent tool for oxygen mapping of tumors in the preclinical setting.

<meta charset="utf8"></head><body>Beurteilung der Tumorhypoxie: In vivo 3D-Sauerstoffbildgebung durch paramagnetische Elektronenresonanz

Quantitative 3D oxygen maps of murine tumors were imaged noninvasively using Pulse Electron Paramagnetic Resonance. Ultrasound B-mode and Power Doppler were used for anatomy and vascular structure. Images from both modalities were superimposed enabling multi-parametric tumor analysis.

Beurteilung der Tumorhypoxie: In vivo 3D-Sauerstoffbildgebung durch paramagnetische Elektronenresonanz 

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 ...

Krebsforschung

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Biologie

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von O₂ mit einem Frequency-Domain-basierten Kamerasystem

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter

Beurteilung der Tumorhypoxie: In vivo 3D-Sauerstoffbildgebung durch paramagnetische Elektronenresonanz

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Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

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Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

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