この作業は、部分的にgrantないによってサポートされていました。イスラエル科学財団から213/09には、何を許可しない。 BSF基礎から2005258、助成金がない。欧州研究評議会（ERC）から201665、およびテクニオンでラッセルベリーナノテクノロジー研究所による。我々は、シアノバクテリアの供給及び取り扱いに関するテクニオンの化学のシューリックの学部から教授ノームADIRとファリスサラミの助けを認める。テクニオンマイクロナノファブリケーションユニットからのヘルプとスヴェトラーナYoffisのサポートが大幅に高く評価されています。

1。 ESRマイクロイメージングの概要最初に、我々は、ESRの簡単な説明、ESR顕微鏡、そして私たちのシステムのさまざまなコンポーネントを提供し、我々は、実際のイメージング実験を説明します。 電子スピン共鳴は、特定の周波数での電磁放射が外部静磁場（図1）下に置かれ、不対電子のスピンを持つ分子によって吸収される分光技術です。 ESRは、フリーラジカルや常磁性中心の検出と識別のために、このような化学、生物学、物理学、材料科学などの科学の幅広い分野で採用されている。それはライブの種で常磁性分子の環境を研究するための強力な方法であり、酸性度（pH値）、粘度、酸素、および活性酸素種の濃度が3に関する情報を提供します。 異種のサンプルについて、ESRスペクトル情報は、磁場勾配4の使用によって、（すなわち、画像を取得することによって）空間分解方法で得ることができます。これは主にプロトンのスピンを観測する磁気共鳴イメージングのより一般的な方法（MRI）と非常によく似ています。これまで、このようなESRイメージング技術は、数センチの比較的大きなサイズで、mmはスケールの分解能で生きたままの標本に適用した。 ESRイメージングにおける（例えば、参考文献5から取り出した図2を参照。）比較的最近の開発は、ミリ波、サブミリサイズの試料の測定値にミリメートルスケールの分解能で小動物を見てからその機能を拡張したものですミクロンスケールの分解能。このフィールドは、1ミクロン2（図3に代表的な例を参照）に近づい分解能で3次元ESR画像を提供することができる今日ESR顕微鏡、として知られています。 ESR顕微鏡は、従来のESR分光器と本質的に似ています。これは、取得プロセスおよびデータ処理を制御するための静的フィールド、スピン励起と信号検出のためのマイクロ波システム、サンプルを保持するためのプローブ、およびコンピュータ化されたコンソールを生成するための磁石を持っています。一般的にESRイメージングユニークとESR縮小コピーを作るにも、既存の他のコンポーネントには、イメージングプローブに配置されている磁気電子システムの一部であるフィールドの勾配の源、および勾配コイルです。私たちの特定のシステムの詳細については、プロトコルの映画の中で示され、参考文献2に記載されています。 2。 ESRマイクロイメージングサンプルの調製この段階では、ESRマイクロイメージングの実験用サンプルの調製方法を説明します。この段階の細胞の最後にトリチルラジカル6の緩衝液と一緒に特別に準備ガラスのESR顕微鏡の試料容器の底部に配置されます。このプロトコルは、シアノバクテリア細胞の測定を説明し、従って、細胞の他のタイプのため、適切な調整は、サンプルの準備段階で必要になることがあります。 <ol><li>最初に、〜400 400μmの大きさと吸収紙のいくつかの正方形を取り、続いてシアノバクテリア懸濁液1.2 mlを（40 mg / mLの濃度で）で満たされているエッペンドルフチュー​​ブに挿入されます。 </li><li>懸濁液を微量遠心機で6000rpmで2分間遠心分離する。 </li><li>この後、上清バッファが完全に藍藻脱水​​を避けるために残っている〜50μLを除いて削除されます。このプロセスの結果として、吸収紙は現在シアノバクテリアの細胞が飽和している。 </li><li>細かいピンセットを使って、いくつかの繊維が紙から抽出され、カップ状、特別に準備ガラスの試料ホルダー7の底部に配置されます。 BG - 11溶液8、9のトリチル3mMのは（スキーム1参照）細かいシリンジの援助により、試料ホルダーに追加されていることを以下。ホルダーは、小さな排気口が開いたまま、UV硬化型接着剤を用いて封止されている。 <table border="1"><tbody><tr><td> 株式4 </td><td> 株式3 </td><td> 在庫2 </td><td> 在庫1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4：3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4を ： 7H 2 O 7.5g/liter </td><td>のNa 2 MgのEDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2を ：4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td>クエン酸第二鉄アンモニウムの0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4 · 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td>クエン酸：1H2O 0.6g/liter </tD&gt; </tr><tr><td> 4 ·：5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> 塩化カルシウム：2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td>のCoCl 2 ：6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4：2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> スキーム1。BG - 11培地の調製。 </li></ol> 3。 ESRマイクロイメージング実験<ol><li>イメージング実験を開始するには、ESRマイクロイメージングシステムをオンにし、イメージングプローブの内部に入ることを共振器に試料を挿入する。 </li><li>今、コンピュータの制御ソフトウェアを使用して、&quot;チューニング&quot;モードでシステムを設定し、ESR測定に使用されるプローブの共振マイクロ波の周波数を見つける。 </li><li>ていることに続いて、適用されるマイクロ波の周波数と一致する値に静磁場を設定し、パルスシーケンスのタイミングパラメータを設定してもシステムが機能するとサンプルが十分用意されていることを確認するためにESR信号を観測。 </li><li>その後、このような画素数としてイメージングパラメータ、、勾配の強さ、そしてそれらの必要な値に勾配パルスの長さを設定します。 </li><li>セットアップに続いて、パルス間の分離、500、600の値、および700ナノ秒とハーンエコーイメージングのパルスシーケンス（図4）によって三次元ESR画像を収集する。 </li><li>サンプルで投射された光は、必要な実験条件に応じてオンまたはオフになっています。 </li><li>買収時には、データが自動的に保存されます。論文生データファイルは、トリチルラジカル濃度と緩和時間の画像をT 2、既存のキャリブレーションを介して酸素濃度の画像に変換されるマップを、提供するために、MATLABソフトウェアのスクリプトを介して処理されます。 </li></ol> 4。代表的な結果実験の結果は、異なるτの値で記録された複数の三次元ESRマイクロ画像です。典型的な生データの画像を図5に提供されています。暗条件下で測定した上位3つの画像は、信号強度の減少を除いて非常によく似ています。一方、試料の異なる部分で異なる緩和時間による光照射下での画像パターンの変化。このデータは、図6に示すように、また、緩和時間、T 2（図7）の画像、振幅の画像を取得するには、1を処理することができます。 T 2の画像は、方程式を経由して緩和時間に酸素濃度を結ぶ既存の検量線を経由して酸素濃度の値に変換されます。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="式（1）" />ここで、T 2 0は、無酸素条件下でのプローブのスピン-スピン緩和時間（プローブの濃度、C、に応じて、その拡散係数、D）であり、kは比例定数である。ほとんどの場合、拡散係数は、（必要であれば、それは原則的に直接ESR 6,10によっても評価できる、が）ライブサンプルのためにあまり変化しない、とスピン濃度は、イメージングプロセス中に取得されたものです。したがって、この関係は直接に酸素濃度を測定することができます。 図6に戻ると、それは、シアノバクテリアの細胞は主に、サンプルホルダの右側に位置していることが振幅画像から明らかである。さらに、図7に基づいて、それは光がO 2の生産を開始し、主にシアノバクテリアに近いボクセルで、ソリューションのO 2濃度の有意な増加を引き起こすことは明らかである。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：電子スピン共鳴のエネルギー準位。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：担癌マウスの代表的な酸素濃度のイメージ。左の画像は、MRI画像に基づいて、解剖学的情報を示しています。安定した遊離有機ラジカルは、マウスに注入し、そのESR特性は、その環境での酸素濃度を（右）を提供した。 ESRベースの結果は、MRI解剖学的画像上に重畳されています。ビューのフィールドは32 mmです。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：高分解能マイクロスケールのESの二つの例N @ C 60粉末（左）とLiPc常磁性結晶とフォトリソグラフィにより生成されたサンプルのRの画像（右） <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：典型的なマイクロ波を示すハーンイメージングパルスシーケンス（MW）と勾配、G X、G y及びG zのパルス。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="図5" /> 図5：典型的な生データESRマイクロ画像：a、b、およびcはそれぞれ、τ= 500600700ナノ秒で測定された無光照射によるシアノバクテリアサンプルの生データです。項目D、E、及び、b、およびcと同じですが、光照射と同じです。強度は、（が、3つの暗いまたは明るい生データの画像の各セット内で一貫している）任意のスケールでプロットされています<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="図6" /> 図6：溶液中のラジカル濃度（任意スケール）に対応する振幅画像。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="図7" /> 図7：T 2の画像と対応する値が暗い（左）とライト（右）の条件の下で[O 2]。

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは、ESRマイクロイメージングは​​、ライブの小さな試料の近くに酸素濃度をマップに適用できる方法を示しています。 〜30の空間分解能は、× 30 × 100μmの近マイクロモルの酸素濃度の感度とボクセル毎のサブフェムトモル絶対酸素感度で、実証されている。細胞の近くに酸素のマッピングのためのESRマイクロイメージングの使用は、微小電極や燐光/蛍光に基づいて、現在利用可能な技術を補完します。さらに、適切な常磁性プローブ​​と、それは細胞内の酸素マイクロイメージング、他の方法を達成するの​​は非常に困難な能力のために容易に適用されます。近い将来、我々はもちろんのスーパーオキシドの濃度、酸性度（pH値）、プローブの拡散係数と、酸素濃度などのコントラストのパラメータを提供、さらに数ミクロンの分解能でのライブのサンプル画像を提供するために、この方法論を改善する予定。これらの機能は、両方ともコントラストタイプのとまたサンプルの特性（例えば、非透過的な厚さのサンプルと、いくつかのケースでは、細胞対細胞の測定）の点で現在の光ベースの手法と相補的である。

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

このプロトコルは、ミクロンスケールの分解能1で生きている細胞の直接の環境中の酸素濃度の三次元マッピングのための電子スピン共鳴（ESR）マイクロイメージングの方法を説明します。酸素は生命のサイクルの中で最も重要な分子の一つである。それはミトコンドリアで酸化的リン酸化の端末の電子受容体として機能し、活性酸素種の生産に使用されています。酸素の測定は、ミトコンドリアや代謝機能、シグナル伝達経路、様々な刺激、膜透過性、および疾患の分化の効果の研究に重要である。酸素消費量は、全体の生物への細胞へのミトコンドリアからの様々な生物学的システムに広く適用可能である、したがって、細胞代謝の有益なマーカーです。その重要性から、多くのメソッドは、ライブシステムでの酸素の測定のために開発されている。高解像度の酸素のイメージングを提供するために、現在の試みは、主に彼らは高い光毒性および低酸素感度を持つプローブを採用するとして、満足のいく結果を提供することができない光学的蛍光と燐光の方法に基づいています。サンプル中の外因性の常磁性プローブ​​からの信号を測定するESRは、酸素濃度の非常に正確な測定を提供することが知られている。典型的なケースでは、ESR測定は、プローブの線形拡大および/または局所酸素濃度に直接リンクされている緩和時間の短縮をマップします。 （酸素は常磁性であるため、外因性の常磁性プローブ​​に衝突するときに、その緩和時間を息切れ。）伝統的に、実験のこれらのタイプは、低解像度、小動物イメージングのためのミリメートルスケールのESRで行われている。ここでは、ESRイメージングも小さなライブサンプルの検査のためにミクロンスケールで実施することができる方法を示します。 ESRマイクロイメージングは、室温2で1ミクロンに近づき解像度と空間分解ESR信号の取得を可能にする比較的新しい手法です。このプロトコルは、紙の主な目的は、この新しいメソッドは、新しく開発された酸素に敏感なプローブと一緒に、小さなライブ試料中の酸素濃度のマッピングに適用できる方法を示すことです。 〜30の空間分解能は、× 30 × 100μmの近マイクロモルの酸素濃度の感度とボクセル毎のサブフェムトモル絶対酸素感度で、実証されている。細胞の近くに酸素のマッピングのためのESRマイクロイメージングの使用は、微小電極や燐光/蛍光に基づいて、現在利用可能な技術を補完します。さらに、適切な常磁性プローブ​​と、それはまた、細胞内の酸素マイクロイメージング、他の方法を達成するの​​は非常に困難な能力のために容易に適用されます。

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K ビュー.  The Technion, Israel Institute of Technology. このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。

ビデオ: Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of redox-regulated signaling in biological settings. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is the only direct method to assess free radicals unambiguously. Its advantage is that it detects physiologic levels of specific species with a high specificity, but it does require specialized technology, careful sample preparation, and appropriate controls to ensure accurate interpretation of the data. Cyclic hydroxylamine spin probes react selectively with superoxide or other radicals to generate a nitroxide signal that can be quantified by EPR spectroscopy. Cell-permeable spin probes and spin probes designed to accumulate rapidly in the mitochondria allow for the determination of superoxide concentration in different cellular compartments.
In cultured cells, the use of cell permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) along with and without cell-impermeable superoxide dismutase (SOD) pretreatment, or use of cell-permeable PEG-SOD,&#160;allows for the differentiation of extracellular from cytosolic superoxide. The mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) allows for measurement of mitochondrial ROS (predominantly superoxide).
Spin probes and EPR spectroscopy can also be applied to in vivo models. Superoxide can be detected in extracellular fluids such as blood and alveolar fluid, as well as tissues such as lung tissue. Several methods are presented to process and store tissue for EPR measurements and deliver intravenous 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin probe in vivo. While measurements can be performed at room temperature, samples obtained from in vitro and in vivo models can also be stored at -80 &#176;C and analyzed by EPR at 77 K. The samples can be stored in specialized tubing stable at -80 &#176;C and run at 77 K to enable a practical, efficient, and reproducible method that facilitates storing and transferring samples.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is an unambiguous method to measure free radicals. The use of selective spin probes allows for detection of free radicals in different cellular compartments. We present a practical, efficient method to collect biological samples that facilitate treating, storing, and transferring samples for EPR measurements.

周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

生化学

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs O2 sensitive luminescent sensor foils (planar optodes) in combination with a specialized camera system for imaging luminescence lifetime in the frequency-domain. Planar optodes are prepared by dissolving the O2-sensitive indicator dye in a polymer and spreading the mixture on a solid support in a defined thickness via knife coating. After evaporation of the solvent, the planar optode is placed in close contact with the sample of interest - here demonstrated with the roots of the aquatic plant Littorella uniflora. The O2 concentration-dependent change in the luminescence lifetime of the indicator dye within the planar optode is imaged via the backside of the transparent carrier foil and aquarium wall using a special camera. This camera measures the luminescence lifetime (&#181;s) via a shift in phase angle between a modulated excitation signal and emission signal. This method is superior to luminescence intensity imaging methods, as the signal is independent of the dye concentration or intensity of the excitation source, and solely relies on the luminescence decay time, which is an intrinsically referenced parameter. Consequently, an additional reference dye or other means of referencing are not needed. We demonstrate the use of the system for macroscopic O2 imaging of plant rhizospheres, but the camera system can also easily be coupled to a microscope.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe the use of a novel, frequency-domain luminescence lifetime camera for mapping 2D O2 distributions with optical sensor foils. The camera system and image analysis procedures are described along with the preparation, calibration and application of sensor foils for visualizing the O2 microenvironment in the rhizosphere of aquatic plants.

周波数領域ベースのカメラシステムを用いたO2の発光寿命イメージング

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

化学

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。<em&gt;インビボ</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

生物工学

<meta charset="utf8"></head><body>EPRIおよび超音波を用いた腫瘍酸素レベルの前臨床イメージング

Tumor Hypoxia Assessment: In Vivo 3D Oxygen Imaging Through Electron Paramagnetic Resonance

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 (i.e., hypoxia) is connected to tumor aggressiveness and poor response to therapy. The quantification of tumor pO2 allows the evaluation of treatment effectiveness. Electron Paramagnetic Resonance Imaging (EPRI), particularly Pulse EPRI, has emerged as an advanced three-dimensional (3D) method of assessing tissue oxygenation in vivo. This innovation was enabled by the technological developments in EPR (Electron Paramagnetic Resonance) and the application of the water-soluble oximetric spin probes from the triaryl family, offering fast and sensitive oxygenation data. The relaxation time of the spin probe (T1 and/or T2) provides accurate information about pO2 in selected voxels.
Human glioblastoma LN229 tumors were grown in the interscapular fad pad of BALB/c nude mice. Ultrasound (US) imaging was used as a reference for tumor anatomical information. To image tissue pO2, the animals were placed in a fixed position in the animal bed with fiducials, enabling registration between the imaging modalities. After the OX071 contrast agent was administered, EPRI was performed, followed by US B-mode. Because of the low spin probe toxicity, the procedure can be repeated during tumor growth or treatment. Following imaging, the registration process was carried out using software written in MATLAB. Ultimately, the hypoxic fraction can be calculated for a specific tumor, and the histogram of pO2 tissue distribution can be compared over time. EPRI combined with ultrasound is an excellent tool for oxygen mapping of tumors in the preclinical setting.

<meta charset="utf8"></head><body>腫瘍低酸素症の評価:電子常磁性共鳴によるin vivo 3D酸素イメージング

Quantitative 3D oxygen maps of murine tumors were imaged noninvasively using Pulse Electron Paramagnetic Resonance. Ultrasound B-mode and Power Doppler were used for anatomy and vascular structure. Images from both modalities were superimposed enabling multi-parametric tumor analysis.

腫瘍低酸素症の評価:電子常磁性共鳴によるin vivo 3D酸素イメージング 

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 ...

がん研究

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

生物学

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

要約

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周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

周波数領域ベースのカメラシステムを用いた_O2の発光寿命イメージング

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。

腫瘍低酸素症の評価:電子常磁性共鳴によるin vivo 3D酸素イメージング

腫瘍低酸素症の評価:電子常磁性共鳴によるin vivo 3D酸素イメージング

腫瘍低酸素症の評価:電子常磁性共鳴によるin vivo 3D酸素イメージング

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

インビボで2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

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周波数領域ベースのカメラシステムを用いたO2の発光寿命イメージング

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。

腫瘍低酸素症の評価:電子常磁性共鳴によるin vivo 3D酸素イメージング

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一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

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組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

周波数領域ベースのカメラシステムを用いた_O2の発光寿命イメージング

インビボで2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング