İnsan CD14⁺ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

Tolerojenik dendritik hücreler (tolDC'ler), naif T hücrelerini düzenleyici bir T hücresi (Treg) fenotipine doğru etkilediği bilinen dendritik hücrelerin (DC'ler) bir alt kümesidir. TolDC'ler şu anda hem hücre tedavisi hem de endojen DC'lerden tolDC'leri indüklemek için bir yöntem olarak otoimmünite ve transplantasyon tedavileri olarak araştırılmaktadır. Bununla birlikte, bugüne kadar, naif DC'lerden tolDC'leri indüklemek için bilinen ajanların sayısı nispeten azdır ve in vivo Treg'leri üretme potansiyelleri, özellikle endojen DC'lerden tolDC'leri indükleyen tedaviler tutarsız olmuştur. Bu, tolerans oluşturmak için yeni bileşikleri keşfetme fırsatı sağlar.

Burada, monositten türetilmiş DC'ler (moDC'ler) üzerinde yeni immünomodülatör bileşikleri in vitro olarak test etmek ve otolog Treg'ler oluşturmak için işlevselliklerini doğrulamak için bir yöntem açıklıyoruz. İlk olarak, PBMC'leri elde ediyoruz ve ticari olarak temin edilebilen manyetik ayırma kitlerini kullanarak CD14 ⁺ monositleri ve CD3 ⁺ T hücrelerini izole ediyoruz. Daha sonra, monositleri moDC'lere ayırıyoruz, bunları 24 saat boyunca rapamisin, deksametazon, IL-10 veya D3 vitamini gibi yerleşik bir immünomodülatör ile tedavi ediyoruz ve protokolün bir doğrulaması olarak tolerojenik belirteçlerdeki değişikliklerini test ediyoruz. Son olarak, anti-CD3/CD28 stimülasyonu varlığında indüklenen tolDC'leri otolog T hücreleri ile birlikte kültürledik ve Treg popülasyonlarındaki ve T hücresi proliferasyonundaki değişiklikleri gözlemledik. Bu protokolün, halihazırda farklılaşmış DC'leri tolDC'ye doğru yeniden programlamak için yeni immünomodülatör ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılmasını öngörüyoruz.

Dendritik hücreler (DC'ler), doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık arasında kritik aracılardır. Esas olarak mukozal membranlarda, deride ve lenfoid dokuda bulunan DC'ler, birincil antijen sunan hücrelerdir (APC'ler)¹. DC'ler yabancı proteinleri alır ve bunları işler ve majör histouyumluluk (MHC) proteinleri üzerinde naif T hücrelerine sunar. DC'ler, insanlarda insan lökosit antijeni-DR (HLA-DR) gibi MHC sınıf II proteinlerini spesifik olarak eksprese eder. Antijen maruziyeti üzerine DC'lerin aktivasyon durumu, aşağı akış T hücresi yanıtı² için kritiktir. Olgunlaşmamış DC'ler, bakteri duvarı bileşeni lipopolisakkarit (LPS) gibi patojenle ilişkili moleküler desenler (PAMP'ler) olarak adlandırılan molekül sınıflarını tanıyan çeşitli örüntü tanıma reseptörlerini (PRR'ler) ifade ^eder.3. PRR stimülasyonu üzerine, DC'ler olgunlaşmış DC'ler haline gelir ve CD80, CD86 ve CD40 gibi önemli T hücresi ko-stimülatör proteinlerini yukarı regüle eder ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNFa) gibi pro-inflamatuar sitokinler salgılar, bu da naif T hücrelerinin geleneksel efektör veya yardımcı T hücrelerine farklılaşmasını kolaylaştırır². Aksine, DC olgunlaşması kesintiye uğrarsa veya DC'ler tolerojenik bir ortamda gelişirse, DC'ler tolerojenik bir DC durumu (tolDC'ler) ^{oluşturabilir4}. TolDC'ler klasik T hücresi ko-stimülatör reseptörlerini aşağı regüle eder ve bunun yerine programlanmış hücre ölüm ligandı 1 (PD-L1) ve B- ve T-lenfosit zayıflatıcısı (BTLA) gibi tolerans reseptörlerini yukarı regüle eder ve interlökin 10 (IL-10) ve dönüştürücü büyüme faktörü beta (TGF-β)⁴ gibi baskılayıcı sitokinler üretir. Bu, tolerans belirteçlerinin kapsamlı bir listesi değildir ve aslında, tolDC durum^5'i tanımlamak için hangi tolDC belirteçlerinin uygun olduğu konusunda sınırlı bir fikir birliği vardır. Bunu göz önünde bulundurarak, çeşitli tolDC indüksiyon ajanlarının etkinliğini karşılaştırmak için kullanılması gereken fonksiyonel bir belirteç olarak düzenleyici T hücresi (Treg) üretimini öneriyoruz.

tolDC/olgunlaşmış DC aktivasyon durumlarına ek olarak, DC'ler soylarına veya doku konumlarına göre de kategorilere ayrılabilir ve her alt küme biraz farklı işlevler gösterir. tolDC/olgunlaşmış DC bölünmesi daha az kesin ve daha çok bir süreklilik olarak var olsa da, soy bölünmeleri hem insanda hem de farelerde iyi tanımlanmış belirteçlere sahiptir. DC öncüleri kemik iliğinde oluşur, ancak soylarına göre DC'lerin iki ana alt tipi vardır: 1) lenfoid soylardan türeyen plazmasitoid dendritik hücre (pDC'ler) ve 2) miyeloid soylardan türeyen geleneksel dendritik hücreler (cDC'ler). İnsanlarda, pDC'ler lenfoid organlarda olgunlaşır, CD303'ü eksprese eder ve viral enfeksiyonlarda oldukça duyarlıdır⁶. Bu arada, cDC'leri eksprese eden CD11c, periferik dokularda olgunlaşır ve her biri farklı T hücresi yanıtları üreten CD1c⁺ cDC1'ler ve CD141⁺ cDC2 olmak üzere iki farklı alt tipte bulunur⁷. Ayrıca, tüm cDC'ler dokuda yerleşik (CD103^-) veya göçmen (CD103⁺) alt durumlarında^{bulunabilir 8}. Son olarak, belirli koşullar altında, monosit soylarından (CD14⁺) hücreler bir dendritik hücre fenotipine doğru indüklenebilir ve CD14^-, CD141⁺, CD1c^{+ 9} olarak tanımlanır. Monositten türetilmiş DC'ler (moDC'ler) olarak bilinen bu hücreler, monositler insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) yaklaşık %10-30'unu oluştururken, pDC'ler sadece %1-3'ünü oluşturduğundan, insanlarda ex vivo analiz için en yaygın olarak ^{kullanılanlardır10}. Bu, moDC'leri çekici bir seçim haline getirir, ancak moDC'lerin birincil dokudan izole edilen tipik cDC'lerden daha inflamatuar olduğu da bilinmektedir⁹.

Şu anda klinik tolerans oluşturmak için tolDC'leri kullanmaya yönelik iki geniş çaba kategorisi vardır. İlk olarak, tolDC'ler hücre tedavisi olarak kullanılmak üzere monositlerden üretilir. Bu paradigmada, moDC'ler tipik olarak D3 vitamini, rapamisin (rapa), IL-10, deksametazon veya bunların kombinasyonları gibi immünomodülatörler ile eşzamanlı olarak IL-4/GM-CSF kullanılarak ayırt edilir^11,12. Bu tolDC'ler, otoimmünite ve nakiller için otolog hücre tedavileri olarak araştırılmıştır¹³. TolDC'lerin diğer kullanımı, hem immünomodülatör hem de ilgilenilen antijeni sağlamak için serbest ilaçlar veya nanotaşıyıcılar kullanarak endojen DC'leri tolDC'lere doğru yeniden programlamaktır 14,15,16. Bununla birlikte, halihazırda farklılaşmış DC'lerin indüksiyonu, tipik olarak tolDC metabolizması^17,18 ile tezat oluşturan DC'lerin sağlam metabolik fenotiplerinin geliştirilmesi nedeniyle daha zordur. Bu, çoğu farmakolojik immünomodülatör için yüksek bir çubuktur; bu nedenle, endojen DC yeniden programlama çalışmalarının çoğu, etkili DC supresyonu ve sıklıkla bir miktar Treg indüksiyonu bildirmektedir, ancak genellikle T hücresi kalıcılığının olmaması nedeniyle klinik başarıdan yoksundur 15,19,20. Bu, mevcut DC'lerden potansiyel tolDC indüksiyon ajanlarını belirlemek için stratejilere olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Burada, otolog Treg indüksiyonunun son metriği ile diferansiye moDC'lere karşı immünomodülatör ajanların in vitro değerlendirmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, halihazırda farklılaşmış insan moDC'lerini toleransa doğru yeniden programlamak için immünomodülatör ajanların etkinliğini değerlendirmek için tasarlanmıştır. Ayrıca, bu protokol, aynı PBMC örneğinden izole edilen otolog T hücrelerine karşı Treg'ler oluşturmak için yeniden programlanmış tolDC'lerin işlevselliğini doğrular. Bu, farklılaşma sırasında toleransı indükleyen ve / veya allojenik donörlerden alınan T hücreleri ile tolDC'leri zorlayan diğer protokollerin aksinedir²¹. Bu protokolde, örnek olarak ortak tolerize edici ajan rapa'yı kullanıyoruz, ancak aynı zamanda rapa ile muamele edilen moDC'lerin Tregs oluşturmak için sınırlı etkinliğini de gösteriyoruz. Temsili sonuçlarımızda, IL-10, deksametazon ve D3 vitamini gibi diğer yaygın immünomodülatör tedavilerin etkinliğini de gösteriyoruz. Bu protokolün, halihazırda kurulmuş olan MoDC'lere karşı potansiyel olarak daha etkili tolDC indükleyici ajanları taramak için kullanılmasını öngörüyoruz²².

Tüm insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örnekleri, Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'ndan (IRB) hasta rızası ile önceden onay alınarak, kimliği belirsiz donörlerden Pennsylvania Üniversitesi İnsan İmmünolojisi Çekirdeği'nden elde edildi.

İsteğe bağlı: Bu yöntemde akademik bir laboratuvardan elde edilen taze izole edilmiş PBMC'ler kullanılırken, PBMC'ler tam kandan veya lökoferezden zenginleştirilmiş kan ürünlerinden izole edilebilir. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yöntemini kullanmanızı öneririz, çünkü bu, başka bir yerde açıklanan köklü ve güvenilir bir yöntemdir²³.

1. Monosit/T hücrelerinin izolasyonu ve moDC farklılaşması

1. PBMC'lerden monositlerin ve T hücrelerinin izolasyonu-Gün 1
   1. Sağlıklı bir donörden 200 milyon insan PBMC elde edin. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte tutun ve buz üzerine aktarın.
   2. Aliquot 50 mL Ayırma Tamponu (ticari olarak temin edilebilen ayırma kitlerinde sağlanır) konik bir tüpte.
      NOT: Ayırma tamponu ayrıca %2 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren DPBS ile değiştirilebilir.
   3. PBMC tüpünü buzdan çıkarın ve Ayırma Tamponu ile doldurun. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak aspire edin. Serolojik bir pipet kullanarak hücre peletini 4 mL Önerilen Ortamda yeniden süspanse edin.
   5. Süspansiyonu iki farklı 15 mL tüpe bölün, tüp başına 2 mL ekleyin (tüp başına 5 × 10⁷ hücre / mL). Bir tüpü "T" ve diğerini "Monositler" olarak etiketleyin.
   6. İnsan Monosit İzolasyon Kitini alın ve monositleri monosit etiketli tüpten izole etmek için üreticinin protokolünü izleyin.
   7. İnsan T Hücresi İzolasyon Kitini alın ve T hücrelerini izole etmek için ikinci tüp için üreticinin protokolünü izleyin.
2. T hücrelerinin farklılaşması ve dondurulması için monositlerin kaplanması-Gün 1
   1. 50 mL moDC Kültür Ortamını (Tablo 1) 37 °C'de en az 10 dakika önceden ısıtın.
   2. 15 mL'lik tüpleri zenginleştirilmiş monositlerle ve 15 mL'lik tüpü 1.1. adımdan itibaren T hücreli 250 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı aspire edin. 1 mL moDC Kültür Ortamındaki monositleri ve T Hücre Kültürü Ortamındaki T hücrelerini (Tablo 1) yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Peletin düzgün bir şekilde dağıldığından emin olun.
   4. Tripan Blue boyamayı kullanarak otomatik bir hücre sayacı veya manuel hemasitometre kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: Temsili veriler için 10 milyon T hücresi ve 3 milyon monosit izole edildi.
   5. Monositli tüpü alın ve 10 mL'lik son hacim için süspansiyona 9 mL ılık moDC Kültür Ortamı ekleyin. Daha sonra, ortamda hem GM-CSF hem de IL-4'ün 100 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyonu için 10 μg / mL GM-CSF ve 10 μg / mL IL-4 stoğunun her birine 100 μL ekleyin. Süspansiyonu bir Petri kabına aktarın ve "moDC" (Gün 1) olarak etiketleyin ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
   6. T hücre tüpünü alın ve 1 mL T hücresi dondurma ortamını (Tablo 1) 1 mL T hücresi süspansiyonu ile karıştırın. İkiye bölün: 2 mL kriyovial (1 mL / şişe); Sıkıca kapatın (flakon başına 5 milyon hücrenin nihai konsantrasyonu). Kriyovialleri, kullanılmayan kuyucuklarda dengeleme tüpleri olan bir dondurma odasına yerleştirin. Hazneyi gece boyunca -80 °C'de saklayın, ardından kriyovialleri bir kriyotanka aktarın.
   7. 4. Günde, 5 mL taze moDC Kültür Besiyeri ilavesiyle ortamı yenileyin ve her birine 100 μL GM-CSF ve IL-4 stoğu ekleyin. Farklılaştırılmış MOC'ler 7. günde hazır olacaktır.

2. Tolerojenik moDC'ler oluşturmak için immünomodülatör ilaçların eklenmesi

1. MoDC plakasını ayarlayın.
   1. 7. Günde, farklılaşmış moDC'leri inkübatörden alın ve moDC hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
   2. Süspansiyonu 250 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 mL ılık moDC kültür ortamında yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Hücreleri hematitometre ile sayın ve hücreleri 100 ng / mL GM-CSF ve IL-4 içeren ılık moDC kültür ortamında 3 ×^{10 5} hücre / mL konsantrasyona seyreltin.
   3. Düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakasında istenen sayıda oyuklara 100 μL'de 3 ×^{10 4} hücre / kuyu ekleyin.
      NOT: Temsili sonuçlar için toplam 48 kuyu kullandık (bölüm 3 ve 4'te dört farklı analiz için hazırlanan üç nüsha halinde yapılan dört koşul), ancak bu 60 kuyuya kadar ayarlanabilir. Kalan tüm kuyucukları, özellikle dış kuyucukları kurutmak için 100 μL/kuyu PBS ile doldurun. Her analiz yöntemi için farklı plakalar hazırlamanızı öneririz.
   4. İstenilen kuyucuklara 1 μL/oyuk immünomodülatör ilaç ekleyin (burada 10 ng/mL rapa). Plakayı gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
      NOT: 8. günde immünostimülasyon dahilse, immünostimülasyon olsun ve olmasın immünomodülatör ilaç için kuyucuklar hazırlayın. Olgun moDC'ler için immünostimülasyon kullanımı isteğe bağlıdır.
2. T hücrelerini yeniden çözer.
   1. 8. Günde, kriyotanktan iki kriyovial alın ve kriyovialleri sıcak bir boncuk banyosunda veya su banyosunda 37 °C'de içindekiler erimeye başlayana kadar (<3 dakika içinde) çözün.
   2. İçerikler erimeye başladığında, şişeleri bir hücre kültürü başlığına aktarın ve hızla çözülmesi için 1 mL ılık T hücre kültürü ortamını şişeye pipetleyin. Şişenin tüm içeriğini 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüm hücrelerin tüpe aktarıldığından emin olmak için kriyoviyalleri 1 mL T hücre kültürü ortamı ile durulayın.
   3. Süspansiyonu 15 mL'ye kadar Akış Boyama Çözeltisi (Tablo 1) ile doldurun. 200 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Ardından, peleti 5 mL Akış Boyama Solüsyonunda yeniden süspanse edin ve tekrar santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL ılık T hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: Bu aşamada canlılık %>70 olmalıdır; çok miktarda ölü hücre kalırsa, taze bir tüpe aktarın, 10 mL hücre boyama çözeltisi ekleyin, 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin, 1 mL T hücresi ortamında yeniden süspanse edin ve yeniden sayın.
   5. 10 mL'lik bir son hacim elde etmek için 9 mL ılık T hücre kültürü ortamı ekleyin. Süspansiyonu bir Petri kabına aktarın. "Yeniden Çözülmüş T Hücreleri" olarak etiketleyin ve hücrelerin dinlenmesine izin vermek için% 5 CO₂ ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
3. MoDC plakasını yıkayın ve istenirse immünostimülatörü ekleyin.
   1. 8. Günde, moDC plakasını (7. günden itibaren) 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı aspire edin, ılık HBSS ile yıkayın, santrifüjlemeyi tekrarlayın, tekrar aspire edin ve hücreleri GM-CSF ve IL-4 (100 μL / oyuk) içeren ılık moDC kültür ortamında yeniden süspanse edin.
      NOT: Hücreleri rahatsız etmemeye dikkat edin. Aspirasyon sırasında plakayı eğin. Kuyuda yaklaşık 10 μL kalabilir.
   3. İmmünostimülasyon kullanılıyorsa, istenen kuyucuklara 1 μL / kuyu 100x stok LPS (veya başka bir immünostimülatör ajan) ekleyin. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.

3. moDC için akış analizi (Doğrulama + Tolerans)

1. MOD'nin doğrulanması için akış analizi
   1. 8. günde, Validasyon Paneli için aşağıdaki belirteçleri hedefleyen antikor kokteylleri hazırlayın: HLA-DR, CD14, dendritik hücreye özgü C-tipi lektin (DC-SIGN), CD1c ve CD40, Tablo 2'de tarif edildiği gibi. Tüm antikorları akış lekesi çözeltisi ile seyreltin.
      NOT: Panel, 7 kanallı, Kırmızı/Mavi lazer akış sitometresi için tasarlanmıştır.
   2. MoDC plakasını inkübatörden alın. Plakayı 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları çıkarın. İsteğe bağlı: Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak sitokinler IL-10 ve TNFα için ELISA analizi için süpernatanları saklayın.
   3. 200 μL / kuyu Akış Boyama Çözeltisi ekleyin. Plakayı 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı aspire edin ve spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için akış boyama çözeltisinde 1:200 oranında seyreltilmiş 50 μL / kuyu Fc reseptör bağlanma inhibitörü antikoru ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
   5. Hazırlanan Validasyon Paneli antikor kokteylinden 50 μL/kuyu ekleyin.
   6. 50 μL kompanzasyon boncuğu her bir seyreltilmiş antikordan 50 μL ile karıştırarak plakada veya 1.5 mL tüplerde kompanzasyon kontrolleri hazırlayın. Plakayı 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: MoDC'lerde potansiyel olarak düşük işaretleyici ifadesi nedeniyle kompanzasyon için hücreler yerine burada kompanzasyon boncukları kullanılır.
   7. 300 × g'da 5 dakika santrifüj ederek, süpernatanı çıkararak ve 200 μL Akış Boyama Solüsyonunda yeniden süspanse ederek yıkayın. İki yıkama yapın.
   8. Son yıkamadan sonra tekrar santrifüjleyin ve hücreleri 110 μL / kuyu Akış Boyama Solüsyonunda yeniden süspanse edin. Numuneler artık akış sitometrisi analizi için hazırdır.
2. Tolerojenik moDC (Tolerans Paneli) için akış analizi
   1. 8. gündeki adım 3.1'e benzer şekilde, Tolerans Paneli için aşağıdaki belirteçleri hedefleyen antikor kokteylleri hazırlayın: CD86, PD-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA ve CD40 (Tablo 2).
   2. 3.1.2-3.1.8 adımlarını tekrarlayın ve antikor kokteylini Tolerans Paneli kokteyli ile değiştirin.

4. T hücrelerinin akış analizi

1. T hücrelerini tedavi edilmiş Tolerojenik moDC'lerle birleştirin.
   1. 9. günde, yeniden çözülmüş T hücresi Petri kabını inkübatörden alın ve tüm T hücrelerini 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Akış Boyama Çözeltisi ile doldurun.
   2. İsteğe bağlı: T hücresi proliferasyon analizi yapıyorsanız, T hücrelerini iki tüpe bölün.
      1. İlk tüp ile 5 dakika boyunca 250 × g'da döndürün ve süpernatanı çıkarın. Bu tüpü üreticinin talimatlarına göre hücre proliferasyon boyası ile boyayın.
         NOT: 30 dakikalık bir inkübasyon adımı ve ardından iki yıkama adımı gerektiren Sabitlenebilir Viability Dye eFluor 670 kullandık. Hücre kaybını önlemek için 50 mL konik tüpler kullanmanızı ve boyama sonrası yıkamak için %10 HIFBS'li HBSS kullanmanızı öneririz.
      2. Treg analizi için boyanmamış T hücreleri içeren ikinci tüpü kullanın. Benzer şekilde, 5 dakika boyunca 250 × g'da döndürün, süpernatanı çıkarın, ılık hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve boyama işlemi sırasında inkübatörde tutun. T hücresi proliferasyonu gerekmiyorsa, tüm T hücrelerini döndürün ve bunları sıcak T hücresi kültür ortamı ile değiştirin.
   3. Hücreleri sayın ve en az 4 milyon (sadece Treg analizi için) veya 8 milyon (Treg ve T proliferasyon analizi için) elde edin.
   4. MoDC plakasını kalan kuyucuklarla birlikte inkübatörden alın, 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanları ayırtın. 1.6 × 10⁵ hücre/oyukta 200 μL/kuyu T hücresi ekleyin. Treg analiz plakaları için boyanmamış T hücreleri ve T hücresi proliferasyon plakaları için boyanmış T hücreleri ekleyin.
      NOT: İlk 3 ×10⁴ moDC tipik olarak hafifçe genişlediğinden, bu, 5:1'lik bir T hücresi / moDC oranını koruyacaktır.
   5. T hücrelerini uyarmak için negatif kontrol kuyucukları hariç tüm gruplara 25 μL/mL anti-CD3/CD28 antikor kokteyli ekleyin. Plakayı 37 ° C'de 72 saat boyunca% 5 CO₂ ile 12. güne kadar inkübe edin.
      NOT: Proliferasyon analizi için lekeli T hücreleri kullandığınızdan ve Treg analizi için lekelenmemiş hücreler kullandığınızdan emin olun.
2. Treg akış analizi
   1. Yüzey işaretleyici boyama
      1. 12. günde, Treg Panel için antikor kokteylleri hazırlayın (Tablo 2).
      2. Tüm hücre süspansiyonlarını 96 oyuklu kültür plakasından Akış Boyama Çözeltisi ile bir V-tabanlı plakaya aktarın. Sitokin analizi için süpernatanları saklayın.
      3. Hücreleri santrifüjleme ile 2 kez yıkayın (5 dakika boyunca 200 × g ve ardından 200 μL Flow leke çözeltisi). Kompanzasyon kontrolleri için bazı hücreleri bir kenara koyun. FOXP3 boyama ve lekesiz kontroller için bir tane ayırın.
         NOT: Gerekli kompanzasyon kontrollerini elde etmek için adım 4.2.1.3'teki son dönüşten önce tüm numunelerin 10 μL'sini taramanızı öneririz. Bu, hücreler üzerindeki her bir işaretleyicinin tüm yüzey seviyesi ifadesinin temsili bir örneğini sağlar.
      4. İkinci yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve aspire edin, ardından 50 μL / kuyu Fc reseptör bağlanma inhibitörü antikoru (Akış Boyama Çözeltisinde 1:200 oranında seyreltilmiş) ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
      5. Hazırlanan Treg Panel antikor kokteylinden 50 μL/kuyu ekleyin.
      6. Kompanzasyon kontrolleri için, 50 μL boyanmamış kompanzasyon hücrelerini her bir lekeli antikorun 50 μL'si ile karıştırın.
      7. Plakayı ve kompanzasyon kontrollerini 4 °C'de 1 saat inkübe edin. Plakayı Flow Stain Solution ile bir kez yıkayın ve 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
      8. 200 μL / kuyuda HBSS (1: 1.000) içinde seyreltilmiş Canlı / Ölü Near-IR boya ile lekeleyin. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      9. Plakayı bir kez Akış Boyama Solüsyonu (200 μL / kuyu) ile 300 × g'da 5 dakika yıkayın.
   2. Üreticinin talimatlarına göre FoxP3 ile lekeleyin, bu da gece boyunca inkübasyon gerektirecektir. FoxP3 boyama protokolüne kısa bir genel bakış aşağıda açıklanmıştır.
      1. FoxP3 Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çalışma Çözümünü üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. 1 kısım FoxP3 Fiksasyon/Geçirgenleştirme Konsantresini 3 kısım FoxP3 Fiksasyon/Geçirgenleştirme Seyreltici ile karıştırın. Numune başına 200 μL çalışma solüsyonu hazırlayın.
      2. Tüm numuneleri, çalışan Fiksasyon / Geçirgenleştirme çözeltisinin 200 μL / oyuğunda inkübe edin. 4 °C'de 1 saat bekletin.
      3. 1x Geçirgenleştirme Tamponu Hazırlayın: 1 kısım 10x Geçirgenleştirme Tamponunu (ticari kitten elde edilir) 9 kısım damıtılmış su ile karıştırın.
      4. Plakayı 2x 1x Geçirgenleştirme Tamponu (200 μL/kuyu) ile 300 × g'da 5 dakika yıkayın.
      5. FoxP3 antikoru ile lekeleyin (PE-Cy5.5, 1x Geçirgenleştirme Tamponunda 1:300 seyreltme): Seyreltilmiş FoxP3 antikorundan 100 μL / kuyu ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
      6. Plakayı 2x 1x Geçirgenleştirme Tamponu (200 μL/kuyu) ile 300 × g'da 5 dakika yıkayın.
      7. Hücreleri 110 μL / kuyu Akış Boyama Çözeltisinde yeniden süspanse edin.
      8. Akış sitometrisi analizi yapın.
3. T hücresi proliferasyon analizi
   1. T Proliferasyon Paneli için antikor kokteylleri hazırlayın (Tablo 2).
   2. Tüm hücre süspansiyonlarını 96 oyuklu kültür plakasından Akış Boyama Çözeltisi ile bir V-tabanlı plakaya aktarın. Sitokin analizi için süpernatanları saklayın.
   3. Hücreleri santrifüjleme ile 2 kez yıkayın (5 dakika boyunca 200 × g ve ardından 200 μL Flow leke çözeltisi). Kompanzasyon kontrolleri için bazı hücreleri bir kenara koyun. FOXP3 boyama ve lekesiz kontroller için bir tane ayırın.
      NOT: Gerekli kompanzasyon kontrollerini elde etmek için adım 4.3.3'teki son dönüşten önce tüm numunelerin 10 μL'sini taramanızı öneririz. Bu, hücreler üzerindeki her bir işaretleyicinin tüm yüzey seviyesi ifadesinin temsili bir örneğini sağlar.
   4. İkinci yıkamadan sonra santrifüjleyin (oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g ) ve aspire edin, ardından 50 μL / kuyu Fc reseptör bağlanma inhibitörü antikoru (Akış Boyama Çözeltisinde 1:200 oranında seyreltilmiş) ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   5. Hazırlanan T Proliferasyon Paneli antikor kokteylinden 50 μL/kuyu ekleyin.
   6. Kompanzasyon kontrolleri için, 50 μL boyanmamış kompanzasyon hücrelerini her bir lekeli antikorun 50 μL'si ile karıştırın.
   7. Plakayı ve kompanzasyon kontrollerini 4 °C'de 1 saat inkübe edin. Plakayı Flow Stain Solution ile bir kez yıkayın ve 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   8. 200 μL / kuyuda HBSS (1: 1.000) içinde seyreltilmiş Canlı / Ölü Near-IR boya ile lekeleyin. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   9. Plakayı bir kez Akış Boyama Solüsyonu (200 μL / kuyu) ile 300 × g'da 5 dakika boyunca yıkayın.
   10. Akış sitometrisi analizi yapın.

İnsan PBMC'leri için bir protokol tanımladık, ticari olarak temin edilebilen manyetik ayırma kitlerini kullanarak hem CD3 ⁺ T hücrelerini hem de CD14 ⁺ monositlerini izole ettik, monositleri GM-CSF ve IL-4 kullanarak CD14^-, HLA-DR ⁺, CD141 ⁺, CD1c ⁺ moDC'lere farklılaştırdık, 24 saat tedavi ettik ve 72 saat boyunca anti-CD3 / CD28 stimülasyonu ile otolog T hücreleri ile kokültür yaptık. Deneysel bir şema

Burada, moDC'lerden tolDC'leri indüklemek için immünomodülatör ajanların işlevselliğini değerlendirmek ve ex vivo otojenik T hücrelerinden Treg'ler oluşturmak için işlevselliklerini doğrulamak için güvenilir ve çok yönlü bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, monositler herkesin bildiği gibi hassas hücrelerdir ve en iyi sonuçlar için taze, daha önce dondurulmamış PBMC'lerden elde edilmelidir. Monositler müm...

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bağışçılardan taze insan PBMC'leri sağladığı için Pennsylvania Üniversitesi İnsan İmmünolojisi Çekirdeğine (HIC) teşekkür ederiz. HIC, kısmen NIH P30 AI045008 ve P30 CA016520 tarafından desteklenmektedir.