Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الدراسة بروتوكولا لاستكشاف تأثيرات الأس الهيدروجيني المتغير على تعبير الجينات المسرطنة عن طريق تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي لخط الخلايا القنوية البنكرياسية.

Abstract

السبب الرئيسي الرابع للوفاة المرتبطة بالسرطان ، سرطان البنكرياس الغدي الأقنية (PDAC) ، لديه معدل بقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات بنسبة 12٪. هذا المرض له تشخيص ضعيف ويتميز ببيئة مكروية لحمية صلبة ، والتي تمثل تحديا ملموسا في علاجه. مرضى التهاب البنكرياس المزمن لديهم خطر أكبر بمقدار 10 أضعاف للإصابة ب PDAC. في هؤلاء المرضى ، ينخفض الرقم الهيدروجيني الأقنوي من الرقم الهيدروجيني 8.0 إلى الرقم الهيدروجيني 6.0 بسبب قصور البيكربونات والوسط الالتهابي. كان هدفنا هو فهم دور البيئة الحمضية التي لوحظت في التهاب البنكرياس المزمن على تعبير الجينات المسرطنة في خط خلايا الأقنية البنكرياسية.

لذلك ، تم تحضين 80٪ من الخلايا الظهارية القنوية البشرية عند درجة الحموضة 6.0 إلى الرقم الهيدروجيني 7.2 لمدة 6 ساعات. تمت معالجة إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا لإثراء إجمالي الرنا المرسال في العينات. تم تقييم التعبير الجيني عن طريق تسلسل الجيل التالي (NGS) للتكرارات البيولوجية. تم إجراء تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي بمساعدة أداة عبر الإنترنت ، وتم تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليا (FCs < ± 2.0). كان هناك 90 و 148 و 109 جينا منظما و 20 و 14 و 23 جينا منخفضا عند درجة الحموضة 6.0 و 6.5 و 7.0 على التوالي. تم تنظيم أربعة جينات مسرطنة عند درجة الحموضة 6.0 ، وسبعة تم تنظيمها عند درجة الحموضة 6.5 ، وسبعة تم تنظيمها عند درجة الحموضة 7.0. كانت الجينات الشائعة التي تم تنظيمها عند درجة الحموضة 6.0 ، ودرجة الحموضة 6.5 ، ودرجة الحموضة 7.0 هي بروتين التيروزين كيناز الخاص بالخلايا الليمفاوية (LCK) [الرقم الهيدروجيني 6.0 ، FC: 2.93 ؛ الرقم الهيدروجيني 6.5 ، FC: 2.93 ؛ الرقم الهيدروجيني 7.0 ، FC: 3.32] ، الجين الورمي الأولي FGR ، عائلة التيروزين كيناز (FGR) [الرقم الهيدروجيني 6.0 ، FC: 4.17 ؛ درجة الحموضة 6.5 ، FC: 5.25 ؛ درجة الحموضة 7.0 ، FC: 5.09] ، و ArfGAP مع مجال SH3 ، تكرار أنكيرين ، ومجال الأس الهيدروجيني 3 (ASAP3) [الرقم الهيدروجيني 6.0 ، FC: 2.37 ؛ الرقم الهيدروجيني 6.5 ، FC: 3.84 ؛ الرقم الهيدروجيني 7.0 ، FC: 2.51]. تؤدي البيئة الحمضية إلى تنشيط الجينات الورمية الأولية ، والتي قد تؤدي إلى بدء الورم في التهاب البنكرياس المزمن.

Introduction

السرطان الغدي الأقنية البنكرياس (PDAC) هو أحد أنواع السرطان الأولية ويحتل المرتبة الرابعة بين السرطانات من حيث عدد الوفيات ذات الصلة1. يتضح معدل وفيات أعلى بين مرضى PDAC ، ووفقا للدراسات الحديثة ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات هو 12٪ فقط. المرضى الذين يعانون من التهاب البنكرياس المزمن الموثق ، وهو مرض يؤدي إلى التهاب البنكرياس2 ، هم أكثر عرضة (حوالي 15-16 ضعفا) للإصابة ب PDAC3. هناك أنواع مختلفة من الشلل الدماغي لمسببات مختلفة ، مثل الشلل الدماغي 4 المرتبط بالكحول والوراثي ومسببالسبب. من المعروف أن الظروف الموجودة أثناء الشلل الدماغي تؤدي إلى تكوين حصوات متكلسة وتطور الخلايا السرطانية وحتى مرض السكري. انتشار PDAC مرتفع في المرضى الذين يعانون من التهاب البنكرياس المزمنالوراثي 5.

قد تكون بعض الحالات الفسيولوجية داخل البنكرياس لمرضى الشلل الدماغي مفيدة لبدء أمراض أخرى. وتشمل هذه البيئة الالتهابية والإنزيمات الهضمية النشطة ودرجة الحموضة الحمضية لعصير البنكرياس6. يتم إجراء مجموعة واسعة من الدراسات في مجال الالتهاب ، حيث يخلق الالتهاب فوضى في الأداء الطبيعي للعضو7،8،9. ومع ذلك ، فإن عدم التوازن في تنظيم الأس الهيدروجيني هو ظاهرة أخرى قد تؤدي إلى بدء النمو غير المنضبط للخلايا10. عصير البنكرياس للأفراد الأصحاء قلوي ، مما يساعد على تحييد الكيموس الحمضي الذي تنتجه المعدة. في المقابل ، يظل عصير البنكرياس حمضيا في مرضى الشلل الدماغي بسبب عدم كفاية إفراز البيكربونات. لا يمكن للمستويات المنخفضة من البيكربونات تحييد العصير تماما ، مما ينتج عنه بيئة حمضية قليلا داخل القناة11.

تشير الدراسات السابقة إلى أن الخلايا السرطانية تتكيف وتزدهر في البيئات الحمضية12. في مثل هذه الحالات ، تشير الظروف الموجودة أثناء عملية التهاب البنكرياس المزمن إلى بيئة مواتية لتكاثر هذه الخلايا ورم خبيث13. ومن ثم ، هدفت دراستنا إلى تقييم التغيرات المورفولوجية في خلايا قنية البنكرياس البشرية وتقييم تعبير الجينات المسرطنة في ظل ظروف حمضية قليلا.

Protocol

1. إحياء خط الخلية

  1. قم بشراء خط الخلايا القنوية للبنكرياس الطبيعي للإنسان (HPDEC / H6C7) وإحياء الخلايا في وسط جديد.
    1. قم بإذابة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    2. قم بإعداد وسيط كامل طازجا وقم بتصفيته باستخدام مرشح حقنة.
      ملاحظة: يحتوي الوسط الكامل على وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS).
    3. أضف 6 مل من الوسط الكامل إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل ، وأضف معلق الخلية المذاب ، واخلطه جيدا.
    4. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 1,800 × جم لمدة 6 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، أضف 1 مل من وسط المزرعة إلى الحبيبات ، واخلطها برفق.
      ملاحظة: يحتوي وسط الاستزراع على DMEM مع مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ ومضادات حيوية من القلم / البكتيريا العقدية 1٪.
    5. أضف الخلايا بالتساقط إلى قارورة T-25 تحتوي على 4 مل من وسط الاستزراع واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.

2. تغيير درجة الحموضة في وسط الثقافة

  1. قم بإعداد 100 مل من محاليل مخزون فوسفات الصوديوم العازلة 0.5 M بقيم الأس الهيدروجيني 6.0 و 6.5 و 7.0 كما هو مذكور في الجدول 1.
  2. تحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني واضبطه باستخدام 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك / 1 م هيدروكسيد الصوديوم.
  3. قم بتعقيم المخازن المؤقتة في شفاط تدفق الهواء الرقائقي باستخدام فلتر حقنة 0.45 ميكرومتر.
    ملاحظة: يمكن تخزين المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  4. قم بإعداد وسائط الاستزراع بقيم الأس الهيدروجيني 6.0 و 6.5 و 7.0 عن طريق إضافة 20 مل من محلول فوسفات الصوديوم المعقم 0.5 M مع الرقم الهيدروجيني المعني إلى 80 مل من وسط الاستزراع.
  5. أضف الوسائط ذات الرقم الهيدروجيني المتغير إلى 85-90٪ من خلايا قناة البنكرياس البشرية المتجمعة ، وتحقق من التغيرات المورفولوجية تحت مجهر المجال الساطع على فترات 1 ساعة لمدة 6 ساعات.

3. عزل الحمض النووي الريبي

ملاحظة: يجب استخدام القفازات المعقمة لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا ويجب تطهير السطح باستخدام الإيثانول بنسبة 100٪.

  1. قم بإزالة وسط الاستزراع واشطف الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. ضع اللوحة على الثلج ، وأضف PBS إلى البئر ، ثم اكشط الخلايا باستخدام مكشطة الخلية.
    ملاحظة: يجب أن تكون كمية PBS المضافة كافية لتغطية الخلايا للكشط. ليست هناك حاجة لإضافة حجم كبير من PBS.
  3. اجمع المعلق في أنبوب جديد وقم بجهاز الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  4. أضف المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على β-mercaptoethanol إلى الحبيبات وقم بتثبيتها لأعلى ولأسفل لمدة 5-10 دقائق على الجليد.
  5. أضف حجما متساويا من 70٪ من الإيثانول إلى المحللة واخلطها جيدا. لا تدوام.
  6. أضف المحلول إلى عمود غشاء السيليكا ، وجهاز الطرد المركزي عند >8,000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من التدفق من خلاله.
  7. أضف مخزن الغسيل إلى العينة وجهاز الطرد المركزي عند >8,000 × جم لمدة 30 ثانية. الطرد المركزي الأنبوب الفارغ لمدة 1 دقيقة عند >8,000 × جم.
  8. أضف 30-50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى العمود واتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز الطرد المركزي للعمود عند > 8,000 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يمكن تخزين عينات الحمض النووي الريبي عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

4. الحمض النووي الريبي seq / النسخ

  1. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي
    1. تحقق من سلامة الحمض النووي الريبي في محلل حيوي عن طريق أخذ 1 ميكرولتر (25-500 نانوغرام) وخلطه مع 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصبغة.
    2. دوامة المحلول على وزن 500 × جم لمدة 1 دقيقة ثم تدور لفترة وجيزة.
    3. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من خطوة واحدة لكل عينة عند 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم خذ الأنابيب واحتضانها على الجليد لمدة دقيقتين قبل التحليل باستخدام محلل حيوي.
  2. الحمض النووي الريبي الكلي المستنفد من الحمض النووي الريبي الريبي
    1. أضف 5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي ، و 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين ، و 1-3 ميكرولتر من خليط المسبار إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد.
    2. قم بتنفيذ الخطوات التالية: الخطوة الأولى ، التمسخ عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ الخطوة الثانية ، التهجين عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ؛ والحضانة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. في أنبوب جديد ، أضف 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي والعينة ؛ ضع الخليط على حامل مغناطيسي لمدة 1 دقيقة حتى يصبح المحلول صافيا.
    4. تخلص بعناية من المادة الطافية قم بإزالة الأنبوب ، واغسل الخرزات بإضافة 500 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، ثم ضع الخليط مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بمجرد أن يصبح المحلول واضحا.
    5. كرر العملية 5-7x. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين واخلطه بشكل صحيح. احتفظ بالأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. أضف 100 ميكرولتر من مسبار الحمض النووي الريبي إلى الخليط أعلاه ، واخلطه برفق واحتضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    7. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة قبل وضعه على الحامل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
    8. اجمع المادة الطافية الصافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المستنفد من الحمض النووي الريبي الريبي في أنبوب جديد.
  3. تجزئة الحمض النووي الريبي
    1. في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد ، أضف 8-10 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي المستنفد من الحمض النووي الريبي (500 نانوغرام / جم) ، و 1 ميكرولتر من 10x buffer ، و 1 ميكرولتر من RNase III.
    2. امزج المحلول عن طريق النقر والدوران لفترة وجيزة.
    3. ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. في أنبوب جديد ، أضف 5 ميكرولتر من حبيبات ربط الحمض النووي ثم أضف 90 ميكرولتر من تركيز محلول الربط.
    5. أضف 30 ميكرولتر من شظايا الحمض النووي الريبي و 150 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الخليط أعلاه. امزج العينة عن طريق سحب العينة 10x ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي حتى يصبح المحلول واضحا. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.
    7. اغسل الخرزات ب 150 ميكرولتر من الإيثانول أثناء وجود الأنابيب على حامل مغناطيسي ؛ دع الخليط يقف لمدة 30 ثانية ثم قم بإزالة المادة الطافية.
    8. اترك الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة 1-2 دقيقة للسماح للإيثانول المتبقي بالتبخر.
    9. أضف 12 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز الدافئ مسبقا إلى الخرز، واخلط العينة عن طريق سحب العينة 10 مرات.
    10. احتضان العينة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي واجمع المادة الطافية بمجرد أن تصبح صافية.
  4. إعداد المكتبة وإعداد (كدنا)
    1. أضف 3 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي المجزأ إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ثم أضف 5 ميكرولتر من خليط التهجين. امزج العينة عن طريق سحب العينة عدة مرات ثم قم بتدوير العينة لفترة وجيزة.
    2. احتفظ بالأنابيب في جهاز تدوير حراري لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية ، متبوعة ب 5 دقائق عند 30 درجة مئوية.
    3. أضف 10 ميكرولتر من مخزن الربط المؤقت و 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم الربط إلى المحلول أعلاه. احتضان التفاعل في جهاز تدوير حراري لمدة 1 ساعة عند 30 درجة مئوية.
    4. أضف مزيج النسخ العكسي الرئيسي إلى خليط الربط واحتضانه عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالحضانة على الجليد.
  5. تضخيم (كدنا)
    1. أضف 6 ميكرولتر من (كدنا) (500 نانوغرام) إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد ثم أضف 46 ميكرولتر من مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل المشفر من أنبوب يحتوي على 46 ميكرولتر من إنزيم البوليميراز عالي الدقة و 1 ميكرولتر من بادئات الباركود 3 بوصات.
    2. اضبط شروط PCR على النحو التالي: المرحلة الأولى ، استمر في 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ؛ المرحلة الثانية ، دورات عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ المرحلة الثالثة ، 16 دورة عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 62 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. استمر في التفاعل عند 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. قم بتنقية (كدنا) المضخم بتكرار الخطوات من 4.3.5 إلى 4.3.10 واستبدل عينة الحمض النووي الريبي المجزأة بمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة.
    4. قم بتحليل عينة الحمض النووي الريبي المنقى على جهاز التسلسل (NGS) لإنشاء البيانات في شكل ملفات FASTq.

5. المعلوماتية الحيوية

  1. افتح أداة galaxy المتاحة عبر الإنترنت عن طريق نسخ لصق الرابط: https://usegalaxy.org في علامة تبويب البحث في المتصفح.
  2. في الزيارة الأولى لهذا الموقع ، قم بالتسجيل للحصول على ملف تعريف بالنقر فوق تسجيل الدخول أو خيار التسجيل في الزاوية اليمنى العليا.
  3. بعد إنشاء حساب ، قم بتسجيل الدخول إلى الحساب عن طريق ملء الاسم العام / اسم المستخدم وكلمة المرور.
  4. قم بتحميل ملفات FASTq التي تم الحصول عليها بعد تحليل RNA-seq بالنقر فوق خيار التحميل على اللوحة اليسرى.
  5. حدد أداة cutadapt من قسم الأدوات على اللوحة اليسرى. ستقوم هذه الأداة بقص التسلسلات منخفضة الجودة.
    ملاحظة: يمكن الآن استخدام هذا الملف للتعيين.
  6. انقر فوق زر الأداة في اللوحة الجانبية اليسرى وابحث عن أداة نجمة الحمض النووي الريبي. املأ التفاصيل على النحو التالي: استخدم ملف إخراج cutadapt ، وحدد الجينوم المرجعي كجينوم مرجعي بشري (hg38) ، وقم بتغيير طول التسلسل الجيني حول التقاطعات المشروحة إلى 36. حدد الإخراج كعدد الجينات وانقر فوق خيار أداة التشغيل في الزاوية اليمنى العليا.
    ملاحظة: ستقوم هذه الأداة بإنشاء ملف BAM.
  7. حدد أداة Featurecounts من خيارات الأداة وقم بتحميل ملفات BAM التي تم الحصول عليها بعد تحليل نجم الحمض النووي الريبي. قم بتعيين الحد الأدنى لجودة التعيين لكل خيار قراءة في خيارات تصفية القراءة إلى 10 ، وانقر فوق خيار أداة التشغيل في الزاوية اليمنى العليا.
  8. افتح ملف إخراج Featurecount من اللوحة اليمنى وانسخ البيانات إلى جدول بيانات. احسب تغيير الطية بالنسبة إلى عنصر التحكم بقسمة عدد أعداد القراءة التي تم الحصول عليها في الاختبار مع عدد أعداد القراءة التي تم الحصول عليها في عنصر التحكم باستخدام الأمر = log (تغيير الطي ، 2).
    ملاحظة: يعتبر تغيير الطي <-2.0 للإشارة إلى التنظيم السفلي ويعتبر تغيير الطي > 2.0 تنظيما إضافيا.

النتائج

التغيرات المورفولوجية
أدى حضانة خلايا الأقنية البنكرياس البشرية في وسط حمضي إلى تغيير مورفولوجيا الخلايا. أدى نمط الخلية المتجانسة والمكتظة بإحكام إلى خلايا مشتتة في ظل ظروف حمضية ، ويصبح موت الخلايا بارزا بمرور الوقت. بالمقارنة مع الخلايا الطبيعية المحتوي?...

Discussion

تم تطوير هذه الطريقة لتحديد تأثيرات الظروف الحمضية على الخلايا الظهارية القنوية في البنكرياس البشري غير السرطانية في التكرارات البيولوجية. تسبب التغيير في درجة الحموضة في الوسط في أن تكون الخلايا في حالة توتر ، ولوحظ تغيير في التشكل. تمت زراعة الخلايا عند درجة الحموضة 6...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

رينوكا جودشيلوار ممتنة ل DBT لتزويدها بالزمالة. تعترف رينوكا جودشيلوار بالمساعدة التي تلقاها من قسم الكيمياء الحيوية بجامعة عثمانيا (حيدر أباد) وللدكتور في في رافيكانت لتوجيهاته أثناء تحليل بيانات NGS. يقر الدكتور م. ساسيكالا بالمساعدة المالية التي تلقاها من ICMR ، وزارة الصحة ، حكومة الهند (المنحة رقم 94/2020/5582 / Proteomics-Adhoc / BMS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL graduated centrifuge tubes (Falcon) Tarsons 500031used for sample preparation 
50 mL graduated centrifuge tubes (Falcon)Tarsons 500041used for sample preparation 
Agilent 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentAgilent G2938AInstrment for RNA quality assessment 
Antibiotic Antimycotic Solution 100x liquidHimediaA002-100 mLUsed to prevent contamination 
Cell Scraper with rotatable bladeHimedia TCP223Scraping and collecting the cells
CO2 incubator New BrunswickGalaxy 170 SUsed for incubating the culture 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose HimediaAL007S-500 mLMedium used for culturing the cells
Dulbecco's Phosphate Buffered saline 1xHimediaTL1006-500mLcell washing
Galaxy (https://usegalaxy.org)Online tool for processing NSG Data 
HI FBS (origin: Australia)Gibco10100-147Used for the growth of cells 
Human Pancreatic Ductal Epithelial Cell Line (HPDEC/ H6C7)Addex BioT0018001Pancreatic ductal cell line
Ion Total RNA-Seq Kit v2Thermo fisher scientific4475936RNA sample preparation kit
Laminar Air Flow
Na2HPO4 DiabasicSigma AldrichS3264-250GSodium phosphate buffer preparation 
NaH2PO4 MonobasicSigma AldrichS3139-250GSodium phosphate buffer preparation 
NovaSeq 6000Illumina3376672Sequencer 
Nunclon Delta Surface (6-well plate)Thermo Scientific140675Culturing the cells 
Refrigerated benchtop CentrifugeThermo Scientific Sorvall ST 8RUsed for centrifugation
RiboMinus Eukaryote System v2Thermo fisher scientificA15026rRNA depletion kit 
Rneasy Mini kit Qiagen74104Kit for isolating Total RNA from cells 
Thermal cyclerEppendorfE950040025PCR reaction 
Water Bath Equitron#8406MThawing of sample

References

  1. Franck, C., et al. Advanced pancreatic ductal adenocarcinoma: Moving forward. Cancers (Basel). 12 (7), 1955 (2020).
  2. Kong, X., Sun, T., Kong, F., Du, Y., Li, Z. Chronic pancreatitis and pancreatic cancer. Gastrointest Tumors. 1 (3), 123-134 (2014).
  3. Jura, N., Archer, H., Bar-Sagi, D. Chronic pancreatitis, pancreatic adenocarcinoma and the black box in-between. Cell Res. 15 (1), 72-77 (2005).
  4. Kloppel, G. Chronic pancreatitis, pseudotumors and other tumor-like lesions. Mod Pathol. 20 (Suppl 1), S113-S131 (2007).
  5. Schneider, A., Whitcomb, D. C. Hereditary pancreatitis: a model for inflammatory diseases of the pancreas. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 16 (3), 347-363 (2002).
  6. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  7. Coussens, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
  8. Balkwill, F., Mantovani, A. Inflammation and cancer: back to Virchow. Lancet. 357 (9255), 539-345 (2001).
  9. Clevers, H. At the crossroads of inflammation and cancer. Cell. 118 (6), 671-674 (2004).
  10. Kato, , et al. Acidic extracellular microenvironment and cancer. Cancer Cell Int. 13 (1), 89 (2013).
  11. Hegyi, P., Maléth, J., Venglovecz, V., Rakonczay, Z. Pancreatic ductal bicarbonate secretion: challenge of the acinar acid load. Front Physiol. 2, 36 (2011).
  12. Ibrahim-Hashim, A., Estrella, V. Acidosis and cancer: from mechanism to neutralization. Cancer Metastasis Rev. 38 (1-2), 149-155 (2019).
  13. Vakkila, J., Lotze, M. T. Inflammation and necrosis promote tumour growth. Nat Rev Immunol. 4 (8), 641-648 (2004).
  14. Zepecki, J. P., et al. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38 (10), 1734-1750 (2019).
  15. Kim, R. K., et al. Role of lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK) in the expansion of glioma-initiating cells by fractionated radiation. Biochem Biophys Res Commun. 402 (4), 631-636 (2010).
  16. Hu, Y., et al. Requirement of Src kinases Lyn, Hck and Fgr for BCR-ABL1-induced B-lymphoblastic leukemia but not chronic myeloid leukemia. Nat Genet. 36 (5), 453-461 (2004).
  17. Sharp, N. A., Luscombe, M. J., Clemens, M. J. Regulation of c-fgr proto-oncogene expression in Burkitt's lymphoma cells: effect of interferon treatment and relationship to EBV status and c-myc mRNA levels. Oncogene. 4 (8), 1043-1046 (1989).
  18. Hui, A. B., Lo, K. W., Yin, X. L., Poon, W. S., Ng, H. K. Detection of multiple gene amplifications in glioblastoma multiforme using array-based comparative genomic hybridization. Lab Invest. 81 (5), 717-723 (2001).
  19. Fang, Z. Y., et al. Proteomic identification and functional characterization of a novel ARF6 GTPase-activating protein, ACAP4. Mol Cell Proteomics. 5 (8), 1437-1449 (2006).
  20. Okabe, H., et al. Isolation of development and differentiation enhancing factor-like 1 (DDEFL1) as a drug target for hepatocellular carcinomas. Int J Oncol. 24 (1), 43-48 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved