Построение модели ксенотрансплантата аденокарциномы легкого у мышей и оценка эффективности отвара XY через путь MAPK

Это исследование демонстрирует, что отвар XY оказывает терапевтическое действие против аденокарциномы легкого, регулируя путь MAPK.

Аденокарцинома легкого растет во всем мире, что побуждает к исследованию и разработке эффективных методов лечения. В последние годы все больше признается терапевтический потенциал традиционной китайской медицины для лечения аденокарциномы легкого, такой как отвар СяоИ (XY). Механизм действия традиционной китайской медицины в лечении аденокарциномы легкого продолжает выясняться. В этом исследовании использовались животные модели для изучения терапевтических эффектов отвара XY в лечении аденокарциномы легкого. Входящие в кровь химические компоненты отвара XY у мышей разделяли и анализировали как в положительном, так и в отрицательном ионном режимах с использованием UHPLC-QE-MS. Затем результаты были подтверждены с помощью экспериментов in vivo , которые продемонстрировали уменьшение размера опухоли, улучшение патологических изменений и увеличение апоптоза. В результате были идентифицированы пятнадцать компонентов, всасывающихся в кровь после приема XY-отвара: Стахиоза, Кверцетин-3-О-бета-глюкопиранозил-7-О-альфа-рамнопиранозид; Империалин; Спинозин В; Пеймин; Флавоновая основа + 3O, 2MeO, O-Hex; Пикроподофиллотоксин; (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-дигидрокси-2 [[(3S,5R,8R,10R,12R,13R,14R,17S)-12-гидрокси-17-(2-гидрокси-6-метилгепт-5-ен-2-ил) 4,4,8,10,14-пентаметил-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-додекагидро-1H циклопента[a]фенантрен-3-ил]окси]-6-(гидроксиметил)оксан-3-ил]окси-6-(гидроксиметил)оксан-3,4,5-триол; Трицин; Гинзенозид Rg1; (20R)-гинзенозид Rh1; Джуджубозид В; Аукубин; гинзенозид Rg3; и бета-элемоновая кислота. Эксперименты на животных показали, что отвар XY подавляет рост опухоли, улучшает патологические изменения и способствует апоптозу опухолевых клеток дозозависимым образом. Задействованные механизмы могут быть связаны с повышением экспрессии белков p-JNK и p-P38 в пути MAPK и подавлением экспрессии белка p-ERK в пути MAPK. В заключение следует отметить, что XY-отвар обладает потенциалом для регулирования пути MAPK и оказания терапевтического эффекта против аденокарциномы легкого.

Заболеваемость раком легких растет во всем мире. На его долю приходится 18% всех злокачественных новообразований и он является причиной значительного^{числа смертей}, связанных с раком1,2. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) является распространенной формой рака легких, при этом аденокарцинома является основным патологическим типом³. Из-за своей коварной симптоматики НМРЛ часто диагностируется на поздней стадии и имеет высокий уровень летальности ^4,5. Пациенты с НМРЛ IV стадии имеют пятилетнюю выживаемость всего 5%⁶, в то время как даже хирургически резектабельная ранняя стадия НМРЛ имеет пятилетнюю выживаемость всего 50%⁷.

В настоящее время лечение аденокарциномы легкого включает хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, иммунотерапию и таргетную терапию. Кроме того, традиционная китайская медицина (ТКМ) для лечения аденокарциномы легкого получает все большее признание и ценится⁸. ТКМ имеет долгую историю и применяется в лечении различных онкологических заболеваний с эффективными терапевтическими результатами ^9,10. Он рассматривает человеческое тело как единое целое, с терапевтическим принципом, направленным на восстановление движения Ци (Ци относится к жизненной энергии, которая способствует циркуляции крови и жидкостей организма, способствуя повышению иммунитета и уменьшению воспаления у пациентов с НМРЛ) во внутренних органах для восстановления общего баланса и замедления прогрессирования рака.

ТКМ не только лечит онкологические заболевания с низкой токсичностью, множественностью мишеней и высокой^{эффективностью11}, но также облегчает восстановление повреждений, вызванных лучевой терапией и химиотерапией, тем самым продлевая выживаемость¹².

Технология жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС) объединяет жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией для достижения разделения и обнаружения компонентов в сложных смесях соединений¹³. LC-MS обладает высоким разрешением, высокой чувствительностью и высокой специфичностью, что позволяет разделять и идентифицировать различные химические компоненты в отварах традиционной китайской медицины (ТКМ). В сочетании с химическими веществами сыворотки, которые отделяют и обнаруживают активные компоненты, поступающие в кровь после перорального приема^14,15, LC-MS позволяет прогнозировать и анализировать потенциальные механизмы действия лекарственных средств. Этот подход помогает понять химический состав и фармакологические компоненты отваров ТКМ, предоставляя важные данные для углубленных исследований их фармакологических эффектов и клинического применения, что делает его очень применимым в исследованиях ТКМ^16,17.

Сигнальный путь MAPK играет решающую роль в генезе, прогрессировании, метастазировании и инвазии рака легких, при этом важными подсемействами являются Erk, p38 и JNK. Было показано, что отвары ТКМ влияют на экспрессию белков в пути MAPK¹⁸. Отвар XiaoYi (XY) получен из отвара YiGuan и используется для лечения аденокарциномы легкого в Первой аффилированной больнице Чанчуньского университета китайской медицины (Рисунок 1), демонстрируя точную клиническую эффективность. Однако его терапевтический механизм остается неясным.

В этом исследовании была использована ультравысокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией Q-Exactive Orbitrap (UHPLC-QE-MS) для выяснения возможного терапевтического механизма применения отвара XY против аденокарциномы легкого, и его эффекты были подтверждены в ходе исследований in vivo .

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Чанчуньского университета традиционной китайской медицины (Этика No 2024008). Шестинедельные самцы мышей C57BL/6 (20 ± 2 г), выведенные в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF), демонстрировали типичные модели физической активности в контролируемой среде с постоянной температурой и влажностью. Они имели свободный доступ к пище и воде и поддерживались в течение 12-часового цикла свет/темнота. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Приготовление XY отвара водного экстракта

1. Положите в баночку для отвара женьшень Panax C.A. Mey (Renshen, 15 г), Chinemys reevesii (Gray) (Guiban, 30 г) и Trionyx sinensis Wiegmann (Biejia, 30 г). Добавьте 1000 мл деионизированной воды и замочите на 30 минут при комнатной температуре.
2. Отварите три травы с шага 1.1 в течение 1 ч. Одновременно замочите Rehmannia glutinosa Libosch (Dihuang, 30 г), Trichosanthes kirilowii Maxim. (Тяньхуафэнь, 30 г), Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Штапф (Yiyiren, 20 г), Paeonia lactiflora Pall. (Байшао, 30 г), Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang, 7 г), Commiphora myrrha Engl. (Moyao, 7 г), Agrimonia pilosa Ledeb. (Xianhecao, 20 г), Alpinia oxyphylla Miq. (Yizhiren, 20 г), Ziziphus jujuba Mill. spinosa (Bunge) (Suanzaoren, 30 г), Melia toosendan Sieb. et Zucc. (Чуаньлянцзы, 5 г), Fritillaria thunbergii Miq. (Жебейму, 15 г), Anemarrhena asphodeloides Bge. (Жиму, 10 г), Platycodon grandiflorum (Jacq.) (Jiegeng, 10 г), Polygala tenuifolia Willd. (Юаньчжи, 15 г) и Phragmites communis Trin. (Люген, 30 г) в другую емкость на 30 мин. После замачивания переложите их в кастрюлю с отваром с шага 1.1.
3. Отварите все 18 трав из шагов 1.1 и шага 1.2 в течение 30 минут. Вылейте травяную жидкость, добавьте 1000 мл деионизированной воды и кипятите еще 30 минут. Повторите этот процесс кипячения три раза, чтобы получить три порции травяной жидкости, затем соедините и тщательно перемешайте их.
4. Перемешанную травяную жидкость процедите через ткань с плотностью 400 меш. Концентрируйте фильтрат под пониженным давлением, затем передайте концентрированную травяную жидкость в охлаждающее оборудование для дальнейшей обработки.
5. Перелейте концентрированную травяную жидкость в лоток для лиофилизации и поместите его в камеру предварительного замораживания вакуумного лиофилизатора. После завершения предварительного замораживания перенесите лоток в сублимационную сушильную камеру для удаления воды.
6. Удалите остатки влаги при высокой температуре. Измельчите лиофилизированный растительный экстракт с помощью пульверизатора, чтобы получить мелкодисперсный лиофилизированный порошок отвара XY (Рисунок 2).

2. Препарат из содержащей сыворотки

1. Случайным образом распределите шестинедельных мышей-самцов C57BL/6 (20 ± 2 г) либо в группу XiaoYi (XY), либо в контрольную группу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиная доза была рассчитана с использованием коэффициента пересчета человека в мышь:
   Эквивалентная экспериментальная доза для мышей (г/кг) = {Доза для человека (г/кг) / Масса тела (70 кг)} x 9,1
   На основании этого расчета была определена дозировка для мышей в размере 2,6 г/кг.
2. Взвесьте 0,9152 г лиофилизированного порошка отвара XY и растворите его в 3,2 мл дистиллированной воды для приготовления раствора препарата.
   Примечание: Мышей голодали в течение 12 ч перед пероральным введением.
3. Вводите отвар XY мышам в группе XY через зонд, в то время как контрольной группе вводите эквивалентный объем деионизированной воды.
4. Через 2 ч после перорального приема обезболить мышей пентобарбиталом натрия (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Энуклеация глазных яблок с помощью пинцета для сбора образцов крови, затем эвтаназия мышей с помощью удушения_CO2 с последующим вывихом шейки матки в соответствии с этическими^{принципами}.
5. Дайте образцам крови стабилизироваться при комнатной температуре в течение 90 минут. Центрифугируйте при 3450 x g (4 °C) в течение 15 минут для сбора надосадочной жидкости.

3. Анализ ВЭЖХЛХ-КЭ-МС

1. Добавьте 100 мг лиофилизированного порошка отвара XY в 500 μл экстракционного раствора (метанол: вода = 4:1). Тщательно перемешать, обработать ультразвуком и выдерживать на ледяной водяной бане в течение 1 ч.
2. Выдерживайте смесь при температуре -40 °C в течение 1 часа, затем центрифугируйте при 13 800 x g (4 °C) в течение 15 минут. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтрующую мембрану толщиной 0,22 мкм, затем смешайте по 100 мкл каждой надосадочной жидкости для создания образцов для контроля качества (QC).
3. После размораживания образцов плазмы отберите 400 мкл образца плазмы контрольной группы и 400 мкл образца плазмы группы XY. Добавьте 40 μL соляной кислоты (2 моль/л) в каждый образец. Вдохните в течение 1 минуты и дайте смеси настояться при температуре 4 °C в течение 15 минут. Повторите этот шаг четыре раза.
4. Добавьте 1,6 мл ацетонитрила и вортекс на 5 минут. Центрифуга при 13 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Подвергнуть 1 800 мкл надосадочной жидкости азотной сушке.
5. Восстановите высушенные образцы в 150 мкл 80% метанола, содержащего 10 мкг/мл внутреннего стандарта, путем вортексирования в течение 5 минут. Центрифугируйте при 13 800 × г в течение 5 мин при 4 °C, затем перенесите 120 мкл надосадочной жидкости в свежий стеклянный флакон для анализа LC-MS (рис. 3).

4. Клеточная культура и подготовка животных

1. Засейте 1 мл клеток карциномы легкого Льюиса в чашке для культивирования, содержащей модифицированную орлиную среду Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки в контролируемых условиях при 37 °C с 5%_CO2.
2. Когда клетки достигнут 80% слияния, пропустите их с помощью 0,25% трипсина. Продолжайте процеживание до тех пор, пока состояние клеток не стабилизируется, затем отрегулируйте концентрацию клеток до 3 x 10⁶ клеток/мл.
3. Введите 0,1 мл приготовленной клеточной суспензии подкожно в правую подмышечную впадину самцов мышей C57BL/6 для установления модели аденокарциномы легкого.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевая ткань может быть пальпирована в подмышечной впадине мышей через 5 дней после инокуляции.
4. Через 5 дней случайным образом разделите мышей на пять групп (n = 6 в группе): Модельная группа (M) - Без лечения; XY отвар низкодозированной группы (XY-L) - 1,3 г/кг; XY отвар средней дозы группы (XY-Z) - 2,6 г/кг; XY отвар высокодозированной группы (XY-H) - 5,2 г/кг; Группа цисплатина (ДДП) - обрабатывается цисплатином²⁰.
5. Растворите порошок отвара XY в 200 μл дистиллированной воды в соответствующей дозе и вводите через зонд. Группы M и DDP получают равный объем дистиллированной воды через зонд.
6. Вводите цисплатин в группу ДДП путем внутрибрюшинной инъекции (3 мг/кг) один раз в 3 дня. Введите такой же объем физиологического раствора в другие группы.

5. Патологоанатомический анализ опухолевой ткани

1. Через 21 день усыпить всех мышей с помощью удушения CO₂ с последующим вывихом шейки матки (в соответствии с этическими нормами) и иссечь опухолевую ткань²¹. Измерьте объем и вес опухоли (рисунок 4).
2. Зафиксировать иссеченные опухолевые ткани в 4% параформальдегиде на 24 ч). Обезвоживайте ткани с помощью градуированных растворов этанола.
3. Очистите обезвоженные блоки ткани с помощью ксилола, затем погрузите их в расплавленный парафин. Дайте воску застыть в парафиновый блок. Разрежьте тканевый блок на срезы толщиной 5 мкм с помощью микротома.
4. Депарафинизация срезов тканей в ксилоле с последующей регидратацией в дифференцированных растворах этанола. Срезы окрашивать гематоксилином в течение 5 минут, затем промыть деионизированной водой.
5. Срезы закрасить 0,5% раствором эозина в течение 1 мин. Наблюдайте за окрашенными срезами под оптическим микроскопом и делайте снимки для анализа.

6. Иммуногистохимический анализ опухолевой ткани

1. Выполните депарафинизацию и регидратацию в соответствии с процедурами, описанными в шагах 5.2-5.4.
2. Инкубировать срезы в эндогенном блокаторе пероксидазы при комнатной температуре в течение 15 мин. Блокируйте неспецифическое связывание путем инкубации участков с козьей сывороткой.
3. Применяют первичные антитела: Ki-67 (1:600) и Каспазу-3 (1:100). Инкубируйте секции в течение ночи при температуре 4 °C. Промойте буфером PBS), затем нанесите вторичное антитело общего назначения (1:500) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
4. Развивайте цветовую реакцию, добавляя раствор DAB. Срезы закрасьте раствором гематоксилина.
5. Проведите обезвоживание, очистку и герметизацию испачканных участков. Наблюдайте за экспрессией белков под оптическим микроскопом и получайте изображения для анализа.

7. Вестерн-блоттинг

1. Гомогенизируйте опухолевую ткань с помощью тканевого лизера. Извлеките общий белок и определите его концентрацию с помощью набора для анализа бицинхониловой кислоты (BCA) (см. Таблицу материалов).
2. Выполните количественное определение белка с последующим электрофорезом SDS-PAGE и переносом белка на мембрану.
3. Инкубировать мембрану в течение ночи при 4 °C с первичными антителами: P38 (1:2000), p-P38 (1:1000), ERK (1:20000), p-ERK (1:500), JNK (1:2000), p-JNK (1:5000), β-актином (1:200) (см. Таблицу материалов).
4. На следующий день инкубируйте мембрану с конъюгированным вторичным антителом к пероксидазе хрена (HRP) при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Обнаружение белковых полос с помощью системы усиленной хемилюминесценции (ECL).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность белковой полосы была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ.

Порошковый раствор XY и образцы сыворотки из контрольной группы и группы XY были проанализированы с помощью UHPLC-QE-MS, выявив хорошо разделенные пики. Диаграммы суммарной ионизации для мод положительных и отрицательных ионов показаны на рису?...

Заболеваемость раком ежегодно растет, привлекая значительный клинический и исследовательский интерес^22,23. Недавние исследования продемонстрировали эффективность традиционной китайской медицины (ТКМ) в лечении рака легких 24,25,26.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана пунктом (YDZJ202301ZYTS459) Плана развития науки и технологий провинции Цзилинь.