Un metodo semplice ed efficiente per testare gli agenti immunomodulatori per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche da monociti CD14⁺ umani

Descriviamo una procedura per valutare la capacità degli agenti farmacologici di generare cellule dendritiche tollerogeniche da cellule dendritiche naive derivate da monociti in vitro e convalidare la loro potenza mediante la generazione di cellule T regolatorie autologhe.

Le cellule dendritiche tolerogeniche (tolDC) sono un sottogruppo di cellule dendritiche (DC) che sono note per influenzare le cellule T naive verso un fenotipo di cellule T regolatorie (Treg). Le TolDC sono attualmente in fase di studio come terapie per l'autoimmunità e il trapianto, sia come terapia cellulare che come metodo per indurre le tolDC da DC endogene. Ad oggi, tuttavia, il numero di agenti noti per indurre tolDC da DC naïve è relativamente piccolo e la loro potenza nel generare Treg in vivo è stata incoerente, in particolare le terapie che inducono tolDC da DC endogene. Ciò offre l'opportunità di esplorare nuovi composti per generare tolleranza.

Qui descriviamo un metodo per testare nuovi composti immunomodulatori su DC derivate da monociti (moDC) in vitro e convalidare la loro funzionalità per generare Treg autologhe. In primo luogo, otteniamo PBMC e isoliamo monociti CD14⁺ e cellule T CD3⁺ utilizzando kit di separazione magnetica disponibili in commercio. Successivamente, differenziamo i monociti in moDC, li trattiamo con un immunomodulatore consolidato, come rapamicina, desametasone, IL-10 o vitamina D3, per 24 ore e testiamo il loro cambiamento nei marcatori tollerogenici come convalida del protocollo. Infine, co-coltiviamo le tolDC indotte con cellule T autologhe in presenza di stimolazione anti-CD3/CD28 e osserviamo cambiamenti nelle popolazioni di Treg e nella proliferazione delle cellule T. Prevediamo che questo protocollo venga utilizzato per valutare l'efficacia di nuovi agenti immunomodulatori per riprogrammare DC già differenziate verso la tolDC.

Le cellule dendritiche (DC) sono mediatori critici tra l'immunità innata e quella adattativa. Le DC, che risiedono principalmente nelle membrane mucose, nella pelle e nel tessuto linfoide, sono le principali cellule presentanti l'antigene (APC⁾¹. Le DC assorbono proteine estranee e le elaborano e le presentano sulle proteine maggiori di istocompatibilità (MHC) alle cellule T naive. Le DC esprimono specificamente proteine MHC di classe II, come l'antigene-DR leucocitario umano (HLA-DR) nell'uomo. Lo stato di attivazione delle DC in seguito all'esposizione all'antigene è critico per la risposta delle cellule T a valle². Le DC immature esprimono vari recettori di riconoscimento dei pattern (PRR) che riconoscono classi di molecole chiamate pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), come il componente della parete batterica, il lipopolisaccaride (LPS)³. Dopo la stimolazione con PRR, le DC diventano DC mature e sovraregolano importanti proteine co-stimolatorie delle cellule T, come CD80, CD86 e CD40, e secernono citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFα), facilitando la differenziazione delle cellule T naive in cellule T effettrici convenzionali o helper². Al contrario, se la maturazione delle DC viene interrotta o se le DC si sviluppano in un ambiente tollerogenico, le DC possono generare uno stato DC tollerogenico (tolDCs⁾⁴. Le TolDC sottoregolano i classici recettori co-stimolatori delle cellule T e sovraregolano invece i recettori di tolleranza come il ligando 1 della morte cellulare programmata (PD-L1) e l'attenuatore dei linfociti B e T (BTLA) e generano citochine soppressive come l'interleuchina 10 (IL-10) e il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β)⁴. Questo non è un elenco completo di marcatori di tolleranza e, infatti, c'è un consenso limitato su quali marcatori tolDC siano appropriati per definire lo stato^{tolDC 5}. Considerando ciò, proponiamo la generazione di cellule T regolatorie (Treg) come marcatore funzionale che dovrebbe essere utilizzato per confrontare l'efficacia di vari agenti di induzione del tolDC.

Oltre agli stati di attivazione delle DC tolDC/maturi, le DC possono anche essere classificate in base al loro lignaggio o alla posizione del tessuto, con ogni sottoinsieme che mostra funzionalità leggermente diverse. Mentre la divisione tolDC/DC matura è meno definitiva ed esiste più come un continuum, le divisioni di lignaggio hanno marcatori ben definiti sia nell'uomo che nei topi. I precursori delle DC si formano nel midollo osseo, ma ci sono due sottotipi principali di DC in base al loro lignaggio: 1) cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC), che derivano da linee linfoidi e 2) cellule dendritiche convenzionali (cDC), che derivano da linee mieloidi. Nell'uomo, le pDC maturano negli organi linfoidi, esprimono CD303 e sono altamente reattive nelle infezioni virali⁶. Le cDC che esprimono CD11c, nel frattempo, sono maturate nei tessuti periferici ed esistono in due sottotipi distinti, CD1c⁺ cDC1s e CD141⁺ cDC2, che generano ciascuno risposte distinte delle cellule T⁷. Inoltre, tutte le cDC possono esistere sia nei sottostati tessuto-residenti (CD103^-) che migratori (CD103⁺)⁸. Infine, in determinate condizioni, le cellule di linee monocitarie (CD14⁺) possono essere indotte verso un fenotipo di cellula dendritica e sono identificate come CD14^-, CD141⁺, CD1c^{+ 9}. Queste cellule, note come DC derivate da monociti (moDC), sono le più comunemente utilizzate per l'analisi ex vivo nell'uomo, poiché i monociti costituiscono circa il 10-30% delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC), mentre le pDC costituiscono solo l'1-3%¹⁰. Questo rende le moDC una scelta interessante, ma è anche noto che le moDC sono più infiammatorie delle tipiche cDC isolate dal tessuto primario⁹.

Attualmente ci sono due grandi categorie di sforzi per impiegare le tolDC per generare tolleranza clinica. In primo luogo, le tolDC sono generate da monociti per essere utilizzate come terapia cellulare. In questo paradigma, le moDC sono tipicamente differenziate utilizzando IL-4/GM-CSF in concomitanza con immunomodulatori come la vitamina D3, la rapamicina (rapa), l'IL-10, il desametasone o combinazioni di questi^11,12. Queste tolDC sono state esplorate come terapie cellulari autologhe per l'autoimmunità e i trapianti¹³. L'altro uso delle tolDC è quello di riprogrammare le DC endogene verso tolDC utilizzando farmaci liberi o nanovettori per veicolare sia l'immunomodulatore che l'antigene di interesse 14,15,16. L'induzione di DC già differenziate è più impegnativa, tuttavia, a causa dello sviluppo di robusti fenotipi metabolici di DC che sono tipicamente in contrasto con il metabolismo delle tolDC^17,18. Questo è un livello elevato per la maggior parte degli immunomodulatori farmacologici; per questo motivo, la maggior parte degli studi di riprogrammazione endogena delle DC riporta un'efficace soppressione delle DC e spesso una certa induzione di Treg, ma manca di successo clinico, spesso a causa della mancanza di persistenza delle cellule T 15,19,20. Ciò evidenzia la necessità di strategie per identificare potenziali agenti di induzione di tolDC da DC esistenti.

Qui, presentiamo un metodo per la valutazione in vitro di agenti immunomodulatori contro moDC differenziate con la metrica finale dell'induzione autologa di Treg. Questo protocollo è progettato per valutare l'efficacia degli agenti immunomodulatori nel riprogrammare le moDC umane già differenziate verso la tolleranza. Inoltre, questo protocollo convalida la funzionalità delle tolDC riprogrammate per generare Treg contro cellule T autologhe isolate dallo stesso campione di PBMC. Ciò è in contrasto con altri protocolli che inducono tolleranza durante il differenziamento e/o sfidano le tolDC con cellule T da donatori allogenici²¹. In questo protocollo, utilizziamo l'agente tollerante comune rapa come esempio, ma dimostriamo anche la limitata efficacia dei moDC trattati con rapa per generare Treg. Nei nostri risultati rappresentativi, mostriamo anche l'efficacia di altri trattamenti immunomodulatori comuni come IL-10, desametasone e vitamina D3. Prevediamo che questo protocollo venga utilizzato per lo screening di agenti inducenti tolDC potenzialmente più efficaci rispetto a moDC già consolidate²².

Tutti i campioni di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono stati ottenuti dal nucleo di immunologia umana dell'Università della Pennsylvania da donatori anonimizzati con previa approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) dell'Università della Pennsylvania con il consenso del paziente.

Facoltativo: mentre in questo metodo abbiamo utilizzato PBMC appena isolate ottenute da un laboratorio accademico, le PBMC possono essere isolate sia dal sangue intero che dai prodotti ematici arricchiti con leucaferesi. Si consiglia di utilizzare il metodo di centrifugazione in gradiente di densità, poiché si tratta di un metodo consolidato e affidabile descritto altrove²³.

1. Isolamento di monociti/cellule T e differenziamento di moDC

1. Isolamento di monociti e cellule T da PBMC - Giorno 1
   1. Ottenere 200 milioni di PBMC umane da un donatore sano. Conservare le cellule in una provetta da 15 ml e trasferirle con ghiaccio.
   2. Aliquotare 50 mL di tampone di separazione (fornito nei kit di separazione disponibili in commercio) in una provetta conica.
      NOTA: Il tampone di separazione può anche essere sostituito con DPBS con siero fetale bovino al 2% (FBS) e 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
   3. Rimuovere la provetta PBMC dal ghiaccio e riempirla con il tampone di separazione. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
   4. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Risospendere il pellet cellulare in 4 mL di terreno consigliato utilizzando una pipetta sierologica.
   5. Dividere la sospensione in due diverse provette da 15 mL, aggiungendo 2 mL per provetta (5 × 10⁷ cellule/mL per provetta). Etichettare una provetta con la dicitura "T" e l'altra con la dicitura "Monociti".
   6. Recupera il kit di isolamento dei monociti umani e segui il protocollo del produttore per isolare i monociti dalla provetta marcata con i monociti.
   7. Recupera il kit di isolamento delle cellule T umane e segui il protocollo del produttore per la seconda provetta per isolare le cellule T.
2. Placcatura di monociti per il differenziamento e il congelamento delle cellule T - Giorno 1
   1. Preriscaldare 50 mL di terreno di coltura moDC (Tabella 1) a 37 °C per almeno 10 minuti.
   2. Centrifugare le provette da 15 mL con monociti arricchiti e la provetta da 15 mL con cellule T dalla fase 1.1 a 250 × g per 5 min.
   3. Aspirare il surnatante. Risospendere i monociti in 1 mL di terreno di coltura moDC e le cellule T nel terreno di coltura per cellule T (Tabella 1) pipettando su e giù. Assicurarsi che il pellet sia disperso correttamente.
   4. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un ematocitometro manuale con colorazione Trypan Blue.
      NOTA: Per i dati rappresentativi, sono stati isolati 10 milioni di cellule T e 3 milioni di monociti.
   5. Prendere la provetta con i monociti e aggiungere 9 mL di terreno di coltura moDC caldo alla sospensione per un volume finale di 10 mL. Quindi, aggiungere 100 μL ciascuno di 10 μg/mL GM-CSF e 10 μg/mL di IL-4 per una concentrazione finale di 100 ng/mL di GM-CSF e IL-4 nel terreno. Trasferire la sospensione in una capsula di Petri ed etichettarla come "moDC" (Giorno 1) e incubare a 37 °C con CO₂ al 5%.
   6. Prendere la provetta delle cellule T e mescolare 1 mL di terreno di congelamento delle cellule T (Tabella 1) con 1 mL di sospensione di cellule T. Dividere in due crioviali da 2 mL (1 mL/fiala); Sigillare ermeticamente (concentrazione finale di 5 milioni di cellule per flaconcino). Collocare i crioviali in una camera di congelamento con tubi di bilanciamento in pozzetti inutilizzati. Conservare la camera a -80 °C per una notte, quindi trasferire i crioviali in un crioserbatoio.
   7. Il giorno 4, rinfrescare il terreno con l'aggiunta di 5 mL di terreno di coltura moDC fresco e aggiungere 100 μL di brodo GM-CSF e IL-4. I moDC differenziati saranno pronti il giorno 7.

2. Aggiunta di farmaci immunomodulatori per la generazione di moDC tollerogeniche

1. Impostare la piastra moDC.
   1. Il giorno 7, recuperare i moDC differenziati dall'incubatore e trasferire la sospensione cellulare di moDC in una provetta da 50 mL.
   2. Centrifugare la sospensione a 250 × g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura moDC caldo pipettando su e giù. Contare le cellule con l'ematocitometro e diluire le cellule a una concentrazione di 3 × 10⁵ cellule/mL in terreno di coltura moDC caldo contenente 100 ng/mL GM-CSF e IL-4.
   3. Aggiungere 3 × 10⁴ cellule/pozzetto in 100 μl al numero desiderato di pozzetti in una piastra di coltura tissutale a fondo piatto da 96 pozzetti.
      NOTA: Per ottenere risultati rappresentativi, abbiamo utilizzato un totale di 48 pozzetti (quattro condizioni eseguite in triplicato preparate per quattro diverse analisi nelle sezioni 3 e 4), ma questo può essere regolato per un massimo di 60 pozzetti. Riempire tutti i pozzetti rimanenti con 100 μL/pozzetto di PBS per evitare l'essiccazione, in particolare i pozzetti esterni. Si consiglia di preparare piastre diverse per ogni metodo di analisi.
   4. Aggiungere 1 μL/pozzetto di farmaci immunomodulatori ai pozzetti desiderati (qui 10 ng/mL di rapa). Incubare la piastra per una notte a 37 °C con CO₂ al 5%.
      NOTA: Se si include l'immunostimolazione il giorno 8, preparare i pozzetti per il farmaco immunomodulatore sia con che senza immunostimolazione. L'uso dell'immunostimolazione per maturare le moDC è facoltativo.
2. Scongelare le cellule T.
   1. L'8° giorno, recuperare due crioviali dal crioserbatoio e scongelarli in un bagno caldo di perle o in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando il contenuto inizia a sciogliersi (in <3 minuti).
   2. Quando il contenuto inizia a sciogliersi, trasferire le fiale in una cappa per coltura cellulare e versare 1 mL di terreno di coltura di cellule T calde nella fiala per scongelarle rapidamente. Trasferire l'intero contenuto del flaconcino in una provetta da 50 mL. Sciacquare i crioviali con 1 mL di terreno di coltura per cellule T per assicurarsi che tutte le cellule vengano trasferite nella provetta.
   3. Rabboccare la sospensione con la soluzione colorante a flusso (Tabella 1) fino a 15 mL. Centrifugare a 200 × g per 10 minuti e aspirare il surnatante. Quindi, risospendere il pellet in 5 mL di soluzione colorante a flusso e centrifugare nuovamente.
   4. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura di cellule T caldo. Contare le cellule utilizzando un ematocitometro.
      NOTA: La redditività dovrebbe essere del >70% in questa fase; se rimangono grandi quantità di cellule morte, trasferirle in una provetta nuova, aggiungere 10 mL di soluzione di colorante cellulare, centrifugare a 200 × g per 5 minuti, risospendere in 1 mL di terreno di coltura a cellule T e ricontare.
   5. Aggiungere 9 mL di terreno di coltura di cellule T calde per ottenere un volume finale di 10 mL. Trasferire la sospensione in una capsula di Petri. Etichettarlo come "Cellule T scongelate" e incubare per una notte a 37 °C con il 5% di CO₂ per far riposare le cellule.
3. Lavare la piastra moDC e aggiungere l'immunostimolatore se lo si desidera.
   1. Il giorno 8, centrifugare la piastra moDC (dal giorno 7) a 300 × g per 5 minuti.
   2. Aspirare il surnatante, lavare con HBSS caldo, ripetere la centrifugazione, aspirare nuovamente e risospendere le cellule in un terreno di coltura moDC caldo contenente GM-CSF e IL-4 (100 μL/pozzetto).
      NOTA: Fare attenzione a non disturbare le celle. Inclinare la piastra durante l'aspirazione. Circa 10 μl possono rimanere nel pozzetto.
   3. Se si utilizza l'immunostimolazione, aggiungere 1 μL/pozzetto di LPS stock 100x (o altro agente immunostimolante) ai pozzetti desiderati. Incubare la piastra per una notte a 37 °C con CO₂ al 5%.

3. Analisi del flusso per moDC (Validazione + Tolleranza)

1. Analisi del flusso per la validazione del moDC
   1. Il giorno 8, preparare cocktail di anticorpi per il pannello di convalida, mirando ai seguenti marcatori: HLA-DR, CD14, lectina di tipo C specifica per le cellule dendritiche (DC-SIGN), CD1c e CD40 come descritto nella Tabella 2. Diluire tutti gli anticorpi con una soluzione di colorante a flusso.
      NOTA: Il pannello è stato progettato per un citometro a flusso laser rosso/blu a 7 canali.
   2. Recupera la piastra moDC dall'incubatore. Centrifugare il piatto a 300 × g per 5 min. Rimuovere i surnatanti. Facoltativo: conservare i surnatanti per l'analisi ELISA per le citochine IL-10 e TNFα utilizzando i kit disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.
   3. Aggiungere 200 μL/pozzetto di soluzione colorante a flusso. Centrifugare il piatto a 300 × g per 5 min.
   4. Aspirare il surnatante e aggiungere 50 μL/pozzetto di anticorpo inibitore del legame del recettore Fc diluito 1:200 in soluzione di colorazione a flusso per bloccare il legame aspecifico. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 min.
   5. Aggiungere 50 μl/pozzetto del cocktail di anticorpi preparato dal pannello di convalida .
   6. Preparare i controlli di compensazione nella piastra o in provette da 1,5 mL mescolando 50 μl di perle di compensazione con 50 μl di ciascun anticorpo diluito. Incubare la piastra a 4 °C per 1 ora.
      NOTA: Qui vengono utilizzate perle di compensazione piuttosto che cellule per la compensazione a causa della potenziale bassa espressione dei marcatori sulle moDC.
   7. Lavare centrifugando a 300 × g per 5 minuti, rimuovendo il surnatante e riprospendendo in 200 μl di soluzione colorante a flusso. Eseguire due lavaggi.
   8. Dopo il lavaggio finale, centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in 110 μL/pozzetto di soluzione colorante a flusso. I campioni sono ora pronti per l'analisi con citometria a flusso.
2. Analisi del flusso per moDC tollerogenico (Tolerance Panel)
   1. Analogamente al passaggio 3.1 del giorno 8, preparare cocktail di anticorpi per il pannello di tolleranza, mirando ai seguenti marcatori: CD86, PD-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA e CD40 (Tabella 2).
   2. Ripetere i passaggi 3.1.2-3.1.8, sostituendo il cocktail di anticorpi con il cocktail del pannello di tolleranza .

4. Analisi del flusso delle cellule T

1. Combina le cellule T con moDC tollerogeniche trattate.
   1. Il giorno 9, recuperare la piastra di Petri delle cellule T scongelate dall'incubatore e trasferire tutte le cellule T in una provetta da 50 mL. Rabboccare con la soluzione colorante a flusso.
   2. Opzionale: se si esegue l'analisi della proliferazione delle cellule T, dividere le cellule T in due provette.
      1. Con il primo tubo, centrifugare a 250 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Colorare questo tubo con colorante per la proliferazione cellulare secondo le istruzioni del produttore.
         NOTA: Abbiamo utilizzato il colorante di vitalità fissabile eFluor 670, che richiede una fase di incubazione di 30 minuti, seguita da due fasi di lavaggio. Si consiglia di utilizzare provette coniche da 50 mL per prevenire la perdita di cellule e di utilizzare HBSS con HIFBS al 10% per lavare dopo la colorazione.
      2. Utilizzare la seconda provetta contenente cellule T non colorate per l'analisi delle Treg. Allo stesso modo, centrifugare a 250 × g per 5 minuti, rimuovere il surnatante, risospendere in terreni di coltura cellulare caldi e conservare nell'incubatore durante il processo di colorazione. Se non è richiesta la proliferazione delle cellule T, ridurre tutte le cellule T e sostituirle con terreni di coltura di cellule T calde.
   3. Conta le cellule e ottieni almeno 4 milioni (per la sola analisi delle Treg) o 8 milioni (per l'analisi della proliferazione delle Treg e delle T).
   4. Recuperare la piastra moDC dall'incubatore con i pozzetti rimanenti, centrifugare a 300 × g per 5 minuti e apirare i surnatanti. Aggiungere 200 μL/pozzetto di cellule T a 1,6 × 10⁵ cellule/pozzetto. Aggiungere cellule T non colorate per le piastre di analisi Treg e cellule T colorate per le piastre di proliferazione delle cellule T.
      NOTA: In questo modo si manterrà un rapporto tra cellule T e moDC di 5:1, poiché i primi 3 ×10⁴ moDC in genere si espandono leggermente.
   5. Aggiungere 25 μL/mL di cocktail di anticorpi anti-CD3/CD28 a tutti i gruppi, ad eccezione dei pozzetti di controllo negativi, per stimolare le cellule T. Incubare la piastra per 72 ore a 37 °C con CO₂ al 5% fino al giorno 12.
      NOTA: Assicurarsi di utilizzare cellule T colorate per l'analisi della proliferazione e non colorate per l'analisi Treg.
2. Analisi del flusso Treg
   1. Colorazione del marcatore superficiale
      1. Il giorno 12, preparare cocktail di anticorpi per il pannello Treg (Tabella 2).
      2. Trasferire tutte le sospensioni cellulari dalla piastra di coltura a 96 pozzetti in una piastra con fondo a V con soluzione di colorazione a flusso. Conservare i surnatanti per l'analisi delle citochine.
      3. Lavare le cellule 2 volte mediante centrifugazione (200 × g per 5 minuti seguiti da 200 μL di soluzione colorante Flow). Metti da parte alcune celle per i controlli di compensazione. Metterne da parte uno per la colorazione FOXP3 e per i controlli non colorati.
         NOTA: Si consiglia di pettinare 10 μl di tutti i campioni prima della centrifuga finale al punto 4.2.1.3 per ottenere i necessari controlli di compensazione. Questo fornisce un campione rappresentativo di tutta l'espressione a livello superficiale di ciascun marcatore sulle cellule.
      4. Dopo il secondo lavaggio, centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare, quindi aggiungere 50 μL/pozzetto di anticorpo inibitore del legame del recettore Fc (diluito 1:200 in Flow Staining Solution). Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
      5. Aggiungere 50 μl/pozzetto del cocktail di anticorpi Treg Panel preparato.
      6. Per i controlli di compensazione, miscelare 50 μl di cellule di compensazione non colorate con 50 μl di ogni singolo anticorpo colorato.
      7. Incubare la piastra e i controlli di compensazione a 4 °C per 1 ora. Lavare una volta la piastra con Flow Stain Solution e centrifugare a 300 × g per 5 min.
      8. Colorare con colorante vivo/morto nel vicino infrarosso diluito in HBSS (1:1.000) a 200 μL/pozzetto. Incubare a 4 °C per 30 min.
      9. Lavare la piastra una volta con la soluzione di colorazione a flusso (200 μL/pozzetto) a 300 × g per 5 minuti.
   2. Colorare con FoxP3 secondo le istruzioni del produttore, che richiederà un'incubazione notturna. Di seguito viene descritta una breve panoramica del protocollo di colorazione FoxP3.
      1. Preparare la soluzione di lavoro per fissaggio/permeabilizzazione FoxP3 secondo le istruzioni del produttore. Miscelare 1 parte di FoxP3 Fixation/Permeabilization Concentrate con 3 parti di FoxP3 Fixation/Permeabilization Diluent. Preparare 200 μl della soluzione di lavoro per campione.
      2. Incubare tutti i campioni in 200 μL/pozzetto della soluzione di fissazione/permeabilizzazione funzionante. Lasciare agire a 4 °C per 1 ora.
      3. Preparare 1x Tampone di Permeabilizzazione: Mescolare 1 parte di 10x Tampone di Permeabilizzazione (ottenuto dal kit commerciale) con 9 parti di acqua distillata.
      4. Lavare la piastra 2 volte con 1 tampone di permeabilizzazione (200 μl/pozzetto) a 300 × g per 5 minuti.
      5. Colorare con l'anticorpo FoxP3 (PE-Cy5.5, diluizione 1:300 in 1x tampone di permeabilizzazione): aggiungere 100 μL/pozzetto dell'anticorpo FoxP3 diluito e incubare a 4 °C per una notte.
      6. Lavare la piastra 2 volte con 1 tampone di permeabilizzazione (200 μl/pozzetto) a 300 × g per 5 minuti.
      7. Risospendere le cellule in 110 μL/pozzetto di soluzione colorante a flusso.
      8. Eseguire l'analisi della citometria a flusso.
3. Analisi della proliferazione delle cellule T
   1. Preparare cocktail di anticorpi per il pannello di proliferazione T (Tabella 2).
   2. Trasferire tutte le sospensioni cellulari dalla piastra di coltura a 96 pozzetti in una piastra con fondo a V con soluzione di colorazione a flusso. Conservare i surnatanti per l'analisi delle citochine.
   3. Lavare le cellule 2 volte mediante centrifugazione (200 × g per 5 minuti seguiti da 200 μL di soluzione colorante Flow). Metti da parte alcune celle per i controlli di compensazione. Metterne da parte uno per la colorazione FOXP3 e per i controlli non colorati.
      NOTA: Si consiglia di pettinare 10 μl di tutti i campioni prima della centrifuga finale al punto 4.3.3 per ottenere i necessari controlli di compensazione. Questo fornisce un campione rappresentativo di tutta l'espressione a livello superficiale di ciascun marcatore sulle cellule.
   4. Dopo il secondo lavaggio, centrifugare (200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente) e aspirare, quindi aggiungere 50 μL/pozzetto di anticorpo inibitore del legame del recettore Fc (diluito 1:200 in Flow Staining Solution). Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
   5. Aggiungere 50 μl/pozzetto del cocktail di anticorpi preparato del pannello di proliferazione T .
   6. Per i controlli di compensazione, miscelare 50 μl di cellule di compensazione non colorate con 50 μl di ogni singolo anticorpo colorato.
   7. Incubare la piastra e i controlli di compensazione a 4 °C per 1 ora. Lavare una volta la piastra con Flow Stain Solution e centrifugare a 300 × g per 5 min.
   8. Colorare con colorante vivo/morto nel vicino infrarosso diluito in HBSS (1:1.000) a 200 μL/pozzetto. Incubare a 4 °C per 30 min.
   9. Lavare la piastra una volta con la soluzione di colorazione a flusso (200 μL/pozzetto) a 300 × g per 5 minuti.
   10. Eseguire l'analisi della citometria a flusso.

Abbiamo descritto un protocollo per le PBMC umane, isolando sia le cellule T CD3⁺ che i monociti CD14⁺ utilizzando kit di separazione magnetica disponibili in commercio, differenziando i monociti in moDC CD14^-, HLA-DR⁺, CD141⁺, CD1c⁺ utilizzando GM-CSF e IL-4, trattandoli per 24 ore e co-coltura con cellule T autologhe con stimolazione anti-CD3/CD28 per 72 ore. Uno schema sperimentale è mostrato nella

Qui descriviamo un metodo affidabile e versatile per valutare la funzionalità di agenti immunomodulatori per indurre tolDC da moDC e convalidare la loro funzionalità per generare Treg da cellule T autogene ex vivo. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, i monociti sono cellule notoriamente sensibili e devono essere ottenuti da PBMC fresche e non precedentemente congelate per ottenere i migliori risultati. I monociti devono essere isolati il prima ...

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Vorremmo ringraziare lo Human Immunology Core (HIC) dell'Università della Pennsylvania per aver fornito nuove PBMC umane da donatori. L'HIC è supportato in parte da NIH P30 AI045008 e P30 CA016520.