Farelerde Akciğer Adenokarsinomu Ksenogreft Modelinin Oluşturulması ve MAPK Yolağı ile XY Kaynatma Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Bu çalışma, XY kaynatma işleminin MAPK yolağını düzenleyerek akciğer adenokarsinomuna karşı terapötik etkiler gösterdiğini göstermektedir.

Akciğer adenokarsinomu dünya çapında artmakta ve etkili tedavi yöntemlerinin araştırılmasına ve geliştirilmesine yol açmaktadır. Son yıllarda, geleneksel Çin tıbbının XiaoYi (XY) kaynatma gibi akciğer adenokarsinomu için terapötik potansiyeli giderek daha fazla kabul görmektedir. Geleneksel Çin tıbbının akciğer adenokarsinomunun tedavisinde etki mekanizması aydınlatılmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, akciğer adenokarsinomu tedavisinde XY kaynatma işleminin terapötik etkilerini araştırmak için hayvan modelleri kullanılmıştır. Farelerde XY kaynatma işleminin kan giriş kimyasal bileşenleri, UHPLC-QE-MS kullanılarak hem pozitif hem de negatif iyon modlarında ayrıldı ve analiz edildi. Bulgular daha sonra tümör boyutunun azaldığını, patolojik değişikliklerin arttığını ve apoptozun arttığını gösteren in vivo deneylerle doğrulandı. Sonuç olarak, XY kaynatma uygulamasını takiben kana emilen on beş bileşen tanımlandı: Stachyose, Quercetin-3-O-beta-glukopiranosil-7-O-alfa-ramnopiranozid; İmparatorluk; Spinosin B; Peimine; Flavon tabanı + 3O, 2MeO, O-Hex; Pikropodofilotoksin; (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihidroksi-2 [[(3S,5R,8R,10R,12R,13R,14R,17S)-12-hidroksi-17-(2-hidroksi-6-metilhept-5-en-2-il) 4,4,8,10,14-pentametil-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodekahidro-1H siklopenta[a]fenantren-3-il]oksi]-6-(hidroksimetil)oksan-3-il]oksi-6-(hidroksimetil)oksan-3,4,5-triol; Trisin; Ginsenosit Rg1; (20R)-Ginsenosit Rh1; Jujuboside B; Aucubin; Ginsenosid Rg3; ve beta-Elemonik asit. Hayvan deneyleri, XY kaynatma işleminin tümör büyümesini inhibe ettiğini, patolojik değişiklikleri iyileştirdiğini ve doza bağlı bir şekilde tümör hücresi apoptozunu teşvik ettiğini gösterdi. İlgili mekanizmalar, MAPK yolağındaki p-JNK ve p-P38 protein ekspresyonunun yukarı regülasyonu ve MAPK yolağındaki p-ERK protein ekspresyonunun aşağı regülasyonu ile ilişkili olabilir. Sonuç olarak, XY kaynatma, MAPK yolunu düzenleme ve akciğer adenokarsinomuna karşı terapötik etkiler gösterme potansiyeline sahiptir.

Akciğer kanseri insidansı dünya çapında artmaktadır. Tüm malignitelerin %18'ini oluşturur ve kansere bağlı ölümlerin önemli bir kısmından sorumludur ^1,2. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), ana patolojik tip³ adenokarsinom olan yaygın bir akciğer kanseri türüdür. Sinsi semptomları nedeniyle, NSCLC sıklıkla ileri bir aşamada teşhis edilir ve yüksek mortalite oranına sahiptir ^4,5. Evre IV KHDAK hastalarının beş yıllık sağkalım oranı sadece %5'tir6, cerrahi olarak rezeke edilebilir erken evre KHDAK bile beş yıllık sağkalım oranı sadece %50'dir7.

Günümüzde akciğer adenokarsinomunun tedavisi cerrahi, radyoterapi, kemoterapi, immünoterapi ve hedefe yönelik tedaviyi içermektedir. Ek olarak, akciğer adenokarsinomu için geleneksel Çin tıbbı (TCM) giderek daha fazla tanınmakta ve değer görmektedir⁸. TCM'nin uzun bir geçmişi vardır ve etkili terapötik sonuçları olan çeşitli onkolojik hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır ^9,10. İnsan vücudunu bir bütün olarak kabul eder, terapötik prensip Qi'nin hareketini geri kazanmaya odaklanır (Qi, kan ve vücut sıvılarının dolaşımını teşvik eden, NSCLC hastalarında bağışıklığın artmasına ve inflamasyonun azalmasına katkıda bulunan hayati enerjiyi ifade eder) genel dengeyi yeniden sağlamak ve kanserin ilerlemesini engellemek için iç organlarda.

TCM sadece düşük toksisiteli, çoklu hedefli ve yüksek verimli¹¹ onkolojik hastalıkları tedavi etmekle kalmaz, aynı zamanda radyoterapi ve kemoterapinin neden olduğu hasarın onarımını kolaylaştırır ve böylece sağkalımı uzatır¹².

Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) teknolojisi, karmaşık bileşik karışımlarındaki bileşenlerin ayrılmasını ve algılanmasını sağlamak için sıvı kromatografisini kütle spektrometresi ile entegre eder¹³. LC-MS, geleneksel Çin tıbbı (TCM) kaynatmalarında çeşitli kimyasal bileşenlerin ayrılmasına ve tanımlanmasına olanak tanıyan yüksek çözünürlük, yüksek hassasiyet ve yüksek özgüllük sunar. Oral uygulamadan^14,15 sonra kan giriş aktif bileşenlerini ayıran ve tespit eden serum tıbbi kimyası ile birleştirildiğinde, LC-MS potansiyel ilaç etki mekanizmalarının tahmin edilmesini ve analiz edilmesini sağlar. Bu yaklaşım, TCM kaynatmalarının kimyasal bileşiminin ve farmakolojik bileşenlerinin anlaşılmasına yardımcı olur, farmakolojik etkileri ve klinik uygulamaları hakkında derinlemesine araştırmalar için gerekli verileri sağlar ve TCM araştırmasında oldukça uygulanabilir hale getirir^16,17.

MAPK sinyal yolu, akciğer kanserinin oluşumunda, ilerlemesinde, metastazında ve invazyonunda çok önemli bir rol oynar ve Erk, p38 ve JNK önemli alt ailelerdir. TCM kaynatmalarının, MAPK yolu^18'deki proteinlerin ekspresyonunu etkilediği gösterilmiştir. XiaoYi (XY) kaynatma, YiGuan kaynatma işleminden türetilmiştir ve Changchun Çin Tıbbı Üniversitesi'nin Birinci Bağlı Hastanesi'nde akciğer adenokarsinomunu tedavi etmek için kullanılır (Şekil 1), bu da kesin klinik etkinlik gösterir. Bununla birlikte, terapötik mekanizması belirsizliğini korumaktadır.

Bu çalışmada, akciğer adenokarsinomuna karşı XY kaynatma işleminin olası terapötik mekanizmasını aydınlatmak için Q-Exactive Orbitrap kütle spektrometresi (UHPLC-QE-MS) ile birleştirilmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanıldı ve etkileri in vivo çalışmalarla doğrulandı.

Tüm hayvan prosedürleri, Changchun Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi (Etik No. 2024008) tarafından onaylanmıştır. Spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında yetiştirilen altı haftalık C57BL / 6 erkek fareler (20 ± 2 g), sabit sıcaklık ve nem ile kontrollü bir ortamda tipik fiziksel aktivite modelleri sergiledi. Yiyecek ve suya ad libitum erişimleri vardı ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında tutuldular. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. XY kaynatma sulu ekstraktının hazırlanması

1. Panax ginseng C.A. Mey (Renshen, 15 g), Chinemys reevesii (Gri) (Guiban, 30 g) ve Trionyx sinensis Wiegmann'ı (Biejia, 30 g) bir kaynatma kabına koyun. 1000 mL deiyonize su ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
2. Adım 1.1'deki üç otu 1 saat kaynatın. Aynı zamanda, Rehmannia glutinosa Libosch (Dihuang, 30 g), Trichosanthes kirilowii Maxim'i ıslatın. (Tianhuafen, 30 g), Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Roma.) Stapf (Yiyiren, 20 g), Paeonia lactiflora Pall. (Baishao, 30 g), Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang, 7 g), Commiphora myrrha Engl. (Moyao, 7 g), Agrimonia pilosa Ledeb. (Xianhecao, 20 g), Alpinia oxyphylla Miq. (Yizhiren, 20 g), Ziziphus hünnap Değirmeni. spinosa (Bunge) (Suanzaören, 30 g), Melia toosendan Sieb. et Zucc. (Chuanlianzi, 5 g), Fritillaria thunbergii Miq. (Zhebeimu, 15 g), Anemarrhena asphodeloides Bge. (Zhimu, 10 g), Platycodon grandiflorum (Jacq.) (Jiegeng, 10 g), Polygala tenuifolia Willd. (Yuanzhi, 15 g) ve Phragmites communis Trin. (Lugen, 30 g) başka bir kapta 30 dakika. Suya batırdıktan sonra, 1.1 adımındaki kaynatma kabına aktarın.
3. Adım 1.1 ve adım 1.2'deki 18 bitkinin tümünü 30 dakika kaynatın. Bitkisel sıvıyı dökün, 1000 mL deiyonize su ekleyin ve 30 dakika daha kaynatın. Üç porsiyon bitkisel sıvı elde etmek için bu kaynatma işlemini üç kez tekrarlayın, ardından birleştirin ve iyice karıştırın.
4. Karıştırılmış bitkisel sıvıyı 400 gözenekli bir bezden süzün. Süzüntüyü düşük basınç altında konsantre edin, ardından konsantre bitkisel sıvıyı daha sonraki işlemler için soğutma ekipmanına aktarın.
5. Konsantre bitkisel sıvıyı bir liyofilizasyon tepsisine dökün ve bir vakumlu liyofilizatörün ön dondurma odasına yerleştirin. Ön dondurma tamamlandıktan sonra, suyu çıkarmak için tepsiyi süblimasyon kurutma odasına aktarın.
6. Yüksek sıcaklıkta kalan nemi temizleyin. İnce liyofilize XY kaynatma tozu elde etmek için dondurularak kurutulmuş bitki ekstraktını bir pulverizatör kullanarak toz haline getirin (Şekil 2).

2. İlaç içeren serum hazırlama

1. Altı haftalık C57BL / 6 erkek fareyi (20 ± 2 g) rastgele XiaoYi (XY) grubuna veya kontrol grubuna atayın.
   NOT: Fare dozu, insandan fareye dönüşüm faktörü kullanılarak hesaplanmıştır:
   Fareler için eşdeğer deney dozu (g / kg) = {İnsan dozu (g / kg) / Vücut ağırlığı (70 kg)} x 9.1
   Bu hesaplamaya dayanarak, fareler için dozaj 2.6 g / kg olarak belirlendi.
2. 0.9152 g liyofilize XY kaynatma tozunu tartın ve ilaç çözeltisini hazırlamak için 3.2 mL damıtılmış su içinde çözün.
   NOT: Fareler oral uygulamadan önce 12 saat aç bırakıldı.
3. XY kaynatma işlemini XY grubundaki farelere gavaj yoluyla uygularken, kontrol grubunu eşdeğer hacimde deiyonize su ile uygulayın.
4. Oral uygulamadan 2 saat sonra, fareleri pentobarbital sodyum ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Kan örneklerini toplamak için cımbız kullanarak gözbebeklerini enüklee edin, ardından fareleri CO₂ boğulması ve ardından etik yönergeleri izleyerek servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın¹⁹.
5. Kan örneklerinin oda sıcaklığında 90 dakika stabilize olmasına izin verin. Süpernatanı toplamak için 3450 x g'da (4 ° C) 15 dakika santrifüjleyin.

3. UHPLC-QE-MS analizi

1. 500 μL ekstraksiyon çözeltisine (metanol: su = 4: 1) 100 mg XY kaynatma liyofilize toz ekleyin. İyice karıştırın, sonikat yapın ve 1 saat boyunca buzlu su banyosunda inkübe edin.
2. Karışımı 1 saat -40 °C'de tutun, ardından 13.800 x g'da (4 °C) 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 0,22 μm'lik bir filtre membranından süzün, ardından kalite kontrol (QC) numuneleri oluşturmak için her süpernatanın 100 μL'sini birleştirin.
3. Plazma örnekleri çözüldükten sonra, kontrol grubu plazma örneğinden 400 μL ve XY grubu plazma örneklerinden 400 μL alın. Her numuneye 40 μL hidroklorik asit (2 mol/L) ekleyin. 1 dakika vorteksleyin ve karışımı 4 °C'de 15 dakika bekletin. Bu adımı dört kez tekrarlayın.
4. 1.6 mL asetonitril ekleyin ve 5 dakika boyunca girdap yapın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13.800 x g'da santrifüjleyin. 1.800 μL süpernatanı nitrojen kurutmaya tabi tutun.
5. Kurutulmuş numuneleri, 5 dakika boyunca girdaplama yoluyla 10 μg/mL iç standart içeren 150 μL% 80 metanol içinde sulandırın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13.800 × g'da santrifüjleyin, ardından 120 μL süpernatanı LC-MS analizi için taze bir cam şişeye aktarın (Şekil 3).

4. Hücre kültürü ve hayvan hazırlama

1. %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) içeren bir kültür kabında 1 mL Lewis akciğer karsinomu hücresi tohumlayın. Hücreleri kontrollü koşullar altında 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
2. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında,% 0.25 tripsin kullanarak onları geçirin. Hücre durumu stabilize olana kadar pas vermeye devam edin, ardından hücre konsantrasyonunu 3 x 10⁶ hücre / mL'ye ayarlayın.
3. Akciğer adenokarsinomu modelini oluşturmak için hazırlanan hücre süspansiyonunun 0.1 mL'sini erkek C57BL / 6 farelerinin sağ aksillasına deri altından enjekte edin.
   NOT: Tümör dokusu, aşılamadan 5 gün sonra farelerin aksillasında palpe edilebilir.
4. 5 gün sonra, fareleri rastgele beş gruba ayırın (grup başına n = 6): Model grubu (M) - Tedavi yok; XY kaynatma düşük doz grubu (XY-L) - 1.3 g / kg; XY kaynatma orta doz grubu (XY-Z) - 2.6 g / kg; XY kaynatma yüksek doz grubu (XY-H) - 5.2 g / kg; Sisplatin grubu (DDP) - Sisplatin²⁰ ile tedavi edilir.
5. XY kaynatma tozunu karşılık gelen dozda 200 μL damıtılmış su içinde çözün ve gavaj yoluyla uygulayın. M ve DDP grupları, gavaj yoluyla eşit hacimde damıtılmış su alır.
6. Sisplatini DDP grubuna her 3 günde bir intraperitoneal enjeksiyon (3 mg / kg) yoluyla uygulayın. Aynı hacimde fizyolojik salini diğer gruplara enjekte edin.

5. Tümör dokusunun patolojik analizi

1. 21 gün sonra, CO₂ asfiksiasyonu ve ardından servikal çıkık (etik kurallara izleyerek) kullanarak tüm farelere ötenazi yapın ve tümör dokusunu^{çıkarın 21}. Tümör hacmini ve ağırlığını ölçün (Şekil 4).
2. Eksize edilen tümör dokularını 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin). Dereceli etanol çözeltileri kullanarak dokuyu kurutun.
3. Susuz kalmış doku bloklarını ksilen kullanarak temizleyin, ardından erimiş parafin mumuna gömün. Balmumunun bir parafin bloğu halinde katılaşmasına izin verin. Doku bloğunu bir mikrotom kullanarak 5 μm kalınlığında dilimler halinde bölümlere ayırın.
4. Doku bölümlerini ksilen içinde mumdan arındırın, ardından kademeli etanol çözeltilerinde rehidrasyon yapın. Bölümleri hematoksilen ile 5 dakika boyayın, ardından deiyonize su ile durulayın.
5. Bölümleri 1 dakika boyunca% 0,5 eozin çözeltisi ile boyayın. Lekeli bölümleri optik mikroskop altında gözlemleyin ve analiz için görüntüleri yakalayın.

6. Tümör dokusunun immünohistokimyasal analizi

1. Adım 5.2-5.4'te açıklanan prosedürleri izleyerek mum alma ve rehidrasyon gerçekleştirin.
2. Bölümleri endojen bir peroksidaz blokerinde oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bölümleri keçi serumu ile inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin.
3. Birincil antikorları uygulayın: Ki-67 (1:600) ve Kaspaz-3 (1:100). Bölümleri gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. PBS tamponu ile yıkayın), ardından genel amaçlı bir ikincil antikor (1:500) uygulayın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
4. DAB çözeltisi ekleyerek renk reaksiyonunu geliştirin. Bölümleri hematoksilen çözeltisi ile lekeleyin.
5. Lekeli bölümlerin dehidrasyonunu, temizlenmesini ve sızdırmazlığını gerçekleştirin. Optik mikroskop altında protein ekspresyonunu gözlemleyin ve analiz için görüntüler yakalayın.

7. Batı lekesi analizi

1. Bir doku parçalayıcı kullanarak tümör dokularını homojenize edin. Toplam proteini ekstrakte edin ve bir bikinkoninik asit (BCA) tahlil kiti kullanarak konsantrasyonunu belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Protein miktar tayinini gerçekleştirin, ardından SDS-PAGE elektroforezi ve bir zar üzerine protein transferi yapın.
3. Membranı gece boyunca 4 ° C'de birincil antikorlarla inkübe edin: P38 (1:2000), p-P38 (1:1000), ERK (1:20000), p-ERK (1:500), JNK (1:2000), p-JNK (1:5000), β-aktin (1:200) (bkz.
4. Ertesi gün, zarı yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge ikincil antikoru ile oda sıcaklığında 1.5 saat inkübe edin. Gelişmiş bir kemilüminesans (ECL) sistemi kullanarak protein bantlarını tespit edin.
   NOT: Protein bant yoğunlukları ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülmüştür.

Kontrol grubundan ve XY grubundan XY toz çözeltisi ve serum örnekleri UHPLC-QE-MS kullanılarak analiz edildi ve iyi ayrılmış pikler ortaya çıktı. Pozitif ve negatif iyon modları için toplam iyonizasyon diyagramları Şekil 3'te gösterilmiştir. XY kaynatma işleminin bileşimi, tutma süresi, edinme modu ve kütle spektrumu fragmanlarına dayalı olarak tanımlandı. Boş ve XY kaynatma oral uygulama gruplarını...

Kanser insidansı her yıl artmakta ve önemli klinik ve araştırma ilgisi çekmektedir^22,23. Son çalışmalar, geleneksel Çin tıbbının (TCM) akciğer kanseri tedavisinde etkinliğini göstermiştir 24,25,26. Örneğin, Maimendong kaynatma işleminin NK hücrelerinin sayısını ve aktivitesini arttırdığı ve böylece akciğer k...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, Jilin Eyaleti Bilim ve Teknoloji Geliştirme Planı Maddesi (YDZJ202301ZYTS459) tarafından desteklenmiştir.