Pankreatik Duktal Hücre Hattında pH Değişiklikleri ile Onkogen Ekspresyon Analizi

Bu çalışma, bir pankreas duktal hücre hattının RNA-seq analizi yoluyla değiştirilmiş pH'ın onkogen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için bir protokolü açıklamaktadır.

Kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedeni olan pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC), beş yıllık sağkalım oranı %12'dir. Bu hastalık kötü bir prognoza sahiptir ve tedavisinde somut bir zorluk teşkil eden sert bir stromal mikroçevre ile karakterizedir. Kronik pankreatit hastalarının PDAC geliştirme riski 10 kat daha fazladır; bu hastalarda bikarbonat yetmezliği ve inflamatuar ortam nedeniyle duktal pH pH pH 8.0'dan pH 6.0'a düşer. Amacımız, kronik pankreatitte gözlenen asidik ortamın pankreas duktal hücre hattındaki onkogen ekspresyonu üzerindeki rolünü anlamaktı.

Bu nedenle,% 80 birleşik insan pankreas duktal epitel hücreleri, 6 saat boyunca pH 6.0 ila pH 7.2'de inkübe edildi. Hücrelerden alınan toplam RNA, örneklerdeki toplam mRNA'yı zenginleştirmek için işlendi. Gen ekspresyonu, biyolojik replikaların yeni nesil dizilemesi (NGS) yoluyla değerlendirildi. RNA-seq analizi, çevrimiçi bir araç yardımıyla gerçekleştirildi ve diferansiyel olarak ifade edilen genler (FC'ler < ± 2.0) tanımlandı; pH 6.0, 6.5 ve 7.0'da sırasıyla 90, 148 ve 109 yukarı regüle edilmiş gen ve 20, 14 ve 23 aşağı regüle edilmiş gen vardı. Dört onkogen pH 6.0'da yukarı regüle edildi, yedisi pH 6.5'te yukarı regüle edildi ve yedisi pH 7.0'da yukarı regüle edildi. pH 6.0, pH 6.5 ve pH 7.0'da yukarı regüle edilen ortak genler, lenfosit hücresine özgü protein-tirozin kinaz (LCK) [pH 6.0, FC: 2.93; pH 6.5, FC: 2.93; pH 7.0, FC: 3.32], FGR proto-onkogen, Src ailesi tirozin kinaz (FGR) [pH 6.0, FC: 4.17; pH 6.5, FC: 5.25; pH 7.0, FC: 5.09] ve SH3 alanı ile ArfGAP, ankirin tekrarı ve PH alanı 3 (ASAP3) [pH 6.0, FC: 2.37; pH 6.5, FC: 3.84; pH 7.0, FC: 2.51]. Asidik ortam, kronik pankreatitte tümör başlangıcını tetikleyebilen proto-onkogenlerin aktivasyonunu tetikler.

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) primekanserlerden biridir ve ilişkili ölüm sayısı açısından kanserler arasında dördüncü sırada yer almaktadır¹. PDAC hastaları arasında daha yüksek bir mortalite oranı belirgindir ve son çalışmalara göre, beş yıllık sağkalım oranı sadece% 12'dir. Pankreas^2'nin iltihaplanmasıyla sonuçlanan bir hastalık olan belgelenmiş kronik pankreatitli hastaların PDAC³ geliştirme olasılığı daha yüksektir (yaklaşık 15-16 kat). Alkolle ilişkili, kalıtsal ve idiyopatik SP⁴ gibi farklı etiyolojilere sahip çeşitli SP türleri vardır. SP sırasında var olan durumların kalsifiye taş oluşumuna, kanser hücresi gelişimine ve hatta şeker hastalığına yol açtığı bilinmektedir. Kalıtsal kronik pankreatitli hastalarda PDAC prevalansı yüksektir⁵.

SP hastalarının pankreasındaki bazı fizyolojik durumlar, diğer rahatsızlıkların başlaması için faydalı olabilir; bunlar arasında enflamatuar ortam, aktif sindirim enzimleri ve pankreas suyunun^asidik pH'ı 6 bulunur. Enflamasyon organın normal işleyişinde kaos yarattığından, inflamasyon alanında çok çeşitli çalışmalar yürütülmektedir ^7,8,9. Bununla birlikte, pH regülasyonundaki bir dengesizlik, hücrelerin¹⁰ kontrolsüz büyümesinin başlamasını tetikleyebilecek başka bir fenomendir. Sağlıklı bireylerin pankreas suyu alkalidir, bu da mide tarafından üretilen asidik kekiği nötralize etmeye yardımcı olur. Buna karşılık, pankreas suyu, yetersiz bikarbonat sekresyonu nedeniyle SP hastalarında asidik kalır. Düşük bikarbonat seviyeleri suyu tamamen nötralize edemez, bu da kanal¹¹ içinde hafif asidik bir ortama neden olur.

Daha önceki çalışmalar, kanser hücrelerinin asidik ortamlara adapte olduğunu ve geliştiğini göstermektedir¹². Bu gibi durumlarda, kronik pankreatit sürecinde var olan koşullar, bu hücrelerin çoğalması ve metastazı için elverişli bir ortam olduğunu göstermektedir¹³. Bu nedenle, çalışmamızda insan pankreatik duktal hücrelerindeki morfolojik değişiklikleri değerlendirmeyi ve hafif asidik koşullar altında onkogen ekspresyonunu değerlendirmeyi amaçladık.

1. Hücre hattının canlanması

1. İnsan normal pankreas duktal hücre hattını (HPDEC / H6C7) temin edin ve hücreleri taze ortamda canlandırın.
   1. Hücreleri 37 °C'de bir su banyosunda çözdürün.
   2. Taze olarak tam ortamı hazırlayın ve bir şırınga filtresi kullanarak süzün.
      NOT: Komple besiyeri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerini (DMEM) içerir.
   3. 15 mL'lik taze bir konik tüpe 6 mL tam ortam ekleyin, çözülmüş hücre süspansiyonunu ekleyin ve iyice karıştırın.
   4. Süspansiyonu 1.800 × g'da 6 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, pelete 1 mL kültür ortamı ekleyin ve hafifçe karıştırın.
      NOT: Kültür ortamı, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 pen/strep antibiyotik içeren DMEM içerir.
   5. Hücreleri damla damla 4 mL kültür ortamı içeren bir T-25 şişesine ekleyin ve 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.

2. Kültür ortamının pH'ının değiştirilmesi

1. Tablo 1'de belirtildiği gibi pH değerleri 6.0, 6.5 ve 7.0 olan 100 mL 0.5 M sodyum fosfat tampon stok çözeltileri hazırlayın.
2. pH'ı bir pH metre ile kontrol edin ve 1 N HCl/1 M NaOH kullanarak ayarlayın.
3. Tamponları, 0,45 μm şırınga filtresi ile laminer hava akış başlığında filtre ile sterilize edin.
   NOT: Tampon, daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir.
4. 6.0, 6.5 ve 7.0 pH değerlerine sahip kültür ortamını, ilgili pH ile 20 mL steril 0.5 M sodyum fosfat tamponu ile 80 mL kültür ortamı hazırlayın.
5. Değiştirilmiş pH'lı ortamı% 85-90 birleşen insan pankreas duktal hücrelerine ekleyin ve 6 saat boyunca 1 saat aralıklarla parlak alan mikroskobu altında morfolojik değişiklikleri kontrol edin.

3. RNA izolasyonu

NOT: Hücrelerden RNA izolasyonu için steril eldiven kullanılmalı ve yüzey %100 etanol kullanılarak dekontamine edilmelidir.

1. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
2. Plakayı buzun üzerine yerleştirin, kuyuya PBS ekleyin ve ardından hücreleri bir hücre kazıyıcı ile kazıyın.
   NOT: Eklenen PBS miktarı, kazıma için hücreleri kaplamak için yeterli olmalıdır. Yüksek hacimli PBS eklemeye gerek yoktur.
3. Süspansiyonu yeni bir tüpte toplayın ve 10 dakika boyunca 8.000 ×g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
4. Pelete β-merkaptoetanol içeren lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 5-10 dakika yukarı ve aşağı pipetleyin.
5. Lizata eşit hacimde% 70 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. Girdap yapmayın.
6. Çözeltiyi silika membran kolonuna ekleyin, 30 saniye boyunca >8.000 ×g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
7. Numuneye yıkama tamponu ekleyin ve 30 saniye boyunca >8.000 ×g'da santrifüjleyin. Boş tüpü 1 dakika boyunca >8.000 ×g'da santrifüjleyin.
8. Kolona 30-50 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. Kolonu >8,000 ×g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   NOT: RNA örnekleri daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklanabilir.

4. RNA-dizisi / Transkriptom

1. RNA bütünlük değerlendirmesi
   1. 1 μL (25-500 ng) alarak ve 5 μL boya tamponu ile karıştırarak bir biyoanalizörde RNA'nın bütünlüğünü kontrol edin.
   2. Çözeltiyi 500 × g'da 1 dakika vorteksleyin ve kısa bir süre döndürün.
   3. Her numune için 72 ° C'de 3 dakika boyunca tek adımlı bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) çalıştırın ve ardından tüpleri alın ve bir biyoanalizör ile analiz etmeden önce 2 dakika buz üzerinde inkübe edin.
2. rRNA'sı tükenmiş toplam RNA
   1. Yeni bir PCR tüpüne 5 μg toplam RNA, 50 μL hibridizasyon tamponu ve 1-3 μL prob karışımı ekleyin.
   2. Aşağıdaki adımları gerçekleştirin: ilk adım, 70 ° C'de 10 dakika boyunca denatürasyon; ikinci adım, 20 dakika boyunca 37 ° C'de hibridizasyon; ve kullanıma kadar 37 ° C'de inkübasyon.
   3. Yeni bir tüpe 500 μL manyetik boncuk ve numune ekleyin; Karışımı, çözelti berraklaşana kadar 1 dakika manyetik bir stand üzerine yerleştirin.
   4. Süpernatanı dikkatlice atın. Tüpü çıkarın, 500 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek boncukları yıkayın ve karışımı 1 dakika boyunca manyetik standa geri koyun. Çözelti berraklaştığında süpernatanı çıkarın.
   5. İşlemi 5-7 kez tekrarlayın. 200 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve uygun şekilde karıştırın. Tüpleri 37 °C'de 5 dakika tutun.
   6. Yukarıdaki karışıma 100 μL RNA probu ekleyin, hafifçe karıştırın ve karışımı 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
   7. Tüpü manyetik standa yerleştirmeden önce 1 dakika boyunca kısaca döndürün.
   8. rRNA'sı tükenmiş RNA'yı içeren berrak süpernatanı taze bir tüpte toplayın.
3. RNA parçalanması
   1. Taze bir PCR tüpüne 8-10 μL rRNA'sı tükenmiş toplam RNA (500 ng/g), 1 μL 10x tampon ve 1 μL RNase III ekleyin.
   2. Çözeltiyi kısaca dokunarak ve döndürerek karıştırın.
   3. Tüpleri 37 °C'de 10 dakika boyunca bir termal döngüleyiciye yerleştirin.
   4. Taze bir tüpe 5 μL nükleik asit bağlayıcı boncuk ekleyin ve ardından 90 μL bağlayıcı çözelti konsantresi ekleyin.
   5. Yukarıdaki karışıma 30 μL RNA fragmanı ve 150 μL %100 etanol ekleyin. Numuneyi 10x pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   6. Çözelti berraklaşana kadar tüpleri manyetik standın üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve atın.
   7. Tüpler manyetik bir stand üzerindeyken boncukları 150 μL etanol ile yıkayın; Karışımı 30 saniye bekletin ve ardından süpernatanı çıkarın.
   8. Kalan etanolün buharlaşmasını sağlamak için tüpleri 1-2 dakika manyetik bir stand üzerinde bırakın.
   9. Boncuklara 12 μL önceden ısıtılmış nükleaz içermeyen su ekleyin ve numuneyi 10 kez pipetleyerek karıştırın.
   10. Numuneyi oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin. Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve temizlendikten sonra süpernatanı toplayın.
4. Kütüphane hazırlığı ve cDNA hazırlığı
   1. Parçalanmış RNA örneğinden 3 μL'yi bir PCR tüpüne ekleyin ve ardından 5 μL hibridizasyon karışımı ekleyin. Numuneyi birkaç kez pipetleyerek karıştırın ve ardından numuneyi kısa bir süre döndürün.
   2. Tüpleri 65 °C'de 10 dakika, ardından 30 °C'de 5 dakika termal döngüleyicide tutun.
   3. Yukarıdaki çözeltiye 10 μL ligasyon tamponu ve 2 μL ligasyon enzim karışımı ekleyin. Reaksiyonu 30 ° C'de 1 saat boyunca bir termal döngüleyicide inkübe edin.
   4. Ligasyon karışımına ters transkriptaz ana karışımını ekleyin ve 70 ° C'de 10 dakika inkübe edin, ardından buz üzerinde inkübe edin.
5. cDNA'nın amplifikasyonu
   1. Taze bir PCR tüpüne 6 μL cDNA (500 ng) ekleyin ve ardından 46 μL yüksek kaliteli polimeraz enzimi ve 1 μL 3' barkod primerleri içeren bir tüpten 46 μL barkodlu PCR karışımı ekleyin.
   2. PCR koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: ilk aşama, 94 °C'de 2 dakika tutun; ikinci aşama, 94 °C'de 30 sn ve 50 °C'de 30 sn döngü; üçüncü aşama, 30 saniye boyunca 94 °C'de, 30 saniye boyunca 62 °C'de ve 30 saniye boyunca 68 °C'de 16 döngü. Reaksiyonu 68 °C'de 5 dakika tutun.
   3. 4.3.5 ila 4.3.10 arasındaki adımları tekrarlayarak amplifiye edilmiş cDNA'yı saflaştırın ve parçalanmış RNA örneğini önceki adımda elde edilen PCR ürünü ile değiştirin.
   4. FASTq dosyaları biçiminde veri oluşturmak için saflaştırılmış RNA örneğini bir sıralayıcı (NGS) üzerinde analiz edin.

5. Biyoinformatik

1. Bağlantıyı kopyalayıp yapıştırarak çevrimiçi olarak kullanılabilen galaksi aracını açın: https://usegalaxy.org tarayıcının arama sekmesine girin.
2. Bu siteye ilk ziyaretinizde, sağ üst köşedeki oturum açma veya kayıt olma seçeneğine tıklayarak bir profil için kaydolun.
3. Bir hesap oluşturduktan sonra, genel adı/kullanıcı adını ve şifreyi doldurarak hesaba giriş yapın.
4. RNA-seq analizinden sonra elde edilen FASTq dosyalarını sol taraftaki panelde bulunan yükleme seçeneğine tıklayarak yükleyin.
5. Sol yan panelde bulunan araçlar bölümünden cutadapt aracını seçin. Bu araç, düşük kaliteli dizileri kırpacaktır.
   NOT: Bu dosya artık eşleme için kullanılabilir.
6. Sol taraftaki paneldeki araç düğmesine tıklayın ve RNA yıldız aracını arayın. Ayrıntıları aşağıdaki gibi doldurun: cutadapt'ın çıktı dosyasını kullanın, referans genomu insan referans genomu (hg38) olarak seçin ve açıklamalı bağlantılar etrafındaki genomik dizinin uzunluğunu 36 olarak değiştirin. Çıktıyı gen sayısı olarak seçin ve sağ üst köşedeki aracı çalıştır seçeneğine tıklayın.
   NOT: Bu araç bir BAM dosyası oluşturacaktır.
7. Araç seçeneklerinden featurecounts aracını seçin ve RNA yıldız analizinden elde edilen BAM dosyalarını yükleyin. Okuma filtreleme seçeneklerinde okuma başına minimum eşleme kalitesi seçeneğini 10 olarak ayarlayın ve sağ üst köşede bulunan aracı çalıştır seçeneğine tıklayın.
8. Sağ panelden featurecount çıktı dosyasını açın ve verileri bir elektronik tabloya kopyalayın. Testte elde edilen okuma sayılarının sayısını, =log komutuyla kontrolde elde edilen okuma sayılarının sayısına bölerek kontrole göre kat değişimini hesaplayın (kat değişikliği, 2).
   NOT: <-2.0'lık bir katlama değişikliği aşağı regülasyonu ve 2.0> bir katlama değişikliği yukarı regülasyonu olarak kabul edilir.

Morfolojik değişiklikler
İnsan pankreas duktal hücrelerinin asidik bir ortamda inkübasyonu, hücrelerin morfolojisini değiştirdi. Birleşen ve sıkıca paketlenmiş bir hücre modeli, asidik koşullar altında dağılmış hücrelerle sonuçlandı ve hücre ölümü zamanla belirgin hale geldi. Normal ortam içeren hücrelerle karşılaştırıldığında, duktal hücreler küçüldü ve boyut olarak küçüldü. 6 saatlik inkübasyondan sonra ölüm oranında ...

Bu yöntem, asidik koşulların biyolojik tekrarlarda kanserli olmayan insan pankreas duktal epitel hücreleri üzerindeki etkilerini belirlemek için geliştirilmiştir. Ortamın pH'ındaki bir değişiklik, hücrelerin stresli bir durumda olmasına neden oldu ve morfolojide bir değişiklik gözlendi. Hücreler 24 saat boyunca pH 6.0, 6.5 veya 7.0'da kültürlendi ve daha sonraki deneyler için inkübasyon süresini optimize etmek için her saat izlendi. 4 saatlik inkübasyondan sonra ...

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Renuka Goudshelwar, kendisine burs sağladığı için DBT'ye minnettar. Renuka Goudshelwar, Osmania Üniversitesi (Haydarabad) Biyokimya Bölümü'nden ve NGS verilerini analiz ederken rehberliği için Dr. V. V. Ravikanth'tan aldığı yardımı kabul eder. Dr. M. Sasikala, Hindistan Hükümeti Sağlık Bakanlığı ICMR'den alınan mali yardımı kabul eder (Hibe no-94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS).