Construction d’un modèle de xénogreffe d’adénocarcinome pulmonaire chez la souris et évaluation de l’efficacité de la décoction XY par la voie MAPK

Cette étude démontre que la décoction XY exerce des effets thérapeutiques contre l’adénocarcinome pulmonaire en régulant la voie MAPK.

L’adénocarcinome pulmonaire augmente dans le monde entier, ce qui incite à l’exploration et au développement de méthodes de traitement efficaces. Ces dernières années, le potentiel thérapeutique de la médecine traditionnelle chinoise pour l’adénocarcinome pulmonaire, comme la décoction XiaoYi (XY), a été de plus en plus reconnu. Le mécanisme d’action de la médecine traditionnelle chinoise dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire continue d’être élucidé. Dans cette étude, des modèles animaux ont été utilisés pour étudier les effets thérapeutiques de la décoction XY dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire. Les composants chimiques d’entrée dans le sang de la décoction XY chez la souris ont été séparés et analysés en modes d’ions positifs et négatifs à l’aide de l’UHPLC-QE-MS. Les résultats ont ensuite été validés par des expériences in vivo , qui ont démontré une réduction de la taille de la tumeur, une amélioration des changements pathologiques et une augmentation de l’apoptose. En conséquence, quinze composants absorbés dans le sang après l’administration de décoction XY ont été identifiés : Stachyose, Quercétine-3-O-bêta-glucopyranosyl-7-O-alpha-rhamnopyranoside ; Imperialine ; Spinosine B ; Peimine ; Flavone base + 3O, 2MeO, O-Hex; Picropodophyllotoxine ; (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-2 [[(3S,5R,8R,10R,12R,13R,14R,17S)-12-hydroxy-17-(2-hydroxy-6-méthylhept-5-en-2-yl) 4,4,8,10,14-pentaméthyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodécahydro-1H cyclopenta[a]phénanthrène-3-yl]oxy]-6-(hydroxyméthyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxyméthyl)oxane-3,4,5-triol ; Tricine ; Ginsénoside Rg1 ; (20R)-ginsénoside Rh1 ; Jujuboside B ; Aucubin ; Ginsénoside Rg3 ; et l’acide bêta-élemonique. Des expériences sur des animaux ont démontré que la décoction XY inhibait la croissance tumorale, améliorait les changements pathologiques et favorisait l’apoptose des cellules tumorales de manière dose-dépendante. Les mécanismes impliqués peuvent être liés à la régulation à la hausse de l’expression des protéines p-JNK et p-P38 dans la voie MAPK et à la régulation négative de l’expression de la protéine p-ERK dans la voie MAPK. En conclusion, la décoction XY a le potentiel de réguler la voie MAPK et d’exercer des effets thérapeutiques contre l’adénocarcinome pulmonaire.

L’incidence du cancer du poumon augmente dans le monde entier. Il représente 18 % de toutes les tumeurs malignes et est responsable d’un nombre important de décès liés au^cancer1,2. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est une forme prévalente de cancer du poumon, l’adénocarcinome étant la principale pathologie de type³. En raison de ses symptômes insidieux, le CPNPC est souvent diagnostiqué à un stade avancé et présente un taux de mortalité élevé ^4,5. Les patients atteints d’un CPNPC de stade IV ont un taux de survie à cinq ans de seulement 5 %⁶, tandis que les patients atteints d’un CPNPC à un stade précoce, même résécable chirurgicalement, ont un taux de survie à cinq ans de seulement 50 %⁷.

Actuellement, le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire comprend la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie, l’immunothérapie et la thérapie ciblée. De plus, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) pour l’adénocarcinome pulmonaire est de plus en plus reconnue et valorisée⁸. La MTC a une longue histoire et a été utilisée dans le traitement de diverses maladies oncologiques avec des résultats thérapeutiques efficaces ^9,10. Il considère le corps humain comme une entité entière, le principe thérapeutique étant axé sur la restauration du mouvement du Qi (le Qi fait référence à l’énergie vitale qui favorise la circulation du sang et des fluides corporels, contribuant à renforcer l’immunité et à réduire l’inflammation chez les patients atteints de CPNPC) dans les organes internes pour rétablir l’équilibre général et inhiber la progression du cancer.

La MTC traite non seulement les maladies oncologiques à faible toxicité, à cibles multiples et à haute efficacité¹¹, mais elle facilite également la réparation des dommages causés par la radiothérapie et la chimiothérapie, prolongeant ainsi la survie¹².

La technologie de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) intègre la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse pour réaliser la séparation et la détection de composants dans des mélanges de composés complexes¹³. La LC-MS offre une haute résolution, une sensibilité élevée et une spécificité élevée, permettant la séparation et l’identification de divers composants chimiques dans les décoctions de médecine traditionnelle chinoise (MTC). Lorsqu’elle est associée à la chimie médicinale sérique, qui sépare et détecte les composants actifs de l’entrée dans le sang après l’administration orale^14,15, la LC-MS permet de prédire et d’analyser les mécanismes d’action potentiels des médicaments. Cette approche aide à comprendre la composition chimique et les composants pharmacologiques des décoctions de MTC, fournissant des données essentielles pour des recherches approfondies sur leurs effets pharmacologiques et leurs applications cliniques, ce qui la rend très applicable dans la recherche en MTC^16,17.

La voie de signalisation MAPK joue un rôle crucial dans la genèse, la progression, les métastases et l’invasion du cancer du poumon, avec Erk, p38 et JNK comme sous-familles importantes. Il a été démontré que les décoctions de la MTC influencent l’expression des protéines dans la voie MAPK¹⁸. La décoction XiaoYi (XY) est dérivée de la décoction de YiGuan et est utilisée pour traiter l’adénocarcinome pulmonaire au premier hôpital affilié de l’Université de médecine chinoise de Changchun (Figure 1), démontrant une efficacité clinique précise. Cependant, son mécanisme thérapeutique reste incertain.

Dans cette étude, la chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse Q-Exactive Orbitrap (UHPLC-QE-MS) a été utilisée pour élucider le mécanisme thérapeutique possible de la décoction XY contre l’adénocarcinome pulmonaire, et ses effets ont été validés par des études in vivo .

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Changchun (éthique n° 2024008). Des souris mâles C57BL/6 âgées de six semaines (20 ± 2 g), élevées dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS), présentaient des schémas d’activité physique typiques dans un environnement contrôlé avec une température et une humidité constantes. Ils avaient un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et étaient maintenus sous un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Des détails sur les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont fournis dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’extrait aqueux de décoction XY

1. Dans un pot de décoction, placez le Panax ginseng C.A. Mey (Renshen, 15 g), le Chinemys reevesii (Gray) (Guiban, 30 g) et le Trionyx sinensis Wiegmann (Biejia, 30 g). Ajouter 1000 mL d’eau déminéralisée et laisser tremper 30 min à température ambiante.
2. Faites bouillir les trois herbes de l’étape 1.1 pendant 1 h. Simultanément, tremper Rehmannia glutinosa Libosch (Dihuang, 30 g), Trichosanthes kirilowii Maxim. (Tianhuafen, 30 g), Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Romain.) Stapf (Yiyiren, 20 g), Paeonia lactiflora Pall. (Baishao, 30 g), Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang, 7 g), Commiphora myrrha Engl. (Moyao, 7 g), Agrimonia pilosa Ledeb. (Xianhecao, 20 g), Alpinia oxyphylla Miq. (Yizhiren, 20 g), Moulin à Ziziphus jujuba . var. spinosa (Bunge) (Suanzaoren, 30 g), Melia toosendan Sieb. et Zucc. (Chuanlianzi, 5 g), Fritillaria thunbergii Miq. (Zhebeimu, 15 g), Anemarrhena asphodeloides Bge. (Zhimu, 10 g), Platycodon grandiflorum (Jacq.) (Jiegeng, 10 g), Polygala tenuifolia Willd. (Yuanzhi, 15 g), et Phragmites communis Trin. (Lugen, 30 g) dans un autre récipient pendant 30 min. Après le trempage, transférez-les dans le pot de décoction à partir de l’étape 1.1.
3. Faites bouillir les 18 herbes des étapes 1.1 et 1.2 pendant 30 min. Versez le liquide à base de plantes, ajoutez 1000 ml d’eau déminéralisée et faites bouillir pendant encore 30 minutes. Répétez ce processus d’ébullition trois fois pour obtenir trois portions de liquide à base de plantes, puis mélangez-les et mélangez-les soigneusement.
4. Filtrez le liquide à base de plantes mélangé à travers un chiffon à mailles 400. Concentrez le filtrat sous pression réduite, puis transférez le liquide concentré à base de plantes dans un équipement de refroidissement pour un traitement ultérieur.
5. Versez le liquide concentré à base de plantes dans un plateau de lyophilisation et placez-le dans la chambre de pré-congélation d’un lyophilisateur sous vide. Une fois la précongélation terminée, transférez le plateau dans la chambre de séchage par sublimation pour éliminer l’eau.
6. Éliminez toute humidité résiduelle à haute température. Pulvérisez l’extrait de plantes lyophilisé à l’aide d’un pulvérisateur pour obtenir une fine poudre de décoction XY lyophilisée (Figure 2).

2. Préparation de sérum contenant du médicament

1. Répartissez au hasard des souris mâles C57BL/6 âgées de six semaines (20 ± 2 g) dans le groupe XiaoYi (XY) ou dans le groupe témoin.
   REMARQUE : La dose chez la souris a été calculée à l’aide du facteur de conversion humain-souris :
   Dose expérimentale équivalente pour les souris (g/kg) = {Dose humaine (g/kg) / Poids corporel (70 kg)} x 9,1
   Sur la base de ce calcul, la posologie pour les souris a été déterminée à 2,6 g/kg.
2. Peser 0,9152 g de poudre de décoction XY lyophilisée et la dissoudre dans 3,2 mL d’eau distillée pour préparer la solution médicamenteuse.
   REMARQUE : Les souris ont été à jeun pendant 12 h avant l’administration orale.
3. Administrer la décoction XY aux souris du groupe XY par gavage, tout en administrant au groupe témoin un volume équivalent d’eau déminéralisée.
4. 2 h après l’administration orale, anesthésier les souris avec du pentobarbital sodique (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Énucléez les globes oculaires à l’aide d’une pince à épiler pour prélever des échantillons de sang, puis euthanasiez les souris par asphyxie au CO₂ suivie d’une luxation cervicale conformément aux directives éthiques¹⁹.
5. Laisser les échantillons de sang se stabiliser à température ambiante pendant 90 min. Centrifuger à 3450 x g (4 °C) pendant 15 min pour recueillir le surnageant.

3. Analyse UHPLC-QE-MS

1. Ajouter 100 mg de poudre lyophilisée par décoction XY à 500 μL de solution d’extraction (méthanol : eau = 4:1). Mélangez soigneusement, sonicez et incubez dans un bain d’eau glacée pendant 1 h.
2. Maintenir le mélange à -40 °C pendant 1 h, puis centrifuger à 13 800 x g (4 °C) pendant 15 min. Filtrez le surnageant à travers une membrane filtrante de 0,22 μm, puis combinez 100 μL de chaque surnageant pour créer des échantillons de contrôle de la qualité (CQ).
3. Après la décongélation des échantillons de plasma, prélever 400 μL de l’échantillon de plasma du groupe témoin et 400 μL des échantillons de plasma du groupe XY. Ajouter 40 μL d’acide chlorhydrique (2 mol/L) à chaque échantillon. Agitez pendant 1 min et laissez reposer le mélange à 4 °C pendant 15 min. Répétez cette étape quatre fois.
4. Ajouter 1,6 mL d’acétonitrile et agiter pendant 5 min. Centrifugeuse à 13 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Soumettre 1 800 μL du surnageant à l’assèchement à l’azote.
5. Reconstituer les échantillons séchés dans 150 μL de méthanol à 80 % contenant 10 μg/mL de l’étalon interne par vortex pendant 5 min. Centrifuger à 13 800 × g pendant 5 min à 4 °C, puis transférer 120 μL du surnageant dans un flacon en verre frais pour l’analyse LC-MS (figure 3).

4. Culture cellulaire et préparation des animaux

1. Semez 1 mL de cellules de carcinome pulmonaire de Lewis dans une boîte de culture contenant du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules dans des conditions contrôlées à 37 °C avec 5 % de CO₂.
2. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, faites-les passer en utilisant 0,25 % de trypsine. Continuez à passer jusqu’à ce que l’état cellulaire se stabilise, puis ajustez la concentration cellulaire à 3 x 10⁶ cellules/mL.
3. Injecter 0,1 mL de la suspension cellulaire préparée par voie sous-cutanée dans l’aisselle droite de souris mâles C57BL/6 pour établir le modèle d’adénocarcinome pulmonaire.
   REMARQUE : Le tissu tumoral peut être palpé à l’aisselle des souris 5 jours après l’inoculation.
4. Après 5 jours, divisez au hasard les souris en cinq groupes (n = 6 par groupe) : Groupe modèle (M) - Aucun traitement ; décoction XY groupe à faible dose (XY-L) - 1,3 g/kg ; décoction XY groupe à dose moyenne (XY-Z) - 2,6 g/kg ; décoction XY groupe à forte dose (XY-H) - 5,2 g/kg ; Groupe cisplatine (DDP) - Traité avec du cisplatine²⁰.
5. Dissoudre la poudre de décoction XY dans 200 μL d’eau distillée à la dose correspondante et l’administrer par gavage. Les groupes M et DDP reçoivent un volume égal d’eau distillée par gavage.
6. Administrer du cisplatine au groupe DDP par injection intrapéritonéale (3 mg/kg) une fois tous les 3 jours. Injectez le même volume de solution saline physiologique dans les autres groupes.

5. Analyse pathologique du tissu tumoral

1. Après 21 jours, euthanasiez toutes les souris en utilisant l’asphyxie au CO₂ suivie d’une luxation cervicale (conformément aux directives éthiques) et excisez le tissu tumoral²¹. Mesurez le volume et le poids de la tumeur (Figure 4).
2. Fixer les tissus tumoraux excisés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h). Déshydratez le tissu à l’aide de solutions d’éthanol graduées.
3. Éliminez les blocs de tissus déshydratés à l’aide de xylène, puis incorporez-les dans de la cire de paraffine fondue. Laissez la cire se solidifier en un bloc de paraffine. Coupez le bloc de tissu en tranches de 5 m d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
4. Déparaffiné les sections de tissu dans du xylène, suivi d’une réhydratation dans des solutions d’éthanol graduées. Teindre les sections avec de l’hématoxyline pendant 5 min, puis rincer à l’eau déminéralisée.
5. Contre-colorez les sections avec une solution d’éosine à 0,5 % pendant 1 min. Observez les sections colorées au microscope optique et capturez des images pour analyse.

6. Analyse immunohistochimique du tissu tumoral

1. Effectuez le déparaffinage et la réhydratation en suivant les procédures décrites aux étapes 5.2 à 5.4.
2. Incuber les sections dans un bloqueur endogène de la peroxydase à température ambiante pendant 15 min. Bloquez la liaison non spécifique en incubant les sections avec du sérum de chèvre.
3. Appliquez les anticorps primaires : Ki-67 (1:600) et Caspase-3 (1:100). Incuber les sections pendant la nuit à 4 °C. Laver avec un tampon PBS), puis appliquer un anticorps secondaire à usage général (1:500) et incuber à 37 °C pendant 30 min.
4. Développez la réaction de couleur en ajoutant une solution DAB. Contre-colorez les sections avec une solution d’hématoxyline.
5. Effectuez la déshydratation, le nettoyage et le scellement des sections tachées. Observez l’expression des protéines au microscope optique et capturez des images pour analyse.

7. Analyse par transfert Western

1. Homogénéiser les tissus tumoraux à l’aide d’un lyseur de tissus. Extrayez la protéine totale et déterminez sa concentration à l’aide d’un kit de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) (voir le tableau des matériaux).
2. Effectuer une quantification des protéines, suivie d’une électrophorèse SDS-PAGE et d’un transfert de protéines sur une membrane.
3. Incuber la membrane pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires : P38 (1:2000), p-P38 (1:1000), ERK (1:20000), p-ERK (1:500), JNK (1:2000), p-JNK (1:5000), β-actine (1:200) (voir tableau des matériaux).
4. Le lendemain, incubez la membrane avec l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) à température ambiante pendant 1,5 h. Détectez les bandes de protéines à l’aide d’un système de chimiluminescence améliorée (ECL).
   REMARQUE : Les intensités des bandes protéiques ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ.

Des échantillons de solution de poudre XY et de sérum du groupe témoin et du groupe XY ont été analysés à l’aide de l’UHPLC-QE-MS, révélant des pics bien séparés. Les diagrammes d’ionisation totale pour les modes d’ions positifs et négatifs sont illustrés à la figure 3. La composition de la décoction XY a été déterminée sur la base du temps de rétention, du mode d’acquisition et des fragments de ...

L’incidence du cancer augmente chaque année, suscitant un intérêt clinique et de recherche important^22,23. Des études récentes ont démontré l’efficacité de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans le traitement du cancer du poumon 24,25,26. Par exemple, il a été démontré que la décoction de Maimendong augmente le ...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été soutenu par le point (YDZJ202301ZYTS459) du plan de développement scientifique et technologique de la province de Jilin.