Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14⁺ -Monozyten

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Tolerogene dendritische Zellen (tolDCs) sind eine Untergruppe der dendritischen Zellen (DCs), von denen bekannt ist, dass sie naive T-Zellen in Richtung eines regulatorischen T-Zell-Phänotyps (Treg) beeinflussen. TolDCs werden derzeit als Therapien für Autoimmunität und Transplantation untersucht, sowohl als Zelltherapie als auch als Methode zur Induktion von tolDCs aus endogenen DCs. Bisher ist die Anzahl der bekannten Wirkstoffe zur Induktion von tolDCs aus naiven DCs jedoch relativ gering und ihre Wirksamkeit zur Erzeugung von Tregs in vivo war inkonsistent, insbesondere bei Therapien, die tolDCs aus endogenen DCs induzieren. Dies bietet die Möglichkeit, neuartige Verbindungen zu erforschen, um Toleranz zu erzeugen.

Hier beschreiben wir eine Methode, um neuartige immunmodulatorische Verbindungen an Monozyten-abgeleiteten DCs (moDCs) in vitro zu testen und ihre Funktionalität zur Erzeugung autologer Tregs zu validieren. Zunächst erhalten wir PBMCs und isolieren CD14⁺ -Monozyten und CD3⁺ T-Zellen mit kommerziell erhältlichen magnetischen Trennkits. Als nächstes differenzieren wir Monozyten in moDCs, behandeln sie 24 h lang mit einem etablierten Immunmodulator wie Rapamycin, Dexamethason, IL-10 oder Vitamin D3 und testen ihre Veränderung in tolerogenen Markern als Validierung des Protokolls. Schließlich co-kultivieren wir die induzierten tolDCs mit autologen T-Zellen in Gegenwart einer anti-CD3/CD28-Stimulation und beobachten Veränderungen in den Treg-Populationen und der T-Zellproliferation. Wir stellen uns vor, dass dieses Protokoll verwendet wird, um die Wirksamkeit neuartiger immunmodulatorischer Wirkstoffe zu bewerten, um bereits differenzierte DCs in Richtung tolDC umzuprogrammieren.

Dendritische Zellen (DCs) sind wichtige Vermittler zwischen angeborener und adaptiver Immunität. DCs, die sich hauptsächlich in Schleimhäuten, Haut und lymphatischem Gewebe befinden, sind die primären antigenpräsentierenden Zellen (APCs)¹. DCs nehmen fremde Proteine auf und verarbeiten sie und präsentieren sie auf Haupthistokompatibilitätsproteinen (MHC) für naive T-Zellen. DCs exprimieren spezifisch MHC-Klasse-II-Proteine, wie z. B. das humane Leukozytenantigen-DR (HLA-DR) beim Menschen. Der Aktivierungszustand der DCs nach Antigenexposition ist entscheidend für die nachgeschaltete T-Zell-Antwort². Unreife DCs exprimieren verschiedene Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), die Klassen von Molekülen erkennen, die als pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) bezeichnet werden, wie z. B. die bakterielle Wandkomponente Lipopolysaccharid (LPS)³. Nach der PRR-Stimulation werden DCs zu gereiften DCs und regulieren wichtige co-stimulatorische T-Zell-Proteine wie CD80, CD86 und CD40 hoch und sezernieren proinflammatorische Zytokine wie den Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα), was die Differenzierung naiver T-Zellen in konventionelle Effektor- oder Helfer-T-Zellen erleichtert². Im Gegenteil, wenn die DC-Reifung unterbrochen wird oder wenn sich DCs in einer tolerogenen Umgebung entwickeln, können DCs einen tolerogenen DC-Zustand (tolDCs) ^erzeugen4. TolDCs regulieren klassische T-Zell-Co-stimulatorische Rezeptoren herunter und regulieren stattdessen Toleranzrezeptoren wie den programmierten Zelltod-Liganden 1 (PD-L1) und den B- und T-Lymphozyten-Attenuator (BTLA) hoch und erzeugen suppressive Zytokine wie Interleukin 10 (IL-10) und den transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGF-β)⁴. Dies ist keine vollständige Liste von Toleranzmarkern, und tatsächlich besteht nur begrenzter Konsens darüber, welche tolDC-Marker geeignet sind, um den tolDC-Zustand⁵ zu definieren. Vor diesem Hintergrund schlagen wir die regulatorische T-Zell-Generierung (Treg) als funktionellen Marker vor, der zum Vergleich der Wirksamkeit verschiedener tolDC-Induktionsmittel verwendet werden sollte.

Zusätzlich zu tolDC/gereiften DC-Aktivierungszuständen können DCs auch nach ihrer Abstammung oder Gewebelokalisation kategorisiert werden, wobei jede Untergruppe eine leicht unterschiedliche Funktionalität aufweist. Während die Teilung von tolDC und gereiftem DC weniger definitiv ist und eher als Kontinuum existiert, haben Abstammungsteilungen sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen gut definierte Marker. DC-Vorläufer werden im Knochenmark gebildet, aber es gibt zwei Hauptsubtypen von DCs, die auf ihrer Abstammung basieren: 1) plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs), die von lymphoiden Linien abstammen, und 2) konventionelle dendritische Zellen (cDCs), die von myeloischen Linien abstammen. Beim Menschen sind pDCs in lymphatischen Organen gereift, exprimieren CD303 und reagieren sehr gut auf Virusinfektionen⁶. CD11c-exprimierende cDCs hingegen sind in peripheren Geweben gereift und existieren in zwei unterschiedlichen Subtypen, CD1c⁺ cDC1s und CD141⁺ cDC2, die jeweils unterschiedliche T-Zell-Antworten erzeugen⁷. Darüber hinaus können alle cDCs entweder in geweberesidenten (CD103^-) oder migratorischen (CD103⁺) Subzuständen existieren⁸. Schließlich können Zellen aus Monozytenlinien (CD14⁺) unter bestimmten Bedingungen in Richtung eines dendritischen Zellphänotyps induziert werden und werden als CD14^-, CD141⁺, CD1c^{+ 9} identifiziert. Diese Zellen, die als Monozyten-abgeleitete DCs (moDCs) bekannt sind, werden am häufigsten für die Ex-vivo-Analyse beim Menschen verwendet, da Monozyten etwa 10-30 % der mononukleären Zellen (PBMCs) des menschlichen peripheren Blutes ausmachen, während pDCs nur 1-3 % ^ausmachen10. Dies macht moDCs zu einer attraktiven Wahl, aber es ist auch bekannt, dass moDCs entzündlicher sind als typische cDCs, die aus primärem Gewebe isoliert wurden⁹.

Derzeit gibt es zwei große Kategorien von Bemühungen, tolDCs zur Erzeugung klinischer Toleranz einzusetzen. Zunächst werden tolDCs aus Monozyten für den Einsatz als Zelltherapie erzeugt. In diesem Paradigma werden moDCs typischerweise unter Verwendung von IL-4/GM-CSF gleichzeitig mit Immunmodulatoren wie Vitamin D3, Rapamycin (Rapa), IL-10, Dexamethason oder Kombinationen dieser^{unterschieden 11,12}. Diese tolDCs wurden als autologe Zelltherapien für Autoimmunität und Transplantationen erforscht¹³. Die andere Verwendung von tolDCs besteht darin, endogene DCs unter Verwendung von freien Wirkstoffen oder Nanocarriern in Richtung tolDCs umzuprogrammieren, um sowohl Immunmodulatoren als auch Antigene von Interesse zu liefern 14,15,16. Die Induktion bereits differenzierter DCs stellt jedoch eine größere Herausforderung dar, da sich robuste metabolische Phänotypen von DCs entwickeln, die typischerweise im Gegensatz zum tolDC-Metabolismus stehen^17,18. Dies ist eine hohe Messlatte für die meisten pharmakologischen Immunmodulatoren; Aus diesem Grund berichten die meisten endogenen DC-Reprogrammierungsstudien über eine effektive DC-Suppression und oft eine gewisse Treg-Induktion, aber keinen klinischen Erfolg, oft aufgrund mangelnder T-Zell-Persistenz 15,19,20. Dies unterstreicht den Bedarf an Strategien zur Identifizierung potenzieller tolDC-Induktionsstoffe aus bestehenden DCs.

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur in vitro Evaluierung von immunmodulatorischen Wirkstoffen gegen differenzierte moDCs mit der Endmetrik der autologen Treg-Induktion vor. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Wirksamkeit von immunmodulatorischen Wirkstoffen zu bewerten, um bereits differenzierte menschliche moDCs in Richtung Toleranz umzuprogrammieren. Darüber hinaus validiert dieses Protokoll die Funktionalität von umprogrammierten tolDCs zur Erzeugung von Tregs gegen autologe T-Zellen, die aus derselben PBMC-Probe isoliert wurden. Dies steht im Gegensatz zu anderen Protokollen, die Toleranz während der Differenzierung induzieren und/oder tolDCs mit T-Zellen von allogenen Spendern herausfordern²¹. In diesem Protokoll verwenden wir den gängigen Tolerierungsstoff Rapa als Beispiel, zeigen aber auch die begrenzte Wirksamkeit von Rapa-behandelten moDCs zur Erzeugung von Tregs. In unseren repräsentativen Ergebnissen zeigen wir auch die Wirksamkeit anderer gängiger immunmodulatorischer Behandlungen wie IL-10, Dexamethason und Vitamin D3. Wir stellen uns vor, dass dieses Protokoll verwendet wird, um potenziell wirksamere tolDC-induzierende Wirkstoffe gegen bereits etablierte moDCs zu screenen²².

Alle Proben von humanen mononukleären Blutzellen (PBMC) wurden aus dem Human Immunology Core der University of Pennsylvania von anonymisierten Spendern mit vorheriger Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) der University of Pennsylvania mit Zustimmung des Patienten entnommen.

Optional: Während wir bei dieser Methode frisch isolierte PBMCs aus einem akademischen Labor verwendet haben, können PBMCs entweder aus Vollblut oder mit Leukapherese angereicherten Blutprodukten isoliert werden. Wir empfehlen die Verwendung der Dichtegradientenzentrifugationsmethode, da es sich um eine etablierte und zuverlässige Methode handelt, die an anderer Stelle^{beschrieben wird 23}.

1. Isolierung von Monozyten/T-Zellen und moDC-Differenzierung

1. Isolierung von Monozyten und T-Zellen aus PBMCs - Tag 1
   1. Erhalten Sie 200 Millionen menschliche PBMCs von einem gesunden Spender. Bewahren Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen auf und übertragen Sie sie auf Eis.
   2. Aliquot 50 mL Separationspuffer (in kommerziell erhältlichen Separationskits enthalten) in einem konischen Röhrchen.
      HINWEIS: Der Trennpuffer kann auch durch DPBS mit 2 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ersetzt werden.
   3. Nehmen Sie das PBMC-Röhrchen aus dem Eis und füllen Sie es mit Separation Buffer. Bei 300 x g 5 Minuten zentrifugieren.
   4. Aspirieren Sie den Überstand mit einer serologischen 10-ml-Pipette. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 ml des empfohlenen Mediums mit einer serologischen Pipette.
   5. Teilen Sie die Suspension in zwei verschiedene 15-ml-Röhrchen auf und fügen Sie 2 mL pro Röhrchen hinzu (5 × 10⁷ Zellen/mL pro Röhrchen). Beschriften Sie ein Röhrchen mit "T" und das andere mit "Monozyten".
   6. Entnehmen Sie das humane Monozyten-Isolationskit und befolgen Sie das Protokoll des Herstellers, um Monozyten aus dem mit Monozyten markierten Röhrchen zu isolieren.
   7. Nehmen Sie das humane T-Zell-Isolationskit und befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für das zweite Röhrchen zur Isolierung von T-Zellen.
2. Plattierung von Monozyten zur Differenzierung und zum Einfrieren von T-Zellen - Tag 1
   1. 50 ml moDC-Nährmedium (Tabelle 1) mindestens 10 Minuten lang auf 37 °C vorheizen.
   2. Zentrifugieren Sie die 15-ml-Röhrchen mit angereicherten Monozyten und das 15-ml-Röhrchen mit T-Zellen aus Schritt 1.1 bei 250 × g für 5 min.
   3. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Monozyten in 1 ml moDC-Kulturmedium und T-Zellen in T-Zell-Kulturmedium (Tabelle 1) durch Auf- und Abpipettieren. Stellen Sie sicher, dass das Pellet richtig verteilt ist.
   4. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder einem manuellen Hämazytometer mit Trypanblau-Färbung.
      HINWEIS: Für die repräsentativen Daten wurden 10 Millionen T-Zellen und 3 Millionen Monozyten isoliert.
   5. Nehmen Sie das Röhrchen mit den Monozyten und geben Sie 9 ml warmes moDC-Kulturmedium in die Suspension, um ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. Geben Sie dann jeweils 100 μl 10 μg/ml GM-CSF und 10 μg/ml IL-4-Stamm hinzu, um eine Endkonzentration von 100 ng/ml GM-CSF und IL-4 im Medium zu erreichen. Die Suspension wird in eine Petrischale überführt und als "moDC" (Tag 1) gekennzeichnet und bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert.
   6. Nehmen Sie das T-Zell-Röhrchen und mischen Sie 1 ml T-Zell-Gefriermedium (Tabelle 1) mit 1 ml T-Zell-Suspension. In zwei 2-ml-Kryoröhrchen (1 ml/Fläschchen) aufteilen; dicht verschließen (Endkonzentration von 5 Millionen Zellen pro Fläschchen). Stellen Sie die Kryofläschchen in eine Gefrierkammer mit Ausgleichsrohren in unbenutzte Vertiefungen. Lagern Sie die Kammer über Nacht bei -80 °C und stellen Sie die Kryoröhrchen dann in einen Kryotank um.
   7. An Tag 4 wird das Medium mit 5 ml frischem moDC-Kulturmedium aufgefrischt und mit je 100 μl GM-CSF- und IL-4-Stamm angereichert. Differenzierte moDCs werden an Tag 7 fertig sein.

2. Zugabe von immunmodulatorischen Arzneimitteln zur Erzeugung tolerogener moDCs

1. Richten Sie die moDC-Platte ein.
   1. Entnehmen Sie an Tag 7 die differenzierten moDCs aus dem Inkubator und überführen Sie die moDC-Zellsuspension in ein 50-ml-Röhrchen.
   2. Die Suspension wird bei 250 × g 5 Minuten lang zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml warmem moDC-Kulturmedium, indem Sie auf und ab pipettieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer und verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 3 × 10⁵ Zellen/ml in warmem moDC-Kulturmedium mit 100 ng/ml, GM-CSF und IL-4.
   3. Geben Sie 3 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in 100 μl zur gewünschten Anzahl von Vertiefungen in einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden.
      HINWEIS: Für repräsentative Ergebnisse haben wir insgesamt 48 Wells verwendet (vier Bedingungen in dreifacher Ausfertigung, die für vier verschiedene Analysen in den Abschnitten 3 und 4 vorbereitet wurden), aber dies kann für bis zu 60 Wells angepasst werden. Füllen Sie alle verbleibenden Vertiefungen mit 100 μL/Vertiefung PBS, um ein Austrocknen zu verhindern, insbesondere in den äußeren Vertiefungen. Wir empfehlen, für jede Analysemethode unterschiedliche Platten vorzubereiten.
   4. Geben Sie 1 μl/Well immunmodulatorische Arzneimittel in die gewünschten Wells (hier 10 ng/ml Rapa). Die Platte über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
      HINWEIS: Wenn Sie die Immunstimulation an Tag 8 einschließen, bereiten Sie Vertiefungen für das immunmodulatorische Arzneimittel sowohl mit als auch ohne Immunstimulation vor. Die Anwendung von Immunstimulation bei reifen moDCs ist optional.
2. T-Zellen wieder auftauen.
   1. Nehmen Sie an Tag 8 zwei Kryoröhrchen aus dem Kryotank und tauen Sie die Kryoröhrchen in einem heißen Perlbad oder Wasserbad bei 37 °C auf, bis der Inhalt zu schmelzen beginnt (in <3 Minuten).
   2. Wenn der Inhalt zu schmelzen beginnt, geben Sie die Fläschchen in eine Zellkulturhaube und pipetieren Sie 1 ml warmes T-Zellkulturmedium in das Fläschchen, um es schnell aufzutauen. Übertragen Sie den gesamten Inhalt des Fläschchens in ein 50-ml-Röhrchen. Spülen Sie die Kryoröhrchen mit 1 ml T-Zell-Kulturmedium, um sicherzustellen, dass alle Zellen in das Röhrchen überführt werden.
   3. Füllen Sie die Suspension mit Flow Staining Solution (Tabelle 1) auf 15 mL auf. Bei 200 × g für 10 min zentrifugieren und den Überstand absaugen. Dann das Pellet in 5 mL Fließfärbelösung resuspendieren und erneut zentrifugieren.
   4. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml warmem T-Zell-Kulturmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer.
      HINWEIS: Die Rentabilität sollte zu diesem Zeitpunkt >70 % betragen; Wenn große Mengen abgestorbener Zellen verbleiben, in ein frisches Röhrchen umfüllen, 10 ml Zellfärbelösung hinzufügen, 5 Minuten lang bei 200 × g zentrifugieren, in 1 ml T-Zellmedium resuspendieren und neu zählen.
   5. Fügen Sie 9 ml warmes T-Zell-Kulturmedium hinzu, um ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. Übertragen Sie die Suspension in eine Petrischale. Beschriften Sie es als "aufgetaute T-Zellen" und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ , damit die Zellen ruhen können.
3. Waschen Sie die moDC-Platte und fügen Sie nach Belieben den Immunstimulator hinzu.
   1. Zentrifugieren Sie an Tag 8 die moDC-Platte (ab Tag 7) bei 300 × g für 5 min.
   2. Den Überstand aspirieren, mit warmem HBSS waschen, die Zentrifugation wiederholen, erneut aspirieren und die Zellen in warmem moDC-Kulturmedium resuspendieren, das GM-CSF und IL-4 (100 μl/Well) enthält.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Zellen nicht zu stören. Kippen Sie die Platte während der Aspiration. Ungefähr 10 μl können in der Vertiefung verbleiben.
   3. Wenn Sie Immunstimulation verwenden, geben Sie 1 μl/Vertiefung 100x LPS (oder ein anderes immunstimulierendes Mittel) in die gewünschten Vertiefungen. Die Platte über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.

3. Strömungsanalyse für moDC (Validierung + Toleranz)

1. Strömungsanalyse zur Validierung von moDC
   1. Bereiten Sie an Tag 8 Antikörper-Cocktails für das Validierungspanel vor, die auf die folgenden Marker abzielen: HLA-DR, CD14, dendritisches zellspezifisches C-Typ-Lektin (DC-SIGN), CD1c und CD40, wie in Tabelle 2 beschrieben. Verdünnen Sie alle Antikörper mit Fließfärbelösung.
      HINWEIS: Das Panel wurde für ein 7-Kanal-Rot/Blau-Laser-Durchflusszytometer entwickelt.
   2. Nehmen Sie die moDC-Platte aus dem Inkubator. Die Platte bei 300 × g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie die Überstände. Optional: Bewahren Sie die Überstände für die ELISA-Analyse der Zytokine IL-10 und TNFα mit handelsüblichen Kits gemäß den Herstellerangaben auf.
   3. Fügen Sie 200 μl/Vertiefung Fließfärbelösung hinzu. Die Platte bei 300 × g 5 min zentrifugieren.
   4. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 50 μl/Vertiefung des 1:200 in Fließfärbelösung verdünnten Fc-Rezeptor-Bindungsinhibitor-Antikörpers hinzu, um eine unspezifische Bindung zu blockieren. 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
   5. 50 μl/Vertiefung des vorbereiteten Validierungspanel-Antikörpercocktails zugeben.
   6. Bereiten Sie Kompensationskontrollen in der Platte oder in 1,5-ml-Röhrchen vor, indem Sie 50 μl Kompensationsbeads mit 50 μl jedes verdünnten Antikörpers mischen. Die Platte 1 h lang bei 4 °C inkubieren.
      HINWEIS: Aufgrund der potenziell geringen Expression von Markern auf moDCs werden hier Kompensationsbeads anstelle von Zellen zur Kompensation verwendet.
   7. Waschen Sie, indem Sie 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugieren, den Überstand entfernen und in 200 μl Fließfärbelösung resuspendieren. Führen Sie zwei Wäschen durch.
   8. Nach der abschließenden Wäsche erneut zentrifugieren und die Zellen in 110 μl/Vertiefung Fließfärbelösung resuspendieren. Die Proben sind nun bereit für die durchflusszytometrische Analyse.
2. Durchflussanalyse für tolerogenes moDC (Tolerance Panel)
   1. Ähnlich wie in Schritt 3.1 an Tag 8 bereiten Sie Antikörper-Cocktails für das Tolerance Panel vor, die auf die folgenden Marker abzielen: CD86, PD-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA und CD40 (Tabelle 2).
   2. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.8 und ersetzen Sie den Antikörpercocktail durch den Tolerance Panel-Cocktail .

4. Strömungsanalyse von T-Zellen

1. Kombinieren Sie T-Zellen mit behandelten tolerogenen moDCs.
   1. Entnehmen Sie an Tag 9 die aufgetaute T-Zell-Petrischale aus dem Inkubator und geben Sie alle T-Zellen in ein 50-ml-Röhrchen. Mit Flow Staining Solution auffüllen.
   2. Optional: Wenn Sie eine T-Zell-Proliferationsanalyse durchführen, teilen Sie die T-Zellen in zwei Röhrchen.
      1. Mit der ersten Tube bei 250 × g 5 min herunterschleudern und den Überstand entfernen. Färben Sie diese Tube mit Zellproliferationsfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers.
         HINWEIS: Wir haben Fixable Viability Dye eFluor 670 verwendet, der einen 30-minütigen Inkubationsschritt erfordert, gefolgt von zwei Waschschritten. Wir empfehlen die Verwendung von konischen 50-ml-Röhrchen, um Zellverlust zu verhindern, und die Verwendung von HBSS mit 10 % HIFBS zum Waschen nach der Färbung.
      2. Verwenden Sie das zweite Röhrchen mit ungefärbten T-Zellen für die Treg-Analyse. Auf ähnliche Weise 5 Minuten lang bei 250 × g herunterschleudern, den Überstand entfernen, in warmen Zellkulturmedien resuspendieren und während des Färbevorgangs im Inkubator aufbewahren. Wenn keine T-Zellproliferation erforderlich ist, drehen Sie alle T-Zellen herunter und ersetzen Sie sie durch warme T-Zell-Kulturmedien.
   3. Zählen Sie die Zellen und erhalten Sie mindestens 4 Millionen (nur für die Treg-Analyse) oder 8 Millionen (für die Treg- und T-Proliferationsanalyse).
   4. Die moDC-Platte mit den restlichen Vertiefungen aus dem Inkubator nehmen, 5 min bei 300 × g zentrifugieren und die Überstände apitieren. Fügen Sie 200 μl/Well T-Zellen bei 1,6 × 10⁵ Zellen/Well hinzu. Fügen Sie ungefärbte T-Zellen für Treg-Analyseplatten und gefärbte T-Zellen für T-Zell-Proliferationsplatten hinzu.
      HINWEIS: Dadurch wird ein T-Zell-zu-moDC-Verhältnis von 5:1 beibehalten, da sich die anfänglichen 3 ×10⁴ moDCs in der Regel leicht ausdehnen.
   5. 25 μl/ml Anti-CD3/CD28-Antikörpercocktail in alle Gruppen mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefungen geben, um T-Zellen zu stimulieren. Die Platte 72 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ bis zum 12. Tag inkubieren.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, gefärbte T-Zellen für die Proliferationsanalyse und ungefärbte für die Treg-Analyse zu verwenden.
2. Analyse der Treg-Strömung
   1. Färben von Oberflächenmarkern
      1. Bereiten Sie an Tag 12 Antikörper-Cocktails für das Treg-Panel vor (Tabelle 2).
      2. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen von der 96-Well-Kulturplatte in eine V-Bodenplatte mit Flow Staining Solution. Bewahren Sie die Überstände für die Zytokinanalyse auf.
      3. Waschen Sie die Zellen 2x durch Zentrifugation (200 × g für 5 min, gefolgt von 200 μl Flow-Fleckenlösung). Reservieren Sie einige Zellen für die Kompensationskontrolle. Legen Sie einen für die FOXP3-Färbung und für ungefärbte Kontrollen beiseite.
         HINWEIS: Wir empfehlen, 10 μl aller Proben vor dem endgültigen Schleudern in Schritt 4.2.1.3 zu kämmen, um die erforderlichen Kompensationskontrollen zu erhalten. Dies liefert eine repräsentative Stichprobe aller oberflächennahen Expressionen jedes Markers auf den Zellen.
      4. Nach dem zweiten Waschen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 x g zentrifugieren und aspirieren, dann 50 μl/Well Fc-Rezeptor-Bindungsinhibitor-Antikörper hinzufügen (1:200 verdünnt in Fließfärbelösung). 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      5. 50 μl/Vertiefung des vorbereiteten Treg-Panel-Antikörpercocktails zugeben.
      6. Mischen Sie für Kompensationskontrollen 50 μl ungefärbte Kompensationszellen mit 50 μl jedes einzelnen gefärbten Antikörpers.
      7. Die Platte und die Kompensationsregler 1 h lang bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Platte einmal mit Fließbeizlösung und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 5 min.
      8. Färben Sie mit Lebend/Tot-Nahinfrarot-Farbstoff, verdünnt in HBSS (1:1.000) bei 200 μL/Well. 30 min bei 4 °C inkubieren.
      9. Waschen Sie die Platte einmal mit Flow Staining Solution (200 μl/Well) bei 300 × g für 5 min.
   2. Färben Sie mit FoxP3 gemäß den Anweisungen des Herstellers, was eine Inkubation über Nacht erfordert. Im Folgenden wird ein kurzer Überblick über das FoxP3-Färbeprotokoll beschrieben.
      1. Bereiten Sie die FoxP3-Fixierungs-/Permeabilisierungs-Arbeitslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Mischen Sie 1 Teil FoxP3 Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat mit 3 Teilen FoxP3 Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel. Bereiten Sie 200 μl der Arbeitslösung pro Probe vor.
      2. Inkubieren Sie alle Proben in 200 μl/Vertiefung der Arbeitsfixierungs-/Permeabilisierungslösung. 1 h bei 4 °C ziehen lassen.
      3. Bereiten Sie 1x Permeabilisierungspuffer vor: Mischen Sie 1 Teil 10x Permeabilisierungspuffer (aus dem handelsüblichen Kit erhalten) mit 9 Teilen destilliertem Wasser.
      4. Waschen Sie die Platte 2x mit 1x Permeabilization Buffer (200 μL/Well) bei 300 × g für 5 min.
      5. Mit FoxP3-Antikörper (PE-Cy5.5, 1:300 Verdünnung in 1x Permeabilisierungspuffer) färben: 100 μl/Well des verdünnten FoxP3-Antikörpers zugeben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      6. Waschen Sie die Platte 2x mit 1x Permeabilization Buffer (200 μL/Well) bei 300 × g für 5 min.
      7. Resuspendieren Sie die Zellen in 110 μl/Vertiefung Fließfärbelösung.
      8. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durch.
3. Analyse der T-Zell-Proliferation
   1. Bereiten Sie Antikörper-Cocktails für das T-Proliferationspanel vor (Tabelle 2).
   2. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen von der 96-Well-Kulturplatte in eine V-Bodenplatte mit Flow Staining Solution. Bewahren Sie Überstände für die Zytokinanalyse auf.
   3. Waschen Sie die Zellen 2x durch Zentrifugation (200 × g für 5 min, gefolgt von 200 μl Flow-Fleckenlösung). Reservieren Sie einige Zellen für die Kompensationskontrolle. Legen Sie einen für die FOXP3-Färbung und für ungefärbte Kontrollen beiseite.
      HINWEIS: Wir empfehlen, 10 μl aller Proben vor dem endgültigen Schleudern in Schritt 4.3.3 zu kämmen, um die erforderlichen Kompensationskontrollen zu erhalten. Dies liefert eine repräsentative Stichprobe aller oberflächennahen Expressionen jedes Markers auf den Zellen.
   4. Nach dem zweiten Waschen zentrifugieren (200 × g für 5 min bei Raumtemperatur) und aspirieren, dann 50 μl/Vertiefung Fc-Rezeptor-Bindungsinhibitor-Antikörper hinzufügen (1:200 verdünnt in Fließfärbelösung). 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Geben Sie 50 μl/Vertiefung des vorbereiteten T-Proliferationspanel-Antikörpercocktails hinzu.
   6. Mischen Sie für Kompensationskontrollen 50 μl ungefärbte Kompensationszellen mit 50 μl jedes einzelnen gefärbten Antikörpers.
   7. Die Platte und die Kompensationsregler 1 h lang bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Platte einmal mit Fließbeizlösung und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 5 min.
   8. Färben Sie mit Lebend/Tot-Nahinfrarot-Farbstoff, verdünnt in HBSS (1:1.000) bei 200 μL/Well. 30 min bei 4 °C inkubieren.
   9. Waschen Sie die Platte einmal mit Flow Staining Solution (200 μl/Well) bei 300 × g für 5 min.
   10. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durch.

Wir haben ein Protokoll für humane PBMCs beschrieben, isolieren sowohl CD3⁺ T-Zellen als auch CD14⁺ Monozyten mit kommerziell erhältlichen magnetischen Trennkits, differenzieren Monozyten in CD14^-, HLA-DR⁺-, CD141⁺, CD1c⁺ moDCs mit GM-CSF und IL-4, behandeln sie für 24 h und co-kultivieren mit autologen T-Zellen mit Anti-CD3/CD28-Stimulation für 72 h. Ein experimentelles Schema ist in Abbildung 1

Hier beschreiben wir eine zuverlässige und vielseitige Methode, um die Funktionalität von immunmodulatorischen Wirkstoffen zur Induktion von tolDCs aus moDCs zu bewerten und ihre Funktionalität zur Erzeugung von Tregs aus autogenen T-Zellen ex vivo zu validieren. Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Erstens sind Monozyten notorisch empfindliche Zellen und müssen aus frischen, nicht zuvor gefrorenen PBMCs gewonnen werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen. ...

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Wir danken dem Human Immunology Core (HIC) der University of Pennsylvania für die Bereitstellung frischer humaner PBMCs von Spendern. Das HIC wird teilweise von NIH P30 AI045008 und P30 CA016520 unterstützt.